1、土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定FINAL土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定FINAL土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 微生物学实验 生命科学学院 06生工 本文通过稀释平板和分区划线的方法在演艺中心旁的土壤、新运动场附近的足球场和实验室老师用于培养大麦所用的有机肥土壤培养基的土壤样品中分离到能产淀粉酶的芽孢杆菌3株，编号为3、5、7。通过观察其透明圈并测量计算透明圈直径（H）和菌落直径（D）的比值和采用3，5-二硝基水杨酸显色法（DNS）对发酵培养基发酵培养提取的粗酶液进行酶活力测定的方法对该3株菌株进行鉴定，结果表明 酶是生物体内
2、进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。由于酶促反应的特异性强，反应条件温和、安全、无毒、环境污染少。而不同类型的微生物由于自身生长的需要，产生并向胞外分泌能水解大分子蛋白和淀粉的酶类，使不能透过微生物细胞的大分子物质经酶解后形成小分子糖、小队和氨基酸，可为微生物提供碳素和氮素营养。由于微生物体积小，生长速度快，易于大规模生产，从微生物中制取酶已成为发酵工业中的一个新兴领域。目前能由工业生产的50多种酶制剂，大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。酶制剂中的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶在食品、洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、药用
3、等领域具有广泛的应用价值。潮lJ值得一提的是，用于H报反应的高温叫A聚合酶Taq酶是从古生菌中的水生栖热菌(7AowM6g坝zifm)中获取的，此酶可耐8090?高温，而最新的Pfu酶则是从另一类古生菌激烈火球菌(P)州。en6M71删)中获取的。该酶可耐90?以上的高温，这两种微生物酶的发现，为分子生物学的研究提供了有力的工具。 1、了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术； 2、掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法； 3、掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理及方法； 4、培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力； 5、对所学习过的微生物实验
4、方法进行综合技能训练； 6、从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各产淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况。 土壤微生物类群在全球自然生态系统中具有不可替代的作用,它推动着生态系统的能量流动和物质循环,维持生态系统的正常运转,是生态系统中的重要组成部分,在土壤中的分布既反映土壤、植物和气候等综合因素对微生物的影响和作用,同时其生命活动也反映出土壤肥力、土壤改良与植物营养的密切关系。芽孢杆菌是土壤细菌中最具活力的部分之一,也是土壤细菌的主要种群之一3。 芽孢杆菌属(Bacillus)是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。多数为腐生菌,主要分
5、布于土壤、动植物体表及水体中。由于芽孢杆菌属的细菌可以产生多种有用代谢产物,芽孢又是菌体度过不良环境的休眠体,因此,在工、农业生产上有较高的应用价值 1。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离发普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或
6、平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将用营养琼脂和淀粉牛肉膏培养基分离纯化产淀粉酶的芽孢杆菌。 新运动场附近的足球场、温室旁、b17楼下、演艺中心旁的土壤和实验室老师用于培养大麦所用的有机肥土壤培养基 营养琼
7、脂(%)：蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠0.5 琼脂1.5 2.0 蒸馏水 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.27.4。加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。 淀粉牛肉膏蛋白胨培养基(%)：可溶性淀0.2 牛肉0.3 蛋白1.0 氯化钠0.5 琼脂1.52.0 校正pH至7.27.4 发酵培养基(%)：玉米粉 2 黄豆饼粉 1.5 CaCl 0.02 MgSO 0.02 NaCl 0.25 KHPO 0.2 424柠檬酸钠 0.2 硫酸氨0.075(溶解后加) NaHPO0.2 校正pH值7.0 24葡萄糖蛋白胨培养基（V.P试验用）（%）：葡萄糖0.
8、5 蛋白胨0.5 KHPO 0.2 校正pH 7.2247.4 蛋白胨水培养基（吲哚试验用）（%）：蛋白胨1% 氯化钠0.5% 校正pH 7.27.4 西蒙氏柠檬酸盐培养基（%）：氯化钠0.5 硫酸镁(MgSO?7HO)0.02 磷酸二氢铵0.1 磷42酸氢二钾0.1 柠檬酸0.5 琼脂2 溴麝香草酚蓝溶液4 酚红试剂 校正pH6.8 配制营养明胶培养基（%）：蛋白胨 0.5、牛肉膏0.3、明胶1.2，调pH 6.87.0 耐盐培养基（%）：蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠1 琼脂1.5 2.0 蒸馏水 蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠2 琼脂1.5 2.0 蒸馏水 蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠
9、3 琼脂1.5 2.0 蒸馏水 蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠4 琼脂1.5 2.0 蒸馏水 蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠5 琼脂1.5 2.0 蒸馏水 加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.27.4。加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。 染料 革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇; 芽孢染色：5%孔雀绿溶液, 石炭酸复红液; 香柏油、二甲苯 吲哚试验：乙醚、吲哚试剂 V.P.试验：40NaOH溶液、-奈酚， 淀粉酶活力测定：1%3, 5- 二硝基水杨酸试剂 无菌玻璃涂棒 无菌吸管 接种环 无菌培养皿 土样 三角瓶 烧杯 洗瓶 玻棒 试管 酒精灯 擦镜纸 接种环 酒精灯
10、 载玻片 吸水纸等。 恒温摇床 恒温培养箱 高压蒸汽灭菌箱 超净工作台 水浴箱 紫外灯照射箱 磁力搅拌器 玻璃珠 移液管 涂布器 显微镜1、土样的采集 取五个土样点，分别是新运动场附近的足球场、温室旁、b17楼下、演艺中心旁的土壤和实验室老师用于培养大麦所用的有机肥土壤。用无菌用具，如用酒精擦拭过的铲子铲去表土，取其各自表土5cm左右的深处土壤，装进无菌防水纸袋，编号包装好。 2、菌株的分离提纯 -1的2.1土壤稀释液的制备 土壤悬浮液。每个环境的土样装1个锥形瓶，共5个，同时将其分为10组，编号ABCDE。 ?五个土样分别取5g，放入各自装有45mL无菌水的三角瓶，振荡10min,即为稀释1
11、0?将5个锥形瓶加塞、包扎、摇匀（无菌室里），利用恒温水浴装置80?左右水浴，水浴锅-1温度恒定后维持20min（制悬液时就应先开始加热），制成10 g/ml的土壤悬液 -2-3-4-5?再分别另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10、10、10、10。取已稀释成-110土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10-2的无菌水的试管-2-2中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10土壤稀释液。同法从10的试-3管中吸取1mL稀释液加入编号为10的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次-4-5连续稀释为10、10土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，
12、以同一支吸管由浓到稀，稀释到底。 -2-3-4?选择稀释度10、10、10，加热80?20min处理稀释液以杀死无芽孢细菌，浓缩芽孢杆菌。 2.2分离土壤中的细菌及纯化 ?制作平板 每组取无菌培养皿2副，各在培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。取已溶化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入无菌培养皿中，制成平板。 ?涂布平板 用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做3个平板（重复）。 ?划线接种（分区划线法） 平板凝固后，各组分别用接种环以无菌操作挑取平板上长出
13、的单菌落分区划线，先在平板培养基的一边作第1次平行划线34条，再转动培养皿约60?角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2次平行划线部分作第3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线（如右图）。划线完毕，盖上皿盖，倒置于2829?C温室中培养约20h.。再继续分区划线2-3次，以获得较纯的菌种。 ?将纯化得到的单菌落分为两部分，其中一部分接种到培养基内，用以保存菌种，另一部分用来做染色实验。 2.3获产淀粉酶芽孢杆菌纯种： 上述划线接种后的菌落中各挑取形态特征不一致的点接于倒好的淀粉牛肉膏培养基中，一个土样取8个平板两两标记同一位置同序
14、号标记，一平板分5个区域，点接重复两次，在37?培养箱中培养24h。 上述点接后的平板中取出一组四个分好区域的淀粉牛肉膏培养基平板于实验室，其他置于无菌室。实验室里，四个平板均加入碘液，立即观察记录阳性和阴性菌落所在位置，并可同时记录透明圈的大小。根据所记录的阳性菌的编号，利用另一组中的营养琼脂平板上其对应的菌落继续划线接种，培养后将出现的形态特征不一致的菌落进行编号，然后挑取部分出来进行革兰氏染色镜检，若发现视野内出现形态、大小、颜色一致且为杆菌的菌体，则将其对应的菌种划线接种到新的营养琼脂平板上，标记，37?下培养24h。否则继续进行划线分离，培养后再经革兰氏染色镜检直至得到纯种杆菌后进行
15、芽孢染色。筛选出芽孢纯种后进行斜面接种。 其中革兰氏染色步骤： 涂片、干燥及固定 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约1520秒，后立即用流水冲洗。 复染：滴加番红染色液，染35分钟，水洗后用吸水纸吸干。 镜检：油镜观察染色结果。 芽孢染色染色镜检： ?取37?培养1824h的枯草芽孢杆菌涂片，干燥，固定。 ?于涂片上滴人35滴5%孔雀绿水溶液。 ?用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约45min。加热
16、过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。 ?倾去染液，待玻片冷却后，水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 ?用石炭酸复红液复染l min，水洗。 ?制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。观察荚膜 2.4斜面保存菌种 ?贴标签 取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口23cm处。（每种菌接3管，标上相同编号也要与平板上菌落编号相对应）。 进行斜面接种操作，加塞、包扎好到37?培养箱里培养24h。 3、菌种的鉴定 3.1所得的斜面菌种接种到新的平板上培养以观察筛选出的产淀粉酶芽孢杆菌菌落的大小、颜色、干湿情况、形态 、高度 、透明程度、边缘、是否
17、易被挑起、气味等。然后进行一系列的镜检革兰氏染色、芽孢染色（具体步骤同上）观察是否符合附表中芽孢杆菌的指标 3.2 生理生化试验 温度对菌种培养的影响；淀粉水解试验；温度对菌种的影响；明胶液化试验；糖发酵试验；乙酰甲基甲醇试验(V.P试验)；吲哚试验；耐盐性试验；柠檬酸盐利用试验。 ?温度对微生物生长的影响 将牛肉膏蛋白胨培养基熔化倒平板。（培养基厚度为一般培养基的1.5 到2倍） 取30 套牛肉膏蛋白胨平板，分别进行标号。 在上述各平板中分别划线接种不同的菌种，每个菌种重复接种六个平板。各取每个菌种两套平板倒置于4? （冰箱）、37?（或者室温），60?下保温培养24 小时，观察细菌的生长状
18、况。（“”不生长，“+”生长较差 ， “+”生长一般，“+”生长良好。 ?淀粉水解实验 以18-24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区划“+“字接种，）或直接移种于淀粉肉汤中，于36?1?培养24-48h，或于20?培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸
19、性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。 ?明胶水解试验 穿刺接种、培养 先用接种针在斜面上挑取少量菌苔。左手拿直立柱试管，在火焰旁用右手小指和掌边拔出棉塞。随之将试管口朝下，同时将接种针从直立柱培养基中央自下而上直刺到离管底11.5cm处（切勿穿透培养基）。然后沿原穿刺线拔出接种针。管口过火，塞上棉塞，插在试管架上。灼烧接种针上残菌。各种杆菌分别接种2支直立柱试管，标记，要与斜面菌种标记相对应。另设一支不接种，作为空白对照。 观察记录 将已接种的直立柱试管置37?培养24h后取出，通过透射光目测细菌在穿刺线上的生长情况，并记录结果。凡能产生蛋白酶的细菌，可使明
20、胶自表面开始沿穿刺线逐渐分离，使明胶柱液化呈火山口状，芜菁状，漏斗状、囊状或层状等不同的形状。 ?糖类发酵试验（葡萄糖、木糖和乳糖发酵） 用小砂轮轻轻切割发酵管没有标签和标识的另外一端，注意保留标签和糖的名称。用接种针将各种杆菌分别接种于两种发酵管内，每种发酵管重复两次，标记，要与斜面菌种标记相对应。两种发酵管各设一支不接种，作为空白对照。注意接种的整个过程中，不能人为的制造气泡，若发酵管内有气泡，则轻轻甩动发酵管直至气泡消失。若气泡不能退去，则该管作废应重做一管。接种后，每一管外包一层无菌纸，以防污染。接种完毕后，将全部发酵管倒置于干净小烧杯内，37?培养24h。 观察记录：与对照管比较，若
21、接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“”。 ?乙酰甲基甲醇试验(VP试验) ? 标记试管 ：取装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，编号。 ?接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37?恒温箱中，培养24h。 ?观察记录 取出以上试管，充分振荡2min。每管分别加入40NaOH溶液1020滴，并加等量-奈酚，振荡试管，以使空气中的
22、氧溶入，置37?恒温箱中保温1530min后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应（用“”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“”表示）。 ?吲哚试验 ? 试管标记 取装有蛋白胨水培养液的试管，编号。 ?接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，空白对照管不接种，置37?恒温箱中培养24h。 ?观察记录 在培养液中加入乙醚12ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入510滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性
23、用“”、阴性用“”表示。 ?耐盐性试验 将分离获得的细菌分别接种在NaCl浓度为1%，2%，3%，4 %，5%的牛肉膏蛋白胨液 5。 体培养基中,置37?下培养,观察生长情况 ?柠檬酸盐试验 取装有西蒙斯氏柠檬酸盐培养基的试管分别标记待测菌种的编号和空白对照以无菌操作分别将少量菌苔接种于各支相应的管中，然后置于37?恒温箱中培养24h。观察结果，若培养基变蓝色，则表明该菌能利用柠檬酸盐作为碳源而生长，即为阳性反应，以“”表示。若培养基仍为绿色则为阴性反应，以“”表示。 4、产淀粉酶芽孢杆菌产淀粉酶活性的测定 将初筛纯菌种接种于30/250mL 种子培养基,37 ?、250r/min摇床培养过夜
24、。种子液以2 %接种量接种于产酶液体培养基50/500mL ,相同条件培养72h ,发酵液8 000r/min 离心10min ,取上清液测酶活, 每个样品重复3 次,最后结果取平均值。 在Young等方法的基础上作了改进：取5ml 0.5%的可溶性淀粉溶液，在40?水浴中预热10min，然后加适当稀释的酶液0.5ml，反应5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4终止反应。取0.5ml反应液与5ml碘液显色，在620nm处测光密度。以0.5ml水代替0.5ml反应液为空白，以不加酶液（加同样体积的缓冲液）的管为对照。酶活力根据下式计算： 酶活力（u/ml）=(R-r)/R*50*D
25、式中R、r分别表示对照和反应液的光密度，D为酶的稀释倍数。调整D使（R-r）/R在0.2-0.7之间。确定在40? 5min内水解1mg淀粉的酶量为一个活力单位。 3.2.6 菌种保藏法（斜面冰箱包保藏法） 将菌种接种在新鲜外面培养基上，定温培养长出丰满菌苔后（一般形成芽孢的细菌要形成芽孢），贴上标签，放在试管上，在棉塞部位用尼龙纸或防水纸包好，以防外界污染和水浸湿，放入4?冰箱中保藏。 选择的五处地方将分离出不完全相同的产淀粉酶芽孢杆菌，但前提是这五处土样的选取应该有一定的差别，如土样的颜色，气味等等。预期中每种土壤悬液接种培养后产生的菌种是多样的，且纯化后得到的菌种多为芽孢菌。 菌种编号
26、1 2 3 4 5 宽度（微米） 长度（微米） 细胞内蛋白晶体 革兰氏染色 芽孢染色 乳糖发酵 木糖发酵 葡萄糖发酵 最适生长温度 淀粉试验 柠檬酸盐试验 耐盐试验 VP试验 吲哚试验 淀粉酶活力 菌种鉴定 以标准菌株作对照，部分菌株鉴定参照进行鉴定。 1、要严格按照培养基配方配制培养基，防止杂菌污染。 2、观察结果时要注意滴加药量及反应时间。 3、严格无菌操作，防止污染情况的发生。 4、称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。调pH时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。 5、 革兰氏染色时注意脱色的时间的控制，过长或过短都会影响实验结果。 6、现有一株细菌
27、宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你应如何确保你的染色结果的正确性。 7、进行染色鉴定时，都应有已知的对照菌种在同等条件下染色，然后进行对比记录结果。 8、在芽孢染色中，应注意温度的控制，避免染料在玻片上蒸腾，否则影响实验结果。 1周德庆.微生物学实验教程，北京：高等教育出版社，2002.9 2 R.E布坎南 N.E.吉本斯等编 伯杰细菌鉴定手册（第八版） 3 柳辉,杨江科,闫云君. 产- 淀粉酶菌株的分离、鉴定及酶学性质研究J. 生物技术, 2007 年4 4闵航. 微生物学实验M. 浙江大学出版社，2005,2 月 第17 卷 第2 期:34-37 5 史永昶等. 蛋白酶对解淀粉芽孢杆菌- 淀粉酶活力的影响J. 微生物学通报,1995 ,22(1) :2324. 6 唐志燕,龚国淑*,刘 萍,邵宝林,张世熔 成都市郊区土壤芽孢杆菌的初步研究? 西南农业大学学报(自然科学版) 第27卷第2期 7史永昶,姜涌明. 五种- 淀粉酶测活方法的比较研究J . 微生物学通报,1996 ,23(6) :371373.
