1、如果要克隆较小的DNA片段（10kb）且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。 本实验中应用T载体转化受体菌E. coli DH5的菌株。由于T载体上带有Ampr 和lacZ基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与-互补现象筛选相结合的方法。 因T载体带有Ampr （氨苄青霉素耐受）基因,故转化受体菌后只有带有T载体 DNA的转化子才能在含有Amp（氨苄青霉素）的LB平板上存活下来; 而未获得转化的空细菌则不能存活。此为初步的抗性筛选。 T载体上带有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架
2、,不影响其正常功能。E. coli DH5菌株带有-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下, T载体和DH5编码的-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在T载体和DH5融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫-互补。由-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal（5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）的存在下被IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到T载体质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去
3、-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在LB培养基上，-互补产生的Lac+细菌由于含-半乳糖苷酶，能分解LB培养基中的X-gal，产生蓝色菌落，而当外源片段插入后，失去-互补能力，因而不产生-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的X-gal，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为-互补现象筛选。注：X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）以半乳糖苷酶（b-galactosidase）水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳
4、糖苷（Isopropylthiogalactoside），为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。连接策略外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：（1）带有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶处理质粒和外源片段，即可得到这样的末端。但是在连接反应中值得注意的是，由于质粒和外源片段本身可能含有两个相同粘性末端，因此均可能发生质粒的自身环化或外源片段形成的寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须在实验方案中尽可能保证正确连接产物的数量达到最高，同时需进行后续阳性克隆的筛选。（2）带有非互补粘性末端 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克
5、隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。（3）带有平末端 是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于在连接反应中，平端的连接效率比粘性末端要低得多，故使用T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇（PEG 8000）以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。 特殊情况下，外源DNA分子的末端与
6、所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头（linker）或衔接头（adapter）使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶的klenow大片段部分填平3凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。转化转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R,M）,它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体
7、细胞经过一些特殊方法（如电击法,CaCl2 ,RbCl等化学试剂法）的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl（KCl）法，RbCl（KCl）法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,
8、可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存（半年）,因此CaCl2法为使用更广泛。 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：（1）细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，密度过高或不足均会影响转化效率。（2）质粒的质量和浓度: 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA量过多或体积过大时,转化效率就会降低。一般情况下，1ng的DNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和，同时DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。（3）试剂的质量:所用的试剂
9、,如CaCl2 等均需是最高纯度的（GR.或AR.）,并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。（4）防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿、离心管等需经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌或过滤除菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染。本实验方案本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态（本实验购买了商品化的感受态）,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr ），可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的
10、受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。带有插入片段的转化子由于破坏了半乳糖苷酶基因,呈白色;不带外源片段的转化子可以分解X-gal，呈兰色。将白色转化子挑出后扩大培养，PCR鉴定后进一步酶切鉴定。一、 试剂材料及设备 试剂：X-gal储液（20mg/ml） ，IPTG储液（200mg/ml） ，LB液体培养基，0.1mol/L的CaCl2溶液，Amp母液，含Amp的LB固体培养基，含X-gal和IPTG的筛选培养基，pMD18-T vector； 注：具体配方见实验六后附录 材料：外源DNA片段:PCR纯化回收产物，载体DNA pBS质粒（Ampr ,lacZ），E. coli DH5菌株 R
11、,M,Amp； 设备：恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅， 琼脂糖凝胶电泳装置， 电热恒温培养箱，电泳仪，无菌工作台， 微量移液枪，eppendorf管，低温冰箱,制冰机, 分光光度计 二、实验步骤及注意事项 （一）连接反应 1、样品混匀 冰上溶解solution I、vector及重组DNA片段等，涡旋混匀并短暂离心。2、配制连接体系 按下列顺序在加入各种成分, 建立连接反应。成分体积vector0.5l纯化产物4.5lTotal5l纯化产物的使用量0.1pmol-0.3pmol；3、 加入Solution I Solution I的体积为5l，轻轻吹吸混匀。4、 连接反应 16连接30m
12、in（水浴或PCR仪进行）。 （二）感受态细胞的制备 （ CaCl2 法）1、 受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5单菌落,接种于5ml LB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右（过夜）,直至对数生长后期；将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于50ml LB液体培养基中,37300转振荡培养3小时至OD600 0.5左右。2、 收集菌体 将5ml培养液转入预冷的离心管中,冰上放置10分钟,然后于4下4000转离心10分钟。3、 CaCl2悬浮细胞，制备感受态弃上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液1ml轻轻悬浮细胞, 4下4000r/min离心10分
13、钟。弃去上清, 倒出培养液，将管倒置几秒钟以使最后残留的痕量培养液流尽。加入0.2ml预冷0.1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,转入1.5ml离心管，冰上放置20分钟,即成感受态细胞悬液。4、 感受态细胞冻存3中用含15%甘油的0.1mol/L的CaCl2 溶液代替普通预冷CaCl2 溶液，重悬细胞,即可贮存于-70可保存半年。使用时从-70冰箱中取出感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。（三） 转化1、 混合冰上迅速解冻感受态细胞，取50l + 重组DNA5l，用手指轻弹混匀；置于冰上，静置30min，使二者充分结合；1）解冻感受态细胞，动作要快；以免影响细胞转化效率
14、； 2）重组DNA质粒解冻后，混匀，瞬间离心再取；3）质粒含量不宜过多，一般不超过50ng，体积不超过10l； 4）感受态细胞和DNA混匀时不要用枪吹打，以免影响细胞转化效率；2、 热击42水浴，热击45秒,后迅速置于冰上冷却2-3分钟，过程中不要摇动离心管。1）热击操作使DNA进入感受态细胞；2）不同感受态细胞，热击时间亦有所不同；3）冰上迅速冷却，使得DNA在感受态中稳定；3、 菌的增殖加入不含抗生素（Amp）的LB液体培养基500l混匀，37振荡1小时（转速为200转/分）。此步骤主要是为了使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。4、 铺板取100l的菌液加到含Amp及I
15、PTG（4ul）/X-gal（40ul）的筛选平板上，用涂布棒小心涂布均匀；室温正置1小时左右，使菌液完全被培养基吸收；1）含Amp及IPTG/X-gal的筛选平板需要事从冰箱中取出，倒置，使之恢复室温；2）涂布的菌液量要适当，以免形成的菌落密度过密或过稀，不利于后续挑菌。5、 过夜培养倒置培养皿,37培养箱中静置培养过夜。1）倒置培养是防止冷凝水浸润到培养基中；2）静置培养时间不宜过长，时间过久会出现“卫星菌落”。附录：试剂配方1、 X-gal储液（20mg/ml）: 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20。2、IPTG储液
16、（200mg/ml）: 在800l蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22m滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20。3、含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50g/ml Amp的LB平板表面加40l X-gal储液和4lIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,备用。 4、Amp母液：配成 50mg/ml水溶液, -20保存备用。 5、含Amp的LB固体培养基: 液体培养基中每升加15g琼脂粉,高压灭菌。 冷却至60左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。 6、0.1mol/L的CaCl2溶液:溶于重蒸水中,定容后过滤灭
17、菌。 7、LB液体培养基（20g/L） ：LB固体粉末20g，加入1L自来水，溶解后高压灭菌。 8、质粒重组试剂盒：pMD18-T vector （TaKaRa）实验七 重组克隆的蓝白斑筛选一、材料与试剂试剂：含重组DNA片段的E. coli DH5菌株，Amp母液（ 50mg/ml水溶液），LB液体培养基，PCR试剂盒仪器：牙签、恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅， 琼脂糖凝胶电泳装置， 电热恒温培养箱，电泳仪，无菌工作台，微量移液枪，eppendorf管，低温冰箱二、实验步骤与注意事项1、阳性克隆筛选取过夜倒置培养的平板，观察平板：是否出现明显而又未相互重叠的单菌落1）如果未出现菌落或菌
18、落较小，可以延长培养时间。2）在含X-gal和ITPG的LB培养基上，带有插入片段的重组质粒转化子，应呈现白色菌落，因为插入片段破坏了原载体中-半乳糖苷酶活性；带有空载体的转化子，由于具有-半乳糖苷酶活性,为蓝色菌落；不带有质粒载体DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。2、挑阳性菌用牙签随机挑取白色重组菌，沾至含有Amp抗生素1ml液体LB培养基中，37度培养过夜（转速200转/分）。 3、菌落PCR1）菌液模板的获取取0.2ml过夜培养的菌液于1.5ml离心管中，沸水浴5分钟。12000rpm，离心3分钟。2）配制PCR体系25l模板：取2l上清作为模板；引物：
19、pGE-T Vector 多克隆位点两侧的序列；或从基因组中扩增出片段时所用的引物。反应体系：组分（工作浓度）终浓度10Buffer2.5l1dNTP（10mM）200M引物（上下游2.5M）2l0.2M菌液100ngTaq（5U/l）0.25l1.25U灭菌ddH2O 补齐25l3）PCR反应条件94 预变性2 分钟94 变性30 秒57 退火30 秒 28 cycles72 延伸30秒 72 延伸5分钟4）电泳取10l PCR产物，加入上样缓冲液，1.5%琼脂糖电泳检测插入片段的大小是否与目的基因一致。实验八 质粒DNA的提取、酶切及电泳检测质粒DNA的提取与电泳基本步骤培养细菌使质粒扩增
20、；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。实验原理采用十二烷基磺酸钠（SDS） 或Triton X-100可使细胞膜裂解。经SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA（Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的
21、超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。 电泳检测在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA（Open circular DNA, 简称 ocDNA）；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA（Linear DNA）。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。酶切鉴定限制性内切酶能特异地结合限制性酶识别的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DN
22、A。如EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5GAATTC3 5 G AATTC33CTTAAG 5 3 CTTAA G5（2）辨识和分析评价对象可能存在的各种危险、有害因素，分析危险、有害因素发生作用的途径及其变化规律。酶切反应影响因素DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响酶切反应的效率。DNA：大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。缓冲液：如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的
23、盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。酶切图谱DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP（限制性片段长度多态性）技术更是建立在它的基础
24、上。在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1g。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度（大多数为37）。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1g DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。安全评价的基本原则是具备国家规定资质的安全评价机构科学、公正和合法地自主开展安全评价。一、试剂 1、溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl （pH8.0）， 10mmol/L EDTA （pH8.0）。 溶液
25、可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌（6.895*104Pa）15分钟,储存于4冰箱。2、溶液：0.2 mol/L NaOH （临用前用10mol/L NaOH母液稀释），1 SDS。3、溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Ac 5mol/L。4、RNase酶10mg/ml5、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl（pH8.0），1mmol/L EDTA （pH8.0）。1、接菌 用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基（含50g/ml A
26、mp）中,37振荡培养 约12小时至对数生长后期。后续步骤2-4为质粒DNA少量快速提取（碱法）（2）安全验收评价。该方法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。提取过程保持低温稍好。（2）疾病成本法与人力资本法2、菌体的收集 2）间接使用价值。间接使用价值（IUV）包括从环境所提供的用来支持目前的生产和消费活动的各种功能中间接获得的效益。取5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中（多次离心在同一管中进行，将沉淀一并收集）, 12000g离心30秒。弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。菌液量要适当，太少可能无法保证后续实验要求，太多会使裂解提取步骤不够充分。3、 菌体裂解（1）洗涤菌体 用1ml STE重悬洗涤菌体，离心，12000g离心30秒，收集菌体。重复用STE漂洗菌体。为了有别于传统的忽视环境价值的理论和方法，环境经济学家把环境的价值称为总经济价值（TEV），包括环境的使用价值和非使用价值两个部分。洗涤的目的在于除去培养基中菌株细胞壁成分，以免其抑制限制性内切酶的活
