1、高中生物第三章酶的应用技术实践第8课时固定化酶的制备和应用同步备课教学案苏教选修1第8课时固定化酶的制备和应用学习导航1.简述固定化酶的制作方法。2.简述固定化细胞技术的应用及酵母菌细胞的固定化技术。重难点击1.简述固定化酶的制作方法。2.简述酵母菌细胞的固定化技术。一、固定化酶和制备固定化酶的常用方法1.固定化酶(1)概念：固定化酶是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。(2)特点：在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复使用。2.制备固定化酶的常用方法(1)物理吸附法是将酶吸附在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔
2、玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式，其显著特点是工艺简便且条件温和。(2)化学结合法是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构。(3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中包埋成格子型，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中包埋成微胶囊型。由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本高、不利于大规模地使用。人们针对酶不能被广泛应用这一情况，一直在寻求改善方法，其中之一就是固定化酶技术的应用。观察下图有关制备固定化酶的常用方法，结合教材回答下列问题：(1)图A为物理吸附法，它的显著特点是工
3、艺简便且条件温和，在生产实践中应用广泛。(2)图B为化学结合法，它是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构。(3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中。将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中(如图C)，包埋成格子型；或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中(如图D)，包埋成微胶囊型。归纳提炼各种固定化酶方法的比较比较项目物理吸附法包埋法化学结合法制备易较难较难结合程度弱强强活力回收率高，但酶易流失高中等再生可能不可能不可能固定化成本低低中等底物专一性不变不变可变1.如图是酶的几种固定方式示意图，其所采用的固定方法依次是()A.物理吸附法、化学结
4、合法、包埋法B.化学结合法、物理吸附法、包埋法C.包埋法、物理吸附法、化学结合法D.包埋法、化学结合法、物理吸附法答案D解析图表示酶包埋在细微网格里，应属于包埋法；图表示许多酶分子通过特殊载体连接起来，成交联网架结构，应属于化学结合法；图表示将酶固定在一定的支持物上，属于物理吸附法。2.下列关于固定化酶和一般酶制剂在应用效果上的说法，错误的是()A.固定化酶可长久使用B.一般酶制剂应用后和产物混在一起，产物的纯度不高C.一般酶制剂参加反应后不能重复利用D.固定化酶可以反复利用，降低生产成本，提高产量和质量答案A解析固定化酶是将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与底物接触，又能与产物分离；同时，
5、固定在载体上的酶还可以被反复利用，降低成本，产物中也不含酶，提高了产品的纯度。固定化酶虽可以多次利用，但不可长久使用。二、固定化细胞技术的应用1.固定化细胞的概念通过各种方法将细胞与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性，这一过程称为细胞固定化。固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，可以像游离的细胞一样用于发酵生产。2.应用：固定化细胞可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。(1)在工业生产上，利用固定化植物细胞可以生产多种色素、香精、药物、酶等。(2)利用固定化微生物细胞可以生产酒精、啤酒、谷氨酸、淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、青霉素、头孢霉素等。(3)在医学上，利用固定化动物
6、细胞可以生产小儿麻痹症疫苗、狂犬病疫苗、麻疹疫苗、肝炎疫苗、口蹄疫疫苗等，还可以生产生长激素、干扰素、胰岛素、催乳素、促性腺激素等。(4)将固定化的胰岛细胞制成微囊，能治疗糖尿病。(5)用固定化细胞制成的生物传感器可用于医疗诊断。(6)在化学分析方面，可制成各种固定化细胞传感器，用来测定醋酸、乙醇和氨等。(7)固定化细胞在环境保护、能源开发等领域都有着重要的应用。3.固定化细胞技术的优点(1)固定化细胞技术无须进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，同时大大降低了生产成本。(2)固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用细胞中所含的复合酶系完成一系列的催化反应。(3)对于活细胞来说，
7、保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高。(4)细胞生长停滞时间短，反应快。正是由于固定化细胞的这些无可比拟的优势，尽管固定化细胞技术的出现远远晚于固定化酶技术，但它的应用范围比固定化酶更广泛。4.固定化细胞技术的缺点(1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。(2)由于载体的影响，营养物质和产物的扩散受到一定限制。(3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键的限制因素。5.细胞的固定化方法凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。凝胶包埋法所使用的载体主要有海藻酸钠凝胶、琼脂、角叉菜胶、明胶等。用海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞的操
8、作简便，条件温和，对细胞无毒性。6.酵母菌细胞的固定化技术的过程准备各种实验药品和器材制备麦芽汁活化酵母菌细胞配制物质的量浓度为0.05 mol/L的氯化钙溶液制备固定化细胞浸泡和洗涤发酵麦芽汁。分析下列酵母菌细胞固定化操作流程，回答问题。主要药品有：干麦芽粉、干酵母、聚乙烯醇(PVA)、海藻酸钠、无水氯化钙、蒸馏水、葡萄糖溶液、碘液 干麦芽粉蒸馏水麦芽汁无菌麦芽汁 干酵母蒸馏水活化的酵母菌 无水氯化钙蒸馏水 聚乙烯醇(PVA)海藻酸钠蒸馏水酵母菌聚乙烯醇海藻酸钠溶液凝胶珠 待凝胶珠在溶液中浸泡30 min后，取出并用蒸馏水洗涤3次备用 将凝胶珠加入无菌麦芽汁中1.在酵母菌细胞的活化和配制Ca
9、Cl2溶液时，都使用了蒸馏水，为什么不能使用自来水？答案防止自来水中各种离子影响实验结果。2.配制海藻酸钠溶液时加热是关键，为什么要用小火间断加热？答案防止海藻酸钠溶液焦糊。3.能否在刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入活化的酵母菌细胞？答案不能，因为刚溶化好的海藻酸钠溶液温度较高，会将酵母菌细胞杀死。归纳总结 1 固定化细胞与固定化酶的主要区别固定化细胞使用的是活细胞，因而为了保证其生长、增殖的需要，应该为其提供一定的营养物质。固定化细胞由于保证了细胞的完整性，酶的环境改变小，所以对酶的活性影响最小。 2 凝胶珠的检测：刚形成的凝胶珠应在氯化钙溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量
10、是否合格可以使用下列方法：一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，且没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功；二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。3.关于固定化酵母菌细胞制备过程的叙述，正确的是()A.为使酵母菌活化，应让干酵母与自来水混合并搅拌B.用小火或间断加热可防止海藻酸钠溶液焦糊C.向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母菌细胞，充分搅拌并混合均匀D.将与酵母菌细胞混匀的海藻酸钠溶液倒入CaCl2溶液中，会观察到CaCl2溶液中有球形或椭球形的凝胶珠形成答案B解析酵母菌细胞活化时，应让干酵母与蒸馏水混合并搅拌，A项
11、错误；配制海藻酸钠溶液时要用小火或间断加热的方法，否则海藻酸钠会发生焦糊，B项正确；刚溶化的海藻酸钠应冷却后再与酵母细胞混合，否则温度过高会导致酵母细胞死亡，C项错误；将与酵母菌细胞混匀的海藻酸钠溶液匀速滴入CaCl2溶液中，D项错误。4.下面是制备固定化酵母菌细胞的实验步骤，请回答下列问题：酵母菌细胞的活化配制CaCl2溶液配制海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合固定化酵母菌细胞(1)在_状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复_状态。活化前应选择足够大的容器，因为酵母菌细胞活化时_。(2)固定化细胞技术一般采用包埋法，而固定化酶常用_和_。(3)影响实验成败的
12、关键步骤是_。(4)海藻酸钠溶化过程的注意事项是_。(5)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母菌细胞数目_。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，说明_。(6)该实验中CaCl2溶液的作用是_。答案(1)缺水正常(生活)体积会增大(增多)(2)化学结合法物理吸附法(3)配制海藻酸钠溶液(4)小火加热(或小火间断加热)，不断搅拌(5)较少(海藻酸钠浓度偏高)制作失败(6)使胶体聚沉(或形成稳定的结构)解析(1)酵母菌细胞在缺水的状态下休眠。活化是加入水使酵母菌恢复到生活状态。酵母菌细胞活化后体积会增大。(2)固定化酶常用化学结合法和物理吸附法固定化。(3)实验的关键是配制海藻酸钠溶液，得到
13、凝胶珠。(4)海藻酸钠溶化过程要小火、且间断加热、并不断搅拌，使海藻酸钠完全溶化，又不会发生焦糊。(5)海藻酸钠浓度过低，包埋的酵母菌就会过少；海藻酸钠浓度过高，不易与酵母菌混合均匀。(6)CaCl2溶液能使海藻酸钠发生聚沉，形成稳定的结构。一题多变(1)固定酵母菌细胞的过程中三次使用到蒸馏水，请说出是哪三个环节？答案酵母菌细胞的活化、配制CaCl2溶液以及配制海藻酸钠溶液定容时需要使用蒸馏水。(2)本题中固定酵母菌细胞使用了海藻酸钠，固定化细胞还可以使用哪些固定化材料？答案明胶、琼脂糖、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。(3)制备好的固定化酵母菌细胞可以用于酒精发酵，如果酵母菌细胞没有活化或溶化好的
14、海藻酸钠溶液没有冷却就加入了酵母菌细胞，则对酒精发酵会产生怎样的影响？答案如果酵母菌细胞没有活化，则仍处于休眠状态；如果溶化好的海藻酸钠溶液没有冷却就加入了酵母菌细胞，则酵母菌细胞会被高温杀死。以上两种情况都会导致酒精发酵失败，而最终无酒精产生。1.下列属于固定化酶应用特点的是()可以被反复利用有利于酶与产物分离能自由出入载体一种固定化酶只催化一种酶促反应酶多用包埋法固定化A. B.C. D.答案C解析酶被固定后可与产物分离，故可反复使用，但不能自由出入依附的载体。通常情况下固定化酶种类单一，所以不能催化一系列酶促反应，只催化一种或一类酶促反应。酶分子较小，不适合采用包埋法进行固定化。2.下列
15、关于使用固定化酶技术生产高果糖浆的说法，正确的是()A.高果糖浆的生产需要使用果糖异构酶B.在反应柱内的顶端装上分布着许多小孔的筛板，防止异物进入C.将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，果糖从反应柱下端流出D.固定化酶技术复杂，成本较高答案C解析生产高果糖浆时所用的酶应为葡萄糖异构酶，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成
16、本。3.下图所示的几种固定方式中属于包埋法的一组是()A. B.C. D.答案D解析为吸附法，为化学结合法，为包埋法，包埋于网格中，包埋于微胶囊中。4.在制备固定化酵母菌细胞的实验中，CaCl2溶液的作用是()A.用于调节溶液pHB.用于进行离子交换C.用于胶体聚沉D.用于为酵母菌提供Ca2答案C解析海藻酸钠胶体在CaCl2这种电解质溶液的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，其作用机理是由于盐离子的电荷与胶体微粒电荷相互吸引，形成更大的胶体颗粒，类似于人体红细胞与抗凝集素之间的凝集反应。5.如图所示，图甲为人工种子生产过程示意图，图乙为图甲中过程的相关操作。请据图回答下列问题：(1)图甲中，过程、分
17、别称为_、_。(2)图乙中，包埋形成人工种子的过程中，先适当加热使海藻酸钠溶化，然后将溶化的海藻酸钠溶液_，再加入_充分搅拌混合均匀。(3)若用图乙的方法“制备固定化酵母菌细胞”，海藻酸钠溶液的浓度对实验结果影响较大，若浓度过高，则_，通常评价该实验结果主要是观察凝胶珠的_。答案(1)脱分化再分化(2)冷却至室温胚状体(3)不易形成凝胶珠颜色和形状解析题图是利用植物组织培养技术生产人工种子及用海藻酸钠包埋人工种子的过程。过程、分别称为脱分化、再分化；海藻酸钠溶液的配制是固定化酵母菌细胞的关键，如果海藻酸钠溶液浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数量较少，都会
18、影响实验效果。课时作业学考达标1.下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是()A.固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显B.在固定化酶的应用中，要控制好pH、温度和溶解氧C.利用固定化酶降解水体中有机磷农药，需提供适宜的营养条件D.利用固定化酵母菌细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物答案A解析A项中，固定化细胞技术由于保留了细胞内原有的多酶系统，多步连续催化反应的优势非常明显；B项中，酶的催化受温度、pH的影响，不受氧浓度的影响；C项中，酶的降解作用不需各种营养条件；D项中，糖类的作用不只是作为反应底物，还能维持酵母菌细胞的渗透压，防止酵母菌细胞过多地吸水或失水。2.细胞固定化技
19、术与酶固定化技术相比，所具备的特点是()A.成本更低、操作更容易、不能连续性生产B.成本更高、操作更难、不能连续性生产C.成本更低、操作更容易、能连续性生产D.成本更低、操作更难、能连续性生产答案C解析固定化细胞技术操作更容易，对酶活性影响更小，且能更新，容易回收，可连续性生产，成本自然更低。3.制备好的凝胶珠是否符合要求，常用的检验方法有()挤压法摔打法观察法培养法A. B.C. D.答案A解析检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法：一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起
20、，也能表明制备的凝胶珠是成功的。此外，还可以通过观察凝胶珠的颜色和形状来判断。4.下面是制备固定化酵母菌细胞的步骤，正确的是()配制CaCl2溶液海藻酸钠溶化海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合酵母菌细胞的活化固定化酵母菌细胞A. B.C. D.答案D解析制备固定化酵母菌细胞的基本步骤是：酵母菌细胞的活化配制物质的量浓度为0.05 mol/L的CaCl2溶液配制海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合固定化酵母菌细胞。5.下列关于制备固定化酵母菌细胞的操作，正确的是()A.制备好海藻酸钠溶液后，要立即将其与酵母菌细胞混合以防凝固B.制备固定化酵母菌细胞的过程中需用到注射器C.以恒定的速度把混合液注射到
21、CaSO4溶液中D.凝胶珠在CaCl2溶液中应浸泡10 min左右答案B解析应将海藻酸钠溶液冷却至室温，再加入已活化的酵母菌细胞，否则会把酵母菌细胞杀死，A错误；应以恒定的速度把混合液滴加到CaCl2溶液中，而不是CaSO4溶液中，C错误；凝胶珠在CaCl2溶液中应浸泡30 min左右，D错误。6.下列关于配制海藻酸钠溶液的叙述中，不正确的是()A.加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环B.海藻酸钠溶液的浓度关系到固定化细胞的质量C.海藻酸钠溶液的浓度过高时，易形成凝胶珠D.海藻酸钠溶液的浓度过低时，形成的凝胶珠内包埋的酵母菌细胞过少答案C解析海藻酸钠溶液的浓度关系到固定化细胞的质量。如果海藻
22、酸钠溶液浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母菌细胞的数目过少，影响实验效果。高考提能7.固定化酵母菌细胞在发酵生产中得到了广泛应用，下列有关叙述正确的是()A.利用固定化酵母菌细胞发酵，发酵液浓度不宜过高B.制备固定化酵母菌细胞时，形成的凝胶珠越大越好，越硬越好C.固定化的酵母菌细胞不能繁殖，性状较为稳定D.酵母菌细胞固定化是为了提高发酵速度答案A解析若发酵液浓度过高，会导致酵母菌细胞失水过多而死亡。8.下列关于固定化酶的说法中，正确的是()A.固定化酶的种类多样，可催化一系列的酶促反应B.酶被固定在不溶于水的载体上，可反复利用C.酶作为催化剂，反应前后结构不改变
23、，所以固定化酶可永远利用下去D.固定化酶由于被固定在载体上，所以丧失了酶的高效性和专一性特点答案B解析固定化酶不能催化一系列酶促反应的进行；固定化酶被固定在不溶于水的载体上，可以反复利用，但是随着利用次数的增加，受到外界因素的影响，其活性会逐渐降低；固定化酶具有高效性和专一性的特点。9.如图表示某同学进行的澄清苹果汁生产实验，下列相关叙述正确的是()A.实验中所用的固定化果胶酶由海藻酸钠直接包埋获得B.为防止杂菌污染，图示装置制作完毕后应瞬间高温灭菌C.通过控制阀调节苹果汁流出的速率，保证反应充分进行D.固定化果胶酶不可重复使用，每次生产前应重新填装反应柱答案C10.如图甲表示制备固定化酵母菌
24、细胞的有关操作，图乙是利用固定化酵母菌细胞进行酒精发酵的示意图，下列叙述不正确的是()A.刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液B.图甲中X溶液为CaCl2溶液，其作用是使海藻酸钠形成凝胶珠C.图乙发酵过程中搅拌的目的是使培养液与酵母菌充分接触D.图甲中制备的凝胶珠用蒸馏水洗涤后再转移到图乙装置中答案A解析在该实验中，应将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，再加入已活化的酵母菌细胞，否则高温会导致酵母菌细胞死亡；实验中CaCl2溶液的作用是使海藻酸钠形成凝胶珠；固定好的酵母菌细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗23次，再将其转移至10%的葡萄糖溶液中，并用搅拌器搅拌，目的是使培养液与固定化酵母菌
25、细胞充分接触，有利于发酵的正常进行。11.根据下列材料，回答下列问题：材料科学家发现，几乎所有的酶都可以在各种不同的微生物中找到，而微生物有繁殖快、产量高等优点，所以微生物成了酶制剂的主要原料。从20世纪70年代开始，人们找到了一种方法可以设计连续操作的生物反应系统，即固定化酶。科学家将酶或生产酶的细菌以一定的方法固定在某种载体上，这样生产原料从载体的一头流入，产品就从载体的另一头流出，而酶可以重复使用。酶工程具有简便易行、见效迅速、耗能低、废物少等优点。(1)以上材料体现了科学技术的发展是不断提出问题和解决问题的动态过程，介绍了从_到_，再到_的发展过程。(2)请列举利用固定化酶技术的应用实
26、例。_。(3)固定化酶在生产实践中的优点有_。(4)固定化酶和固定化细胞通常采用的方法有_、_、_。答案(1)酶固定化酶固定化细胞(2)利用固定化葡萄糖异构酶技术生产高果糖浆(答案合理即可)(3)可反复使用；既能与反应物接触，又能与产物分离(4)包埋法化学结合法物理吸附法12.如图为固定化酵母菌细胞及其应用的相关图解，请据图回答下列问题：(1)某生物小组利用海藻酸钠制备固定化酵母菌细胞，应使用图甲中方法_(填号码及名称)，而制备固定化酶则不宜用此方法，原因是_。(2)部分同学制得的凝胶珠如图乙所示，其原因可能是_、_等。观察形成的凝胶珠的颜色和形状，如果颜色过浅，说明_；如果形成的凝胶珠不是_
27、，说明实验操作失败。(3)某同学用图丙所示的装置来进行葡萄糖发酵。a代表_，b代表_。从上端漏斗中加入反应液的浓度不能过高的原因是_。为使该实验中所用到的固定化酵母菌细胞可以反复利用，实验过程一定要在_条件下进行。装置中的长导管起的作用是_。答案(1)包埋法酶分子很小，容易从包埋材料中漏出(2)海藻酸钠溶液的浓度过高注射器推进速度过快(或针筒口离CaCl2液面过近)海藻酸钠溶液的浓度过低，固定化酵母菌细胞数目较少圆形或椭圆形(3)固定化酵母菌细胞反应柱若葡萄糖溶液的浓度过高会使酵母菌细胞因失水过多而死亡无菌释放反应产生的CO2和防止空气中的杂菌进入反应柱解析固定化酶适宜用化学结合法、物理吸附法；固定化酵母菌细胞适宜用包埋法。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠溶液的浓度偏高或注射器推进速度过快(或针筒口离CaCl2液面过近)。13.回答下列有关酶工程的问题：固定化酶是从20世纪60年代迅速发展起来的一种技术。东北农业大学科研人员利用双重固定法，即采用戊二醛作交联剂(使酶相互连接)，海藻酸钠作为包埋剂来固定小麦酯酶，研究固定化酶的性质，并对其最佳固定条件进行了探究。下图显示的是部分研究结果(注：酶活力
