1、要准备多少瓶果蝇才能获得并确定这个重组染色体？答案是这取决于两个突变间相距有多远。离得越远你越可能得到你想要的产物。本例中odd-skipped和even-skipped相距约50个作图单位，等于说是没有连锁。所以你可能在10 瓶杂交果蝇中发现你想要的，但应准备至少20份。对于相距更近的位点，你应当相应的多做一些以确保你能得到你的那个重组。其期望值是图距的一个简单函数：若为5个作图单位远，重组可能为5%。你应当可在100个系中发现它们，但我建议你最好做200 个。如前所述，交换频率是对温度敏感的，高温和低温都能促进他升高。故邻近位点的重组可以通过在30C下培养双杂合雌蝇而得到促进。注意是高温下
2、培养，而不单是成虫在高温下进行杂交，因为温度的这一效应并不在成虫期有效。从另一方面来说，如果果蝇在整个生命周期中都是30C培养，其产卵率要降低2折。故最好是在大部分的幼虫期将瓶子移至30C下也就是在你发现食物开始被翻动时开始到你发现瓶壁上开始结蛹止。高温效应在着丝粒附近和染色体臂两端最为显著。另一个增加重组频率的因素是存在另一个染色体的杂合倒置。这种染色体间效应增加了重排区域以外的基因重组频率。有时可以用一些可见的标记来帮助辨认不可视的隐性突变间的重组，这很容易办到。例如，你已经对突变进行了减数分裂作图，故你已经有携有各种标记和你的突变基因的染色体，随后的杂交就很容易进行了。两条染色体的操作要
3、同时控制两种不同的染色体的基因型，有必要事先安排好杂交方案。这里我们将要利用平衡子、显性标记、雄性无重组和雌性同源染色体可靠分离等性质。作为例子，我们将考虑如何获得第三染色体上的ftz和第二染色体上的 eve双突变胚胎。大多数突变携带果蝇是既有突变基因又有其对应的平衡染色体，例如TM3;Ser/ftz。这是最好的保存方法，因为其它染色体上的显性标记和平衡子只是影响果蝇的成活率而已。要同时操作两种染色体，就有必要引入其它一些平衡子和显性标记，为的是能清楚的确定初始染色体的去向。因此手头上有些本身就带有平衡子或标记的果蝇是很有好处的，例如可是由于多平衡子的共存会影响雌蝇的正常减数分裂，故这种基因型
4、的果蝇如能用雄蝇就应尽可能用雄蝇。其技巧性便在于用初始的突变品系与另一个有不同标记的品系进行杂交，如此，你就能发现携带突变的染色体与其携带标记的同源染色体发生了分离。收集其雄蝇和处女蝇，这些果蝇将形成一个平衡致死品系。尽管不是很健康。后代中1/16的果蝇是ftz和eve双纯和的。如果eve突变抑制了ftz突变的致死性，即使只有1%的比例，它仍可以毫不含糊的根据标记检查出来。独特的标记可以使得每一步的每种基因型都能被辨认出来。 可是如果你想要的是双突变的胚胎，这些成虫标记将变得毫无用处，你想要的结果可以很简单的由两个初始品系交配得到，而且存活率要好，如下图：这个简单方法的不足之处在于双突变体的表
5、型跟单突变体的无法区分。为了解决这一问题，可以用带有表达lacZ的P因子的平衡染色体，于是当后代从由 In（2LR）O,Cy PlacZ/eve; TM6,Ubx PlacZ/ftz构成的品系中被挑出时，它们是可以根据被-半乳糖苷酶染色的情况来区分的只有那些被染上的是双突变。一旦你要计算存活率时，或是要检测少量有某一特定基因型的个体时，或是发现某已知表型的单个后代个体时，标记的作用就明显了。另一个被利用操作第2 和第3 染色体的工具是T（2 ;3）CyO ; TM9，它是In（2LR）O,Cy）和TM9之间的一个相互易位。作为两条平衡染色体间的相互易位产物，它在受精卵中所有的易位片段必须都同时
6、存在以保证可成活否则配子便是异倍体会死亡。由于它包含了两条染色体的全部序列，它可以有效的平衡第2和第3染色体，保存的品系应当是这个样子 ：当得到P因子转化子后想看某一基因克隆是否挽回了某种突变表型时，操作两条染色体就是完全必要的了。然后，你可以用P因子中可见标记作为显性标记，当然这要求杂交中的所有果蝇的X染色体上white基因是突变的。 例如，你得到了一个在第3 染色体上有Pw+,odd+ 插入的转化品系，你想要构建一个第2染色体上odd突变纯和而第3染色体上又有这个P因子的果蝇品系，则若初始果蝇均为w纯和的突变就会带来不少便利。通常对于P因子携带果蝇，它很可能已经携带了w突变了。杂交的第一行
7、是两种交配同时分别进行的缩写，用同种基因型的雄蝇。最后一行表示你得到了雄雌两种蝇，它们检验了P因子挽回的效果。如果odd/odd ; Pw+,odd+ /+ 的果蝇可以存活，则插入可以挽回此突变。 多少只果蝇由于使用了多个标记和平衡子而带来的存活率问题前面已有所提及。一般说来这些东西越多，果蝇就越虚弱。果蝇越虚弱，你开始实验时需预备的果蝇就该越多。否则你将会发现在你做了三个月的多代杂交后，你只剩下一只基因型对头的雄蝇，而它还是不育的。其实你只要算一算每次杂交后所想要的果蝇在果蝇总数的比例，你就知道要得到那么几只果蝇有多困难。一般从理论上讲这个比例为1/8或1/6，而标记基因和多平衡子造成的非同
8、源染色体分离又使存活率进一步下降。跟克隆不同，中间产物不能在每步都进行扩增，所以你在开始时必须用足够多的果蝇以保证你能完成整个方案。一个好办法是预先定个目标：在最后一代中至少要一满瓶果蝇进行杂交。考虑到存活率问题，一瓶杂交果蝇大约要40-50只处女蝇。如此反推回去，双染色体操做的杂交方案的第一步应该是准备数瓶，每瓶100-150只处女蝇。哪种性别在每一步该挑选哪种性别的果蝇受几种因素的影响。一个是已经提到过的雄蝇无交换，这使得显性标记染色体在雄蝇中可当做平衡染色体来用。另一个因素是雌蝇中多平衡子带来的麻烦，此时雄蝇是唯一的选择第三个因素是非处女蝇问题，尽管你尽了全力仍不能保证有几个非处女蝇成为
9、漏网之鱼，这么几只老雌蝇足以把整个杂交搞砸，因为不同的基因型有同样的标记从而搞混。若仔细对每一步杂交加以研究，就可以清楚的发现某些情况下老雌蝇的出现没什么影响，因为你想得到的基因型的是被独特的标记上的，无论其母是否进行了其它的交配。但这不足以成为你在每次交配中挑选处女蝇的借口，你该想想你想要的果蝇在同代果蝇占多么小的比例。这只不过是为了使整个杂交能顺利完成所做的一个考虑罢了。举例如下想知道你是否在冒险吗？考虑一下你想要寻找的那个标记（Cy , Ubx），看看有无可能从一个非处女蝇得到它。为此你必须考虑产生这个处女蝇的上一步杂交，这步杂交有哪个混蛋雄蝇又跟它们在一起。是否是In（2LR）O,Cy
10、/+ ; TM3 ,ser/ftz处女蝇和有TM6,Ubx 的雄蝇交配，故而你能在非处女蝇后代中得到带有Cy和Ubx的果蝇呢？此时上一步杂交是很明显，处女蝇可能已经与TM6,Ubx雄蝇交配，故产生有同样标记的而基因型不同的有误导性的后代。所以你是在冒险，在挑选处女蝇问题上你该格外小心才是。三条染色体的操作正如杂耍中玩四个球比玩三个球难得多，同时操作处理三种染色体比两条要难的多，所幸的是三染色体操作很少用到，同时操作四条染色体就更没有听说过。虽然原理都一样，问题却多得多。要得到那种很独特的容易区分的基因型更难了，而你最终得到仅一只不育的雄蝇的可能性却大大增加了。 如果你不需要这种深奥的技术，或是
11、你对这种东西没有任何兴趣，你可以将本节跳过。这种繁杂的杂交在某些嵌和体实验中有用，为了造成雌雄两性嵌和体，而合成了这些果蝇品系。而且这些果蝇利用X染色体的重复来覆盖常染色体的隐性突变。因此，当X染色体嵌和被诱导形成，这个嵌和体对于那个常染色体位点也是嵌和的。Kankel和Hall在神经系统的命运决定图研究中运用了这种系统，它是以Acph酶作为标记的。它们想要得到的果蝇是：X-Acph+/XXy2/Y表示此品系中雄蝇有X-Acph+/Y而雌蝇有XXy2/Y。Acphn 是已经是嵌和态的突变，它是碱性磷酸酶的突变，可作为发育谱系分析的组化标记。X-Acph+是携带有Acph重复的X染色体, pal
12、是造成嵌和的突变父性缺失。要得到嵌和体，此种品系中的雄蝇与y；Acphn雌蝇进行杂交。为了后人都能学着一点，Hall 的杂交方法在下面作图表示出来了。它又长又难懂，权且把它当成一个挑战，当作对你果蝇遗传知识的一个考验。如果你还是搞不明白，别灰心这种杂交根本就没什么人用的，大家也没有几个搞得懂的。诱导缺失要想诱导缺失，最好的方法是打电话或email给Bloomington的果蝇贮藏中心，让它们寄给你。这种方法要是不可行也没关系，用辐射或化学试剂诱导缺失跟诱导突变没什么不同，你可以用补偿测试来检查那些被处理过的果蝇。如果你从野生型染色体开始，想获得包含一个容易观察和记录的标记基因的缺失，只须先诱导
13、处理正常雄蝇，然后与标记基因纯和的雌蝇交配，检查有标记表型的后代即可。下面再以第二章的例子为例，即所谓的F1代筛选。这里这么做的道理在于一个缺失通常是跨好几个位点的，发生频率不是很高，基本上是纯和致死的。故而你费些心思就可以从F2代挑选出那条染色体。可能挑选10000或更多的诱变染色体。这里有个制约因素即只适用于可见标记，但由于缺失是很难得到的，因此找一个方法来利用可见标记是很值得的。在你想要的缺失区中或附近的显性突变也可以同样使用。此时你筛选那些没有显性突变表型的果蝇就行了，这也可以用F1筛选来做。（注意有些显性突变，比如由于单倍不足造成的Ubx和Minutes是不行的。显性突变应当是那些功
14、能获得突变 、超效等位、新效等位和反效等位基因等突变类型）。注意Pw+ 处女在w突变果蝇中是显性的。由于这些插入的分布很广，现在可以在任意一个地方反转这个显性性状。诱变剂中辐射是较为常见的缺失诱变剂，比化学诱变剂可靠，尽管4000r 剂量下发现缺失的可能性只有1-5/10000。大约有一半的x-ray诱导缺失是多位点缺失，大片段比小片段少。象在其它的诱导中那样，成熟的精子是对诱导最敏感的。EMS一般认为是点突变的诱发剂，但也可以产生小的缺失，通常这种缺失是基因内缺失，故EMS突变是诱导无效等位突变的好方法。P因子切除也是一个广泛应用的小片段缺失诱导方法。不准确切除所造成的切除一般很小，常是基因
15、内的，但有时也能产生稍大的缺失。这种缺失事件的发生频率就如同P因子转座一样不可预知，而且很大程度上依赖于插入位点。切除方案是以P因子中的w+ 为标记来制定的，跟先前所讲的P因子插入诱导的道理差不多。对一个第三染色体上的致死插入方案如下：获得这种P因子切除的频率依赖于P因子序列和插入位点。精确切除对不精确切除的比率是不确定的，但似乎是利于不精确切除的。对于那些不精确切除，更多的是在P因子内进行，留下一小段 P因子，而不是造成缺失。故诱导缺失的成功率是在10%的可筛选染色体中有0.1%的可能是缺失，你自己去换算吧。如果P因子所在染色体不能与其同源染色体配对，而且把它当作修复模板，则不准确切除的频率
16、会增加。上述的筛选方法的一个优点在于它可以同时检验切除（w+丢失）和致死性。能否发现一个缺失取决于你要检查的是那个被覆盖基因位点。若是你想要的缺失包括了一个单倍致死位点，那你的麻烦就大了。如果是缺失包括其它一些单倍缺陷位点，比如不育等，那也是一样。即便是只有一个位点被缺失，如果它是单倍剂量异常的，比如Minute你也将会很麻烦。按照最好从已有重排获得新的重排的原理，T（Y ; A）可以作为获得缺失的一个很好的出发点。通过杂交两个断点不同的T（Y ; A）可以获得缺失这两种果蝇看起来都有y+和Bs标记。携带缺失的后代将有双份y+和Bs。可以收集这种y+和B+的雄蝇和处女蝇并有之建立一个品系。可是
17、由于其后代中会有很多异倍体，所以这个品系不易繁衍扩大。由于通常所需要的是为筛选新突变而用的缺失，或者有时是需要大量的果蝇时，这种存活率会带来麻烦。事实上完全可以用辐射处理把这种果蝇中的常染色体片段重新连在一起。这种事件的成功率可比从新开始诱导缺失高得多，因此Y染色体臂是个很大的目标而且此时诱导的试剂上是交换。由于放射处理时需要T（Y ; A）的两个常染色体片段同时存在，故一般都用雌蝇，为了不损伤卵母细胞，剂量降为1500 r。 用一个基于恢复可育性的筛选方案有时会使这种重连接现象更容易发现，因为未发生重连接的果蝇是不育的。重连接果蝇只须根据y+的丢失来筛选即可。因此你只须首先收集这些不健康的合
18、成缺失果蝇的雌蝇，放射处理之，交配之，然后检查子代的y+就成。由于这种果蝇始终是被平衡的，故其子代也是生来就已平衡好了的。然后检验证实它确实是重连接了的，只须将它们与其亲代T（Y ; A）果蝇之一杂交，看看有没有异倍体即y+和B+分离与否即可。4.5.3 从P因子合成缺失 P因子的应用使缺失诱导达到了一个新的理论水平。由于它们的染色体位置十分清楚，因而重排的目的产物也十分清楚。简单的一次杂交即可使之插入到一个新的位点。更重要的是有那么一个非随机的概率：转座现象一般在离原插入较近的一个区域发生。这就意味着如果有那么一个催化染色体在P因子插入位点发生断裂和重新连接的机制，则可以由此发明出一个通过不
19、等交换而合成缺失和重复的技术来。Golic设计了一种利用P因子进行染色体间重组的方法。他引入FRT（yeast flip recombinase target） 到P因子上，获得了一系列在不同位点有此序列插入的转化果蝇。然后他利用插入的P因子在被转座时一般都重新插入到附近区域这一原理，当两条同源染色体上的插入相邻近时，激活FRT重组酶，于是同源染色体间就可能发生不等重组，结果得到一个缺失和一个相应的重复。获得转座的几率与位置和初始插入序列的组成有关。所获得的转座率在G1代雄蝇为18/97到97/104。其中86%的情况是转移到染色体的邻近区域。当利用不同但又相互靠近的插入的杂合体，获得缺失和重
20、复的概率为0.7%。尽管不是很高但也不低了，而且重排区域是已知的，这是一个很大的优点。4.5.4 诱导重复 稳定的重复有时可在X射线诱导缺失时发生。缺失中切下的片段有时会插入到另一染色体上。当发生切除和发生插入的两条染色体分离开来时，重复和缺失就发生了。但在寻求某一特定的重复类型时这种方法不大常用。X染色体的游离重复是最容易诱导的。它们是一些小的X片段，保留有着丝粒和有y+位点染色体末端。这种技术基本上是用于切除X上的片段，从而得到一个自由分离的微型染色体，它可以在y突变的背景上由y+显示出来。有了这个标记那些有游离重复X的果蝇很容易挑出来，因为果蝇尤其是雌蝇对大片段 染色体的重复比较强些。其
21、基本思想如下 ：这里仅从许多可能产物中画了两种，一个y+重复和一个y+pn+重复。它们分别代表了子代中雌蝇的各种可能基因型。如果不是全X染色体重复，这些游离重复果蝇是可以存活的。通过与有多重标记的X染色体的雄蝇杂交，还可以分析此重复到底涵盖了哪些位点。可以设计一些基于重复可挽回单倍缺陷表型的筛选重复染色体的方案。除非有另一个正常基因位点存在，否则在此方案的所有的无平衡子子代中，将会出现一个已被平衡了的单倍缺陷基因位点。故对野生型果蝇的放射处理及随后的与已被平衡的单倍缺陷位点的杂交，将显示出有一个新的重复在既无平衡子又无单倍缺陷的子代中存在。4.5.5 从T（Y ; A）s合成稳定的重复对于重复
22、，重连接T（Y ; A）诱导稳定缺失的原理也可以照搬，但尚未有人试过。那些断点靠近染色体臂两端的T（Y ; A）可以用于将一个常染色体片段连到 X染色体上。这一技术有赖于连体X分离及T（Y ; A）的Y染色体的异质区部分和邻近连体X着丝粒异质区的交换，还要用点辐射来帮帮忙。异染色区间的同源性不高，重组率较低，但可以在放射处理时有所增加。大多数粘连的X染色体并不适合于这种处理，因为它们的中心异质区一般都全部或大部的发生缺失或重排。理由很明显： 连体X一般是跟游离的Y 染色体在一起而得到保存的，如果发生异染色体配对和交换则它们将分离开。适合于这种技术的特殊连体X将保持其中心的异质区，故而不适于正常
23、的品种的保存，例如C（1）RM,ypnV。在此技术中，你只须将T（Y ; A）和连体X果蝇杂交，放射处理雌蝇，然后使之与无标记雄蝇交配即可：结果是一个X 染色体与常染色体末端片段连在了一起。因为除非连体X解体，如果有断点雄蝇将不会出现连体X上的隐性标记，所以它还是比较好认的，也就是只需寻找有ypnV而没有Bs的雄蝇即可。存活果蝇的重复片段的大小取决于此重复来自哪条染色体臂。4.5.6合成复合X 合成连体X的一个新的方法便是用上述的方法使整个过程反转过来就行了。为什么要合成连体X呢？比方说你要用一个携带有一个温度敏感的致死突变的连体X，由此你可以使其后代中只有雄蝇而没有雌蝇。具体说就是用一条携带
24、有此突变的X与另一条带有Bs 标记的Y染色体粘连的X进行重组。单只雌蝇后代中Bs的有无容易看出，并可据此开始新的种系。两条臂杂合的连体X是不能长久的，因为复制后会发生交换，结果产生有不同标记的各种纯和连体X。这时你同样可以由单只雌蝇来开始一个新的品系并可检验它是否带有那个温度敏感的致死突变。4.5.7 Autosynaptic chromosome and Joys of Gibberioh果因遗传学更生僻的一个领域是从臂内倒位染色体来合成重复和缺失：自从Sturtevant和Beadle对倒置载体的经典和广泛的研究以来，倒置染色体的简单分裂行为就对染色体机制的狂热研究者们有特殊的吸引力。臂内的倒置可造成异倍体，因为其染色体会产生相互的重复和缺失产物：如果几个不同的臂内倒置同时出现，则有可能使两个倒置间不同的染色体部分发生顺序重复或缺失。这种情况下要发生一系列的交换事件，详见cramer和Asbumer。此技术的优点在于目的性强，不是随机的。但是合适的臂内倒置类型却不容易得到。当然也可以人工合成，但却不那么容易得到。
