1、植物细胞培养生产次生代谢产物的研究进展1植物细胞培养生产次生代谢产物的研究进展作者：刘应祥 单位：甘肃农业大学生命科学技术学院2011生物制品邮编 730070摘要： 近年来, 植物的次生代谢物的结构、功能与应用越来越受人们的关注。为了既能满足人们对植物次生代谢物的需求, 又能合理开发利用自然植物资源和保护生态环境, 植物细胞培养成为生产植物次生代谢物的关键技术。本文重点阐述了 7 种植物细胞培养技术和植物细胞培养生产植物次生代谢物过程中的重要影响因素及其调控, 同时对前述两个方面的深入研究提出了合理化建议。关键词: 植物次生代谢物; 细胞培养技术; 调控Research Progress o
2、f Cell Culture for Plant Secondary MetabolitesYingXiang-liuAbstract: In recent years, the structure, function and applications of the plant secondary metabolites are paid more and moreattention by the people. For the sake of satisfying the need of the people for the plant secondary metabolites of an
3、d making use of thenatural plant resources reasonably and protecting ecosystem environments, the plant cell culture becomes key technique for producingthe plant secondary metabolites. Seven kinds of plant cell culture techniques, the important influence factor and its adjustment in theprocess of pro
4、ducing the plant secondary metabolites by plant cell culture, are elaborated in this paper, putting forward somerationalization suggestions for going deep into researches at the same time.Key words: plant secondary metabolites; cell culture technique; adjustment植物细胞培养始于本世纪初，并不可争议地具有工业化潜力。目前植物细胞培养生产的
5、化合物很多，包括糖类、酚类、脂类、蛋白质、核酸以及帖类和生物碱等初生和次生代谢产物，植物细胞培养的应用主要包括以下3个方面：有用物质（次生代谢产物）的生产；植物无性系的快速繁殖和遗传突变体的筛选；植物细胞遗传、生理、生化和病毒方面的深入研究。但是由于植物细胞大规模培养技术的局限性使得植物细胞仍难以实现大规模工业化生产，迫切需要进一步研究和发展细胞培养条件的优化控制及其工艺。一 植物细胞培养技术生产次生代谢产物的研究历史及现状植物和微生物能够合成大量次生代谢产物 (secondary metabolites) , 又称天然产物。这些小分 子有机物在植物类群中特异性分布, 往往不是细胞 正常生命活
6、动所必需的。据估计,植物次生代谢产物在10 万种以上, 包括萜类、酚类( 黄酮类、花色 苷) 、生物碱、多炔等, 它们都是由初生代谢途径衍生而来的。 次生代谢是在植物长期演化过程中产生的,与植物对环境的适应密切相关, 并非可有可无。从功能上看, 许多物种的生存已离不开这些天然产物。例如虫媒植物的生长并不需要昆虫, 但离开了昆虫 授粉则无法完成世代交替。而吸引昆虫的往往就是这些次生代谢产物) ) ) 具有气味的挥发性物质或表现出颜色的花色苷类或胡萝卜素类。由此可见, 植物天然产物在功能上并不总是处于次要地位。越来越多的工作显示, 次生代谢与植物的抗性与品质紧密相关, 植物对病害和虫害的抗性在很大
7、程度上取决于细胞内植保素的合成调控。植物次生代谢的概念是在1891年南KOSSZEL首先明确提出的1。植物细胞培养技术源于德国著名植物学家HABERLANDT(1902)提出的细胞全能性学说。植物细胞具备生物合成的全能性，即每个培养细胞保留着完整的遗传信息，能生产所有母体植物中合成的化学物质。1 植物细胞培养技术特点与其它的方法相比，应用植物细胞培养技术生产次生代谢产物爨有以下优(1)能够保证产物在一个限定的生产系统中连续、均匀生产，不受病虫害、地理和季节等各种环境因素的影响。(2)可以在生物反应器中进行大规模培养，并通过控制环境条件得到超过整株植物产量的代谢产物。(3)所获得的产物可从培养体
8、系内直接提取，并快速、高效的回收与利用，简化了分离与纯化的步骤。(4)有利于细胞筛选、生物转化，合成新的有效成分2。(5)有利于研究植物的代谢途径，还可以利用某些基因工程手段探索与创造薪的合成路线，得到价值更高的产品。(6)节省大量用于种植原料的农田，以便进行粮食作物的生产。2 植物细胞培养技术研究历史与现状植物次生代谢产物利用可追溯到远古时代, 迄今为止这些天然产物仍在人类的生活中占有重要的位置。但从天然或栽培植物中提取植物次生代谢产物受到以下因素制约: 野生资源的盲目采集, 易造成许多野生植物趋于濒危和生态环境的破坏; 生态环境的差异, 产生的引种和驯化很困难; 可耕地面积日益减少; 栽培
9、过程的自然环境影响, 使产量和质量难以控制。而化学合成方法由于工艺复杂, 费用高, 易造成新的环境污染, 其发展也不受欢迎。自从 Routine和 Nickel(1956)首次提出用植物细胞培养技术生产有用次级代谢产物以来, 据不完全统计应用于植物细胞培养技术生产次生代谢产物的植物已达百种以上, 近半数的次生代谢产物含量超过原植株。目前植物次生代谢产物的生产在药物如紫杉醇、长春碱等; 油料如豆寇油、春黄菊油等; 食品添加剂如生姜、香子兰等; 调味剂如胡椒、留兰香等; 饮料如咖啡、可可等; 树胶如阿拉伯胶等。由于植物细胞培养生产有用代谢产物可(1)在完全人工控制的条件下一年四季不断进行生产, 不
10、受地区和季节限制, 节约土地, 较便于工业化生产; (2) 通过改变培养条件和选择优良系的方法得到超越原植物产量的代谢物, 例如通过新疆紫草的细胞培养获得了比原植株含量高 6 倍的紫草素; (3)在无菌条件下完成的,能排除病菌及虫害对药用植物的侵扰; (4) 对有效成分的合成路线进行遗传操作, 以提高所需的次生代谢产物含量, 也可以进行特定的生物转化反应, 大规模生产我们所需的有效次生代谢产物; (5) 作为解决资源问题的较为有效的途径而成为当代生物技术的重要发展领域, 吸引了众多国家实验室和研究人员, 也取得了可喜的进展, 但真正实现植物次生物大规模生产仍有许多问题有待解决, 本文就植物细胞
11、培养技术中的若干重要问题进行探讨, 以期推动我国植物细胞培养技术的发展和满足人们对植物次生代谢物的日益增长的需求1956年ROUTIOR秘NIKZELL首次提出应用植物细胞培养技术商业化生产植物化合物的设想，1967年KAUL和STABA采用多并发酵罐对Ammivisnaga进行了细胞大量培养的研究，并首次用此方法得到了药用成分呋哺色酮，使这一设想变为现实3。但是，由于植物细胞培养体系中细胞生长缓慢，目标代谢产物极低(通常不到细胞于重的1)4等特点，再加上植物细胞所特有的生理生化特性还没被人们所认识，人们单纯的模拟培养微生物的条件来培养植物细胞及当时有效成分的分析手段落后等原因，人们并没有看到
12、该技术在生产天然产物方面的潜能。20世纪70年代以后，该技术有所发展，利用植物细胞工程技术生产一些药用有效成分在工业上获得成功，据20世纪80年代末期的统计，当时全世界有40多种植物的细胞培养工程研究获得成功，部分悬浮细胞培养体系中次生物质的产量达到或超过整体植株的产量，有些药用植物的研究达到中试水平，其中利用紫草悬浮细胞培养生产紫草宁的成功令人瞩目。1984年日本的Mitsui公司利用紫草生产紫草宁规模达到750 L，产物最终浓度达到1400 mgL。20世纪90年代至今，利用植物细胞进行天然产物的生产进入了一个崭新的发展阶段，它与基因工程、快速繁殖形成新世纪生物技术领域的三大主流6。迄今为
13、止，全世界已经有1 000多种植物进行过细胞培养的研究。利用植物细胞培养技术生产的次生代谢产物被人类广泛应用，一些天然成分如紫杉醇、紫草宁、迷迭香酸和人参皂甙等已进入工业化生产阶段。同时探索出了悬浮培养、两相培养、固定化培养、毛状根培养、冠瘿培养、反义技术等先进的培养方法。据1996年报道，国际上通过植物细胞和组织培养的方法进行食品成分商业纯生产最成功者是日本。下面列出几个利用植物培养技术工业化生产有用代谢物的例子，如紫杉醇的生产，自从1991年CHRISTEN等人申请有关红豆杉组织培养的专利以来，在培养体系紫杉醇含量已提高100多倍，达到153 mgL，美国的Phytoncatalytic公
14、司已在德国进行了75 t发酵罐的试验；其他如日本三井石油公司生产紫草宁和小檗碱(750 L)、日本日东电工公司生产人参皂甙和花色素(500L)、西德ANattermann&GieGmbH公司生产迷迭香酸(75 000 L)、英国的辣椒素生产、美国的香子兰代谢物生产、加拿大的血根碱生产等7。植物细胞培养进行有效成分的生产发展到现在，已经取得令人瞩目的成就。然而在植物细胞培养过程中普遍存在的细胞系不稳定、细胞生长缓慢、不耐剪切力及代谢物产量低等问题又成为其实现规模化生产的瓶颈。在目前已经研究过的植物中，仅有15左右种类的培养物中目的产物的含量接近或超过原植物，多数情况下培养合成某些次生代谢物的能力
15、下降甚至消失8。因此充分利用基因工程的手段，筛选高产细胞系，深入研究特定代谢产物的生物合成途径，对培养条件进行优化，研究和开发适合植物细胞培养的生物反应器是解决这些问题的根本途径。二 植物细胞培养获取次生代谢产物技术1 固定化培养技术 自 1979 年 Brodelius 等人利用固定化培养技术用于生产植物次生代谢物以来, 已有 10 多种植物细胞应用成功。由于固定化培养与悬浮培养相比, 具有: (1)可极大限度地减少剪切力的损伤作用, 便于连续培养和延长植物细胞寿命以及提高培养细胞的利用率; (2)固定化培养的植物细胞生长相对缓慢, 有利于植物次生代谢物的积累; (3)固定化培养的植物细胞的
16、培养密度高, 可提高产植物次生代谢物的产量; (4)固定化培养生产的植物次生代谢物直接分泌到培养液中, 可简化分离步骤提高工作效率等方面的优点而应用于植物次生代谢物的生产。此项技术的改进与完善主要有(1)包埋物的多样化: 已由原来单一的海藻酸拓展为海藻酸、琼脂糖、琼脂、角叉菜聚糖, 且取得良好的效果, 如固定化的长春花细胞生产阿玛碱的产量分别达到游离细胞的 176%、114%、95%和 84%。(2)固定方法上已采用吸附固定、共价结合固定、网格及泡沫固定、膜固定( 包括中空纤维) 植物细胞的方法。由于植物次生代谢物的释放并非都以分泌的方式而使该项技术的应用受到一定限制, 同时固定化的植物细胞氧
17、、养分的供应与传递以及细胞的遗传稳定性等问题有待于进一步研究解决。2 两相培养技术 在培养体系中加入水溶性或脂溶性有机物或者具有吸附作用的多聚物使培养体系分为上下两相, 细胞或组织在水相中生长和合成次生代谢物质, 次生代谢物质分泌出后再转移到有机相中, 然后再从有机相分离植物次生代谢物的技术, 称为两相培养技术。迄今为止, 已有 18 种植物细胞应用此项技术获得成功。例如在紫草悬浮系培养中在合适时间添加十六烷提取紫草素, 可使产量提高七倍多; 长春花细胞培养中加入 XAD- 7 大孔吸附树脂, 可使吲哚生物碱含量明显提高; 孔雀草发根培养中添加十六烷, 可使噻吩的分泌量由原来的 l%提高至 3
18、0%- 70%9。虽然两相培养技术可利用有机相及时分离植物细胞或组织产生的次生代谢物, 减少了次生代谢产物的反馈抑制, 同时也提高了次生代谢产物含量, 而且有机相可以循环使用, 基本实现了植物组织的连续培养, 但建立和利用两相培养技术的关键是: (1) 添加的有机相或多聚物对植物组织、细胞无害, 不影响其生长和次生代谢产物合成; (2)次生代谢产物能被有机相溶解或为多聚物吸附; (3) 有机物或多聚物不吸收培养基中有效成分;(4) 两相易分离等方面的条件和问题。因此, 在利用两相培养技术进行规模化生产之前, 应对前述若干问题进行详细研究。3 反义技术 根据碱基互补原理, 人工合成或生物体合成特
19、定互补 DNA 或 RNA 片段, 抑制或封闭某些基因表达的技术, 通过此技术, 可以将反义 DNA 或 RNA 片段导入植物细胞, 使催化某一分支代谢的关键酶活性受抑制或加强, 从而提高目的物的含量, 同时抑制其他化合物合成。通过反义技术调节亚麻属的一种植物(Lomims favum)发根中内植醇脱氢酶的活性, 可以抑制分支代谢中木质素分子的合成而使抗癌物 5- 甲氧基鬼臼毒素的含量提高10。反义技术是近年发展起来的, 许多问题有待于解决, 问题的关键在于对次生代谢途径及关键酶的了解和反义片段如何有效地起作用两方面。4 冠瘿培养技术利用根癌农杆菌 Ti 质粒的 T- DNA 片段( 含有诱导
20、冠瘿组织发生的 tms 基因和 tmr 基因) , 通过根癌农杆菌感染植物可以将 tmr 基因整合进入植物细胞的基因组, 诱导植物细胞冠瘿组织的发生。本项技术的突出特点: 冠瘿组织离体培养时, 具有激素自主性、增殖速率较常规细胞培养快; 次生代谢物合成稳定性与能力较强。利用此项技术诱导的丹参冠瘿组织, 培养生产丹参酮, 已筛选出高产株系,丹参酮的含量已超过生药的含量11。表明冠瘿培养技术用来生产有用次生代谢产物有着良好的开发前景。5 毛状根培养技术毛状根是双子叶植物受发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染后产生的。感染过程中, 发根土壤杆菌的 Ri 质粒 T- D
21、NA 转移并整合到植物基因组中诱导出毛状根, 从而建立培养系统12。在不添加外源激素的条件下, 其不仅生长迅速, 分支多, 而且毛状根具有器官化的特征, 遗传性、生理生化特征稳定, 与悬浮细胞培养相比, 具有更强的次生代谢物合成能力。此外, 毛状根能产生某些植物的愈伤组织不能合成的有效成分; 毛状根具有生物转化功能, 从而可以产生许多新的化合物; 毛状根具有很强的繁殖能力, 可以制成人工种子长期保存。有些植物的毛状根还具有向培养基中释放代谢物的特性。利用此技术诱导人参愈伤组织发根, 在无外源激素的条件下, 其生长速度为用激素诱导根的 2 倍, 人参皂甙的含量达干重的 0.95%, 高于再生根(
22、0.91%)和天然栽培根(0.4%)13。据报道, 诱导植物产生毛状根的种类已达几十种以上, 且次生代谢产物生产水平达到相当于或高于原植株的水平。由于毛状根培养技术是将外源基因导入植物细胞中, 从基因水平上对某些酶和特定次生代谢过程进行调控, 可使植物细胞培养和次生物质积累进入一个新的水平。因此被公认为是生产植物次生代谢物的一条新途径。6 添加诱导子或引导物技术 诱导子是一种能引起植物过敏反应的物质, 当它在与植物的相互作用时, 能快速、高度专一和选择性地诱导植物特定基因的表达, 进而活化特定次生代谢途径, 积累特定地目的次生代谢物, 从而提高植物次生代谢产物的产量6。目前用于提高植物次生代谢
23、产物的诱导子还包括真菌诱导子、寡糖素、茉莉酸类、金属离子和紫外光等。张长平等14、李家儒等15在红豆杉(Taxus chinensis)细胞悬浮培养体系中加入真菌诱导子, 紫杉醇的合成被加强, 产量得到了显著提高; 甘烦远等16在研究红花细胞悬浮培养过程中, 发现同时加入寡糖可提高红花细胞生长速率及 - 生育酚产率; 宾金华等17利用茉莉酸甲酯处理烟草幼苗可以明显提高幼苗木质素和 HRGP 含量。以红豆杉、南方红豆杉(Taxus chinensis var meirei)悬浮细胞为材料, 加入茉莉酸甲酯, 二氢丙烷基茉莉酮酸酯 (2,3- dihydroxypropyl jasmonate,D
24、HPJA), 紫杉醇含量提高了 5- 1O 倍18-19; 金属离子作为诱导子主要有 Cu2+、Ca2+、Mg2+等, 李家儒等20发现用 Cu2+处理红豆杉培养细胞能显著促进紫杉醇含量的提高; 紫外光通常也能刺激许多培养物形成某些次生代谢物, 如胡萝卜素、类黄酮、多酚和质体醌形成等。在应用生产中, 有效诱导子的筛选应注意次生代谢产物合成的途径及关键酶的结构和特性; 诱导子与次生代谢物之间结构与功能的关系两个问题。另外, 在诱导子的纯化和结构分析方面也有待进一步研究。7 植物细胞悬浮培养生物反应器技术 生物反应器技术具有很多优点: 工作体积大、单位体积生产能力高、物理和化学条件控制方便等。目前
25、, 国内外用于植物细胞培养的反应器主要有搅拌式、鼓泡式、气升式和振动混合式。对于植物悬浮细胞培养的生物反应器选择要符合以下的要求: 合适的氧传递; 良好的流动特性; 低的剪切力。气升式反应器结构简单、剪切力小、传质效果好等优点, 然而通入气体会导致泡沫产生, 严重影响植物细胞的生长, 而且泡沫会夹带一些有用的挥发性物质, 如 CO2等, 可加入消泡剂和对反应器内构件进行改造来克服, 可用于植物悬浮细胞培养。用气升式反应器培养植物细胞, 在细胞浓度 20%以下时可获得较好的效果。日本专卖公司用 21 升的搅拌反应器进行烟草细胞的连续培养,生长速率达 5.82kg/m3/d; 日本三井石油株式会社
26、 750 升植物细胞反应器生产紫草宁, 可满足日本需求的 43%。欧阳平凯等人采用内环流气升式发酵罐培养西洋参和紫草细胞, 西洋参培养 25d 后, 细胞浓度为 14g/L (干重), 总皂甙含量为4.45%; 紫草培养 10d 后, 细胞中紫草素含量为 10%- 14%21。植物悬浮细胞培养的生物反应器应用可大大降低劳动力需求, 而且反应器中通过物化条件调控达到最佳的生长和代谢, 不受时间和地点的限制, 随时随地进行规模化生产, 这对于植物组织与细胞培养工业化开辟了一个广阔的前景。三 影响植物细胞次生代谢物产生的因素及其调控1 培养中植物细胞特性对次生代谢的影响在正常栽培的植物中, 花、果实
27、、成熟叶、成熟根都是次生代谢物积累的重要场所, 构成这些结构的细胞不会迅速分裂, 它们高度分化,产物通过循环周期而积累。遗传性状和生理状态等是影响细胞培养发生次生代谢的内在因素。20 世纪 90 年代以来, 科学工作者对许多植物种属进行了细胞分裂、生长与分化的研究, 发现由于基因型的不同, 形态建成能力差异很大。这种差异不仅表现在物种与物种之间, 在同一个种的不同品种之间, 纯种和杂种之间也明显。植物细胞大量培养的研究表明,次生代谢物的积累与培养细胞的分化程度之间存在正相关,愈伤组织的培养具有初步分化或部分分化的结构, 可以积累较多的产物, 但是, 它在形成连续生产方面却极为不利。而在生长迅速
28、、高度分散的细胞悬浮培养系统中, 细胞所处的环境既无极性也无梯度, 虽然可以获得迅速增长的生物量,但只有在细胞生长的相对静止期才能积累较多产物, 如甜菜产生的新疆圆柏毒素(podophyllotoxin), 在培养的滞后期物质发生积累22。这说明,慢速生长、分化或部分分化的组织或组织团块,才能积累较多的次生产物23。在苦茄(Solanum dulcamara)细胞悬浮培养中, 直径为 5mm 或更大的青色细胞团, 其类固甾碱含量为小细胞团的 4 倍24; 而三尖杉(Cepalotaxus)目的次生代谢物只在固体培养的愈伤组织中存在, 一旦转入液体进行单细胞悬浮培养, 目的次生代谢产物就消失或含
29、量极低。因此,植物细胞的培养特点是生长缓慢, 合成次生代谢产物的能力低且不稳定。有必要深入研究以愈伤组织颗粒为代表的细胞成团生长、细胞分化规律, 以便进一步提高次生代谢物的产量。2 植物细胞培养环境条件的影响 植物离体培养中, 影响植物脱分化和再分化的因子, 包括外因和内因两方面。外因即指植物细胞的营养条件和环境条件, 内因即指植物的遗传性和生理状态25。植物细胞次生代谢物产量的培养环境条件的影响因素及其调控是指培养条件的优化, 包括培养基组分和培养条件(温度、光照、通气等)的优化。2.1 培养基组分 培养基中的各组分对植物组织生长和次生代谢物生产具有重要的作用。(1)碳源: 蔗糖常用作为碳源
30、, 一般认为它被植物组织细胞壁内的蔗糖酶分解为葡萄糖和果糖后再被细胞吸收利用,而且对于维持培养基的渗透压也具有重要作用。对于通常使用的单糖则需要一定的浓度, 增加其浓度会减慢生长并提高产率, 但浓度过高, 则会导致生物合成能力的丧失。(2)氮源: 氮源的类型对次生代谢物的产率有很大影响,如在雷公藤培养中, 增加 K、N、P 浓度有利于细胞内雷公藤内酯的积累。在天仙子毛状根培养中, 增加 150mmolKNP,不仅细胞生长快, 而且生物碱产量明显增加。然而任何 NH4+的增加对紫草宁衍生物的合成产生明显的抑制作用。(3)有机物质: 培养基中添加特定的有机物质如二甲基亚砜(DMSO)、吐温- 20
31、、双氧苯咪唑和氯化氯胆碱等, 可调节次生代谢途径与方向或促进次生代谢物的释放。二甲亚砜是一种高度甲基化的有机溶剂, 它可改变细胞壁 /膜的渗透性。实验表明, 经体积分数为 0.01 的二甲亚砜长期处理的三七细胞生长良好, 且皂甙分泌量增加, 培养基中可达 130mg/L , 约占皂甙总量的 10%24。在青嵩素合成过程中加入固醇生物合成抑制剂双氧苯咪唑和氯化氯胆碱处理, 可使代谢向合成青嵩素的方向移动, 青嵩素合成量明显提高26。但由于次生代谢及其产物的不同, 添加的有机物质需经深入研究予以确定。(4)外源植物激素或植物生长调节剂: 外源植物激素或植物生长调节剂的添加对于植物组织生长、分化及次
32、级代谢产物的调控具有重要作用。通过添加不同种类和浓度外源激素来调控生长、分化和代谢取得了一定规律性认识。一般情况是, 低浓度的生长素有利于次生代谢和次生代谢产物的积累, 而 2,4- D 则会抑制次生代谢物的产生, 如长春碱、天仙子、颠茄、罂粟等细胞培养物在有 2,4- D 存在时不产生生物碱, 并且完全抑制蒽醌的生成; NAA 也会抑制紫草愈伤组织中紫草宁的产生, 这主要是因为较高浓度的生长素会抑制次生代谢途径中一些重要酶的活性, 从而使产物的合成受阻。赤霉素很少用于培养基, 但其对于某些萜类的产生是必要的, 如青蒿毛状根培养基添加适量的赤霉素可明显地促进毛状根生长和青蒿素的产生; 细胞激动素的作用不很明确, 但秋水仙碱在未分化的培养物中可导致多倍体生成, 细胞体积增大, 使香叶天竺葵细胞中单萜的产量明显提高; 乙烯在欧亚唐松草的培养中通过调节 4- 氢小檗碱的加氢酶的活性来促进小檗碱的积累而且作用明显。张俊莲等在研究不同培养条件下栀子愈伤组织生长和栀子黄色素的产生时发现, B5、MG- 5 基本培养基有利于愈伤组织生长, M- 9 基本培养基有利于黄色素的生物合成, 在培养基中添加 01.5 mg/L IAA 和00.25 mg/L KT 对愈伤组织生长和
