1、多数基因调节花发育的早期阶段，包括MADS-BOXS基因家族的成员AP1, CAL and FUL（Yanofsky 1995）。除了高度保守的MADS域含有57个氨基酸外，在一个典型的植物MADS蛋白包含一个I区（30-40个氨基酸），跟随于一个适度保守的K区（约66个氨基酸）和相对较低保守的末端区域。该MADS域蛋白可作为转录因子激活或抑制其他基因（Schwarz-Sommer et al. 1992, Riechmann and Meyerowitz 1997）。一般来说，植物MADS - box基因可分为几个不同的亚科，在成花过程中成员有着相似的功能（Purugganan et al.
2、 1995, Theien et al. 1996）。我们已经了对白桦树（微生物学鸭蹠草）成花发育的研究。从系统发育角度，桦木家族在主要双子叶植物核心分支下属于高级金缕梅纲的次级分支（Manos and Steele 1997, Magallon et al. 1999），“高等”金缕梅纲的代表有典型的风媒花和高度退化的花。桦木有雌雄分离的单性花序。雄性花有一个简单的花被和两个雄蕊组成，而雌花则只由一个子房和两个心皮构成（Atkinson 1992, Dahl and Fredrikson 1996）。雄性花序发育在开花之前开始于一年中的早春期，在芬兰，大致出现在盛夏，有2-4mm长（Sarv
3、as 1952）。雌性花序的发育在6月到7月之间；位于芽内越冬，并于5月开花。我们的目的是了解一些在很多北方区域的经济重要林木白桦花发育的遗传调控的方面。另外一个目的是利用获得的知识研发不开花桦树。因为所有的基因蔓延在自然种群中的后果是难以预测的，所以在它们被测试到在自然中生长之前需要防止转基因树木的开花（Strauss et al. 1995）。论另一方面，加速开花，这将是可取的，例如，加快育种计划。本研究的目的是在桦树中确定花序和花发育早期阶段的基因调节。我们描述这3个cDNA的克隆与性征，它们都表现出与AP1和FUL的相似性。我们想要找出这些基因是否在雌性和雄性花序中表达，它们什么时候处
4、于活跃以及它们与其他未知的植物MADS-box基因有怎样的联系。我们也希望通过它们在烟草植物中的表达初步探知它们的功能。材料与方法植物材料在用不同发育阶段的几种野生白桦树（微生物学鸭蹠草）雌雄花序或花序（雄）芽。最早的雄性柔荑花序采自六月份的并采24毫米长，下一阶段（7毫米）收集在七月而第三阶段（约20毫米）在八月。雄蕊的似乎在花序长7毫米时发育的很好， 并在秋天几乎完全发育完成。处于休眠状态的雄性花序采于一月份。当雄性花序约50毫米长，开花期发生在5月初。在九月收集第一个样品的雌花序，它们处于萌芽状态约4毫米长。在这个阶段，心皮的芽清晰可见。在冬天休眠期间，心皮发育良好，并在春季，心皮增大。
5、休眠期雌花序的样本是在一月采集，接着进一步样品采于它们在四月出芽（长度10毫米），和在5月的开花时期（约20毫米长度）。最后的样本收集于花序发展成种子的六月。营养器官（根、叶及约5毫米的顶芽，有紧密的植物分生组织）分离自长在试管内的约为10厘米长的生长茎。样品进行了液氮冷冻和储存在_-80C环境中。RNA的分离和RNA的凝胶印迹分析用Friemann et al. （1992）.的方法分离得到白桦组织的总 RNA。对RNA样品的量和纯度进行分光光度计和凝胶溴化染色电泳进行检测。本样品（10毫克）在甲醛琼脂糖凝胶进行粒度分级电泳，转移到尼龙膜（MSI）并在缓冲液中在42C下与标记有P32的探针进
6、行杂交（5 SSPE，50%甲酰胺，5_Denhardt 溶液，0.2%十二烷基硫酸钠，100毫克每毫升_1变性脱氧核糖核酸）。然后用0.2SSPE和0.5%十二烷基硫酸钠在65C清洗。探针基因具有特异性，BpMADS3有480-nt片段，BpMADS4有290-nt片段和BpMADS5有350-nt片段从cDNA克隆基因的3端包括部分C区的3末端和整个3的非编码区。所有的探针标记使用随机引物标记程序（试剂溴酚蓝，瑞典乌普萨拉）。转基因烟草植物中总RNA的分离使用总RNA提取试剂盒（Qiagen GmbH, Hilden,Germany）.。聚合酶链反应（PCR）扩增逆转录酶（RT）-聚合酶链
7、反应用于分离部分基因克隆相应的白桦MADS - box基因。用Friemann et al. （1992）的方法从雌性（24毫米）和雄性（210毫米）花序中分离得到总RNA。第一链cDNA的合成使用第一链合成试剂盒（蛋白质纯化手册生物技术）。部分基因对应到BPMADS3，4和5得到了RT - PCR使用部分简并寡核苷酸MX2U, 5%-GTI（TC）TITG（TC）GA（TC）GCIGA（AG）GT-3%成相应的肽序列到MADS盒肽序列VLCDAE的地区连同寡D（T）（18 - MER）。聚合酶链反应的条件如下：初始变性在962分钟，其次是35个周期的94为1分钟，451分30秒和72为1分3
8、0秒。最后延伸温度725分钟。所有的PCR反应采用TBR聚合酶（Dynazyme, Finnzymes Inc., Espoo, Finland）。扩增产物克隆入质粒pUC 18载体，并测序。构建及筛选文库从雌性柔荑花序开花前（约15毫米长）和早期发育的雌性柔荑花序（24毫米长）用poly（A）_RNA分离构建2个cDNA文库。文库的构建ZAPII制成使用基因合成试剂盒（蛋白质纯化手册和生物技术）和GigapackII黄金克隆试剂盒（Stratagene, La Jolla, CA,USA）。用部分cDNA特性反应制成探针用以对上述基因的筛选。显然，全长cDNA克隆对应的BpMADS3和5从成
9、熟雌性柔荑花序的筛选文库中获得而cDNA克隆对应的BpMADS4是从幼嫩雌花序的筛选文库中得到。含有目cDNA的pbluescript质粒基因利用F1辅助噬菌体从噬菌体中被成功分离（Stratagene）。测序和序列分析所有测序反应用双脱氧链终止法进行使用T7测序试剂盒（蛋白质纯化手册生物技术）。两股孤立的cDNA单链分别测序。核酸和氨基酸序列分析使用采用图文影像包发布10.0（遗传学电脑集团，公司，麦迪逊，威斯康星州，美国）。序列数据库用来与序列BpMADS3，4和5进行比对。氨基酸和核苷酸序列的比对都由CLUSTAL W程序来完成，清晰精致的视图使得以氨基酸和核苷酸序列能够做很好的分析。距
10、离计算进行了使用Tajima and Nei （1984）的分子进化遗传算法分析软件包版本1.02（Kumar et al. 1994）。距离计算是采用只有第一和二密码子的位置。进化树构建是500个辅助重复实验的结果，使用邻接方法（Saitou 和Nei，1987）与云杉基因DAL 1（tandre等人，1995）和核桃基因PrMADS3（mouradov等人，1998）作为外类群。烟草转化cDNA克隆基因在质粒pHTT602中CaMV 35S启动子的控制下包含有BpMADS3，4和5的整个编码区。质粒PHTT602类似于PHTT370 （Elomaa et al. 1993）。除了已经加入n
11、pt-II 基因插入（T. H. Teeri）。嵌合质粒通过三亲交配（Van Haute等人，1983）被转移到含有Ti质粒pgv2260（Deblaere等人，1985）的农杆菌菌株c58（Van Larebeke 等人，1974）中。烟草叶盘（Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1）转化的标准方法（Horsch等人，1985），选择利用卡那霉素进行转基因植物。在标准温室条件下培养转基因植物。结果分离及BpMADS3，BpMADS4和BpMADS5序列分析利用RT - PCR方法，3种来自桦木的不同的MADs-box包含的部分基因克隆进行分离和测序
12、。从2个cDNA筛选文库中获得了相应的全长基因克隆。相互分离的基因克隆代表命名为BpMADS3，BpMADS4和BpMADS5（微生物学鸭蹠草MADS）。3个克隆都含有一个有3和5的测区和侧翼ployA尾巴的开放阅读框。所有克隆都有MADs盒的一个ATG密码子近端。核苷酸序列的cDNA克隆有以下的EMBL登录号：BpMADS3, X99653; BpMADS4, X99654; BpMADS5, X99655。在氨基酸水平的序列比较（图1）显示高度的相似性。一致性介于68-72%，相似性为7879%。所有3个序列与AP1有66-74%的一致性以及7783%的相似性，与FUL有6071%一致性6
13、977%相似性（图1）。在分类学上，桦木属于一个主要rosid分支，但与拟南芥属（十字花科；白花菜目）在不同的亚分支，而例如，烟草和金鱼属于其他双子叶植物的主要分支（magallo等，1999）。在这个条件比较下，桦木和苹果（海棠；蔷薇科）基因被认为有相当高的相似性，BpMADS3与MdMADS5相似（85%相似）和BpPMADS5和MdMADS2相似（84%的相似性，如图2所示），两种物种都属于核心Rosids。图1 BpMADS3，BpMADS4和BpMADS5与AP1和FUL的同源氨基酸比对图。这比对是使用PILEUP 和PRETTYBOX程序包的图文影像。相同的氨基酸是描为黑色，相似的
14、氨基酸为深灰色，有点相似序列为浅灰色。点表示空白。图2 不同植物蛋白序列的进化树建立3个不同桦木基因和来自其他植物物种的已报告基因的相关性，并预测不同桦木基因可能的功能同源性，我们制作了一个属于AP1:SQUA 分支和AP1:AGL9亚家族的序列比对（Purugganan 等，1995）。需要用到整个编码序列。这个比对是用来指导构建进化树的（图2）。AP1分支包含有像AP1，CAL，FUL等来自拟南芥和SQUA等从金鱼草以及相关其他物种的基因。所有AP1分支的成员 在I区留有6177个编码一个假定高度保守的共识蛋白序列的SCMEK:RILERYERYSYAE（图1）。这个序列甚至在AP1和AG
15、L9分支都有很大的不同的，它们都被认为属于MADS - box基因的同一家族（Purugganan等人，1995）。因此，这个模似乎是处于AP1：FUL的祖先谱系之间，它偏离AGL9超过300mya（Purugganan等人，1997）。这双子叶植物基因分为2个小组（图2）。第一组包括桦木基因BpMADS3，例如，拟南芥基因AP1和CAL和其他植物同源性基因。第二小组包括，除了桦木BpMADS4和5，例如，拟南芥FUL基因，和形成自己独特分支的单子叶植物基因，像是一个祖先直系的双子叶植物AP1：FUL。进一步的重复发生在AP1和FUL的谱系，例如，CAL来自一个十字花科的重复AP1的谱系，同样
16、BPMADS4和5也似乎来自从同一祖先基因。与AP1和FUL高度相似的成员，也可以通过诊断在K-域和在C -末端的预测蛋白质序列来区分（图1）。AP1像包括，例如，CAL，SQUAHE 和BpMADS3的基因，通常编码保守序列94106个K域SMEYNRLKAKIEL，而FUL基因编码不同的序列，TLEHAKLKARLEV。由3个单子叶植物编码的序列CHEYRLKAKIET与AP1基因编码的十分相似。AP1组的成员基因在最后22个残留的预测蛋白也是高度保守的。这一区域显示一个LDLTLEVYNCNLGCFAA共识序列。在C末端，假定FUL蛋白质有一个非常不同的保守序列，LLPPWMLRHLN，
17、尤其是终止密码子之前在810残留碱基的色氨酸十分保守。单子叶植物的代表，ZAP1和TaMADS11，似乎编码FUL序列为它的C -末端，这意味着这一序列起源于同一个祖先。该预测蛋白质序列的相似性比对类似于AP1：FUL是有效的（http：www.joensuu.fi：sopanen）。BpMADS3，BpMADS4 和 BpMADS5的表达为了检测基因的表达模式，我们用BpMADS3, BpMADS4 and BpMADS5的特异性3末端探针进行RNA杂交印迹分析（使用核酸杂交分析测试）。3个探针杂交基因在cDNA的基础上判断mRNA的大小。BpMADS3的相应记录同时体现在雌性和雄性花序中（
18、图3）。在雌性花序，在早期阶段表达微弱但在当花序渐渐长大和花朵渐渐开放的休眠期和冬天表达量很高。在开花之后的种子成长发育期，表达量继续在相当高的水平。雄花序在年轻的阶段大量表达（图3不可见），在一月的休眠期没有可用记录，但在春天有记录表达水平在此增加，在花期达到最大。植物茎尖检测到了相当弱的表达。BpMADS4也同样在雌性和雄性花序中表达，并根据信号的强度它的表达似乎高于BpMADS3和5（图3）。在年轻的阶段表达就已经很强烈，并在发育过程中持续高水平表达。有一个叶片，植物茎尖和根部表达量的探测器，在休眠和开花以及种子发育过程都有表达量的记录。BpMADS5的雌花序有着比雄花序更高水平的表达（
19、图3）。在这两种类型的花序中的表达开始在早期阶段，此后继续在相当高的水平。大量的记录也出现在休眠雌花序。雄花序在开花期的高水平表达就像雌性花序在种子发育过程中的表达。植物营养部分没有检测到任何表达。图3 桦木BpMADS3、BpMADS4和BpMADS5表达的杂交印迹比较 。从雄性和雌性的不同花序分离发育阶段以及从植物各部分（根、叶、茎尖）取得总RNA样品（10毫克）。与核糖体28S探针的杂交被用来作为RNA的负荷控制。每个探针使用相同的凝胶印迹。异位表达烟草为了得到这些分离基因的相关初步认识，它们受CaM V35S启动子的控制下在烟草中异位表达。每个构建试试验中，培养1015个独立的转基因株
20、种植，其中至少有三分之一个明显的表型的改变。由这3个基因所引起的表型的改变是相当类似的，最显著的特点是早期开花（图4）。早期开花型继承以自交后代。独立的后代显示表型变化，但每个试验最早的植物开花在35片叶，620厘米高之后，纯植物开花早于杂合子。温和型植株在510片叶，3050厘米高之后开花。转基因植株明显的表型总结与表一。核酸杂交分析证实了这些转基因植株在叶子和花中的表达（数据未显示）。没有野生型植物无论体外培养或种子培养在24片叶和115厘米高度之前开花的（表1）。早花烟草植物通常是较小且叶子为深绿色，就像野生型烟草花序的叶子。花的结构和花序组织看起来是正常的。所有的早花植物自交产生十分饱
21、满的种子而且这些早花表型稳定遗传到后代。烟草植株接受不同桦木基因也显示出一些表型的差异。植物接受BpMADS3表现出短节间导致植物矮小（530厘米，表1），强大的表型产生的花序布满每一个腋芽（条）。植物接受BpMADS4有小，窄，深绿色的叶子和纤细灵活的茎节间（图4）。植物表达BpMADS5相比BpMADS3和BpMADS4植物或多或少处于中间状态。图4、转基因烟草植株桦树基因异位表达BpMADS3和BpMADS4 。A：早期开花BpMADS4表达烟草植物（左）和旧野生型对照植株（右） 。 B：典型的初花期BpMADS3 - 表达烟草（ T1 ）花序芽增长早期的叶腋。这种植物的高度在10厘米时
22、，第一朵花开放。 C：典型的初花期BpMADS4表达烟草（ T1 ）修长的外观。表格 一 、烟草植株不同基因BpMADS3, BpMADS4 和 BpMADS5表达的表型讨论在这里我们阐述了从桦树得到的MADs-box的3个基因的克隆，BpMADS3, BpMADS4 和BpMADS5，它们属于AP1/SQUA分支和AP1/AGL9的亚家族。不同成员的植物MADS - box基因家族编码的蛋白质具有高度相似类域。它们的功能像同源或异源二聚体和域，I区，以及K域似乎都参与形成二聚体（Huang 等，1996, Riechmann 等，1996）。I 区的第一个23个碱基的氨基酸在MADs蛋白家族
23、代表了各种不同的亚单位，它们暗示了功能的重要性。例如，根据我们的比较AP1/FUL基因序列共享了保守序列MEK:RILERYERYSY，而，例如，AG单位的成员共享序列的ANNSVK：RTIERYKKA（Purugganan等人，1995，Tandre等人，1995）。序列功能的重要性是由相当大的差异进一步支持的，甚至在AP1和AGL9的分支之间也就存在着巨大的差异。在高度相似的AP1和FUL的成员之间的最大差异似乎存在于K域的起始部分，尤其是在C -末端，可在诊断特异性序列时发现。这同样适用于AP3/PI域（Kramer等，1998），还可能涉及的运作的C -末端类似于AP1中的转录激活域（
24、Cho等人，1999）虽然在此研究的桦木基因序列非常相似，但是它们的表达是不同的。然而，它们，在雌性和雄性花序中都有表达，因此，他们不可能参与确定花的性别。在冬天休眠期的花序的相关记录也明显说明了，这可能是花在春天的一个快速成熟的优势。系统发育分析，BpMADS3与AP1在一些主要区域相关（图2），这是为花分生组织的形成以及为发展萼片和花瓣所需要的（Mandel 等人，1992，gustafson-brown等人，1994，Mandel and Yanofsky，1995 b）。然而，相对于AP1，BpMADS3的表达似乎在后期阶段的花发展和种子发育过程中更强大（图3）。BpMADS4在花序发
25、育早期阶段强烈表达（图3）。BpMADS4类似拟南芥基因FUL，核糖核酸在花序分生、枝和茎叶组织积累，在花形成的最初阶段被排除在花分生组织（曼德尔和亚诺夫斯基1995年）。FUL似乎在维护花分生组织的特异性和连同AP1和CAL调控花序结构（ferrandiz等人，2000）。正常的茎叶果实发育也需要FUL（Gu等人，1998）。芥基因的Sa-MADSB似乎与FUL有密切的同源性及类似的表达模式（Menzel等人，1996）。一些系统遥远的MADS - box基因，AGL12，AGL14和AGL17像BpMADS4一样在根部表达，但在对比BpMADS4，他们不在花序表达（Rounsley等人，1
26、995）。在序列水平，BpMADS5与BpMADS4是相当类似的，但比起BpMADS4更接近FUL（图2）。BpMADS5主要是在早期发展的花序表达（图3），而不是植物营养组织。这可能是重复一个祖先FUL基因谱系导致双功能基因，BpMADS4和5，都没有保留所有原始FUL的功能。不过，早期的表达表明这两个基因的表达可能像FUL一样已经在花序分生组织发挥作用。（Mandel and Yanofsky ，1995年）该分离基因的功能无法通过与比较类似的基因和其他植物或由核糖核酸凝胶印迹分析准确预测。整个花序已采取核糖核酸凝胶印迹分析，包括轴以及表，其中包括相当大的比例的白桦花序和复杂的表达数据的阐
27、释。BpMADS3，4和5在烟草植物的异位表达导致非常早期开花，这是一致的概念，它们可能在确定改变植物花序或花分生组织发挥作用。在烟草中表达桦树基因，花结构和花序仍然不受影响。BpMADS3，4和5在拟南芥中的异位表达也导致提早开花以及终端花的结构（A. Elo, J. Lemmetyinen, T. Teeri and T. Sopanen，未公布的数据），表型与所描述的拟南芥植物十分相似（Mandel and Yanofsky 1995b）。此外，开花时间拟南芥植物在35S启动子的引导下表达FUL基因使开花时间缩短（ferraLEAFY的组成型表达诱导一个单一的，异常终端花在烟草早期发展和
28、在杂交子中同样早但是花的发育异常（尼尔森和威格尔，1997）。加速开花品种以在烟草植物获得，例如，超级NSMADS2，烟草同源基因AP1（Jang等人，1999）和通过异位表达的水稻AGL9同源的基因OsMADS2（Chung等人，1994），但通过桦木基因加速开花似乎更合理。因为植物器官特征基因像AP3和PI在组成型表达时可以减少时间而至开花（Krizek 和 Meyerowitz，1996），在超标达的基础上可以初步预测功能。由于早花烟草植株肥沃，这些基因看起来似乎可以在植物物种多样性中用来加速开花。我们未发表的结果表明，BpMADS4异位表达在早花桦树BPM2 和BPM5中可大大加快开花（lemmetyinen等人，1998），同时也表明，这种基因可以在林木上减少到达开花的时间。这将大大加快育种。致谢与参考文献略本文出自PHYSIOLOGIA PLANTARUM 2001,112: 95103.
