1、5细胞与TdT标记液37孵育，时间12h。6PBS轻洗1次。7细胞在黑暗中37与100l的染色缓冲液孵育30min。8含0.1 Triton-X 100的PBS轻洗1次。91ml PBS（含5mg/ml PI, 0.1% RNase A）重悬。10 流式细胞仪分析红色（PI）对绿色荧光（FITC）的地形图。3）ISNT的流式细胞仪分析1离心收集细胞，PBS洗12次4PBS轻洗1次。52105细胞与12.5l的缺口平移缓冲液在15共孵育6h，每过15min振动1次。二、非固定细胞的染色方法1）Hoechst 33342/PI双染色法1悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342，终浓
2、度为1g/ml；帖壁生长的细胞用含有0.02EDTA的0.25胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用1ml全培养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为1g/ml，37孵育710min。24 5001000r/min离心弃去染液。3加入1.0ml PI染液，4避光染色15min。4400目的筛网过滤1次。5流式细胞仪分析。2）Annexin V/PI双染色法1细胞收集：悬浮细胞直接收集10ml的离心管中，而帖壁细胞先用滴管轻轻吹打，调亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到10ml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02的EDTA消化使之脱壁，每样本细胞数为（15）106，5001000r/m
3、in离心5min弃去培养液。2用孵育缓冲液洗1次，5001000r/min离心5min。3用100l的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育1015min。45001000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。5加入荧光溶液4下孵育20min，避光并不时振动。流式细胞仪检测细胞凋亡:PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改
4、变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死
5、细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。试剂与仪器 PBS溶液； PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4避光保存。 70%乙醇 400目筛网 流式细胞仪实验步骤1. 收集细胞数目约（1 5）106个/mL，500 1000 r
6、/min离心5min，弃去培养液。2. 3mlPBS洗涤1次。3. 离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4，12小时。4. 离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。5. 400目的筛网过滤1次，5001000r/min离心5min，弃去PBS。6. 用1mlPI染液染色，4避光30min。7. 流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。8. 结果判断：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关
7、；在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别为0.35和0.7，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。注意事项细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。Heochst 33342/
8、PI双染色法经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性下降。细胞一经固定就不再是活细胞，而且细胞固定过程对细胞膜的通透性也有影响。因此发展了用“细胞活性”鉴定染料染色的流式细胞仪检测方法。这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色，且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多。流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高，Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡
9、细胞膜通透性发生改变有关，凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。此外，还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染，坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色。根据这些
10、特性，用Hoechst 33342结合PI或EB等染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI+）。. Heochst 33342 染液：用PBS配成10ug/ml的储存液浓度，4避光保存；. PI染液 ：用PBS配成5ug/ml浓度，4避光保存。. 400目的筛网. 流式细胞仪1. 悬浮生长的细胞在培养的状态下加
11、入Heochst 33342 ，终浓度为1ug/ml； 37孵育710min。2. 低温500 1000r/min离心5min弃去染液。3. 加入1.0ml PI染液，4避光染色15min。4. 400目的筛网过滤1次。5. 流式细胞仪分析：Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光，激发光波波长为352nm，发射光波波长为400 500nm，产生兰色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。6. 结果判断：在兰色荧光对红色荧光的散点图上，结果为：正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光
12、/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。1. 在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。2. 用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。Annexin V/PI双染色法细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细
13、胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法
14、。 孵育缓冲液：10mmol/L HEPES/NaOH，PH 7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl2 标记液：将FITC- Annexin V（宝灵曼公司产品）和PI加入到孵育缓冲液中，终浓度均为1ug/ml1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为（15）106，/mL5001000r/min离心5min，弃去培养液。2. 用孵育缓冲液洗涤1次，5001000r/min离心5min。3. 用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育1015min。4. 5001000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。5. 加入荧光（SA-F
15、LOUS）溶液4下孵育20min，避光并不时振动。6. 流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。7. 结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞
16、，显现（FITC+/PI-）。细胞凋亡的检测方法一、TUNEL法 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。T
17、UNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。二、Caspase-3活性的检测 Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和
18、两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶poly（ADP-ribose）polymerase，PARP等的裂解。方法：收集细胞PBS洗涤抽提细胞裂解液蛋白定量SDS-PAGE电泳硝酸纤维素膜或PVDF膜转移5%脱脂奶粉封闭，室温1.52h或4C过夜Caspase-3多抗或单抗室温反应12h或4C过夜TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，510min/次H
19、RP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应12h TBS-T洗3次， 510min/次?ECL显影或NBT/BCIP显色。结果：图12 荧光分光光度计分析原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。收获细胞正常或凋亡细胞。PBS洗涤。制备细胞裂解液。加Ac-DEVD-AMC（cas
20、pase-3四肽荧光底物）。37C反应1h。荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。图23 流式细胞术分析收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?加Ac-DEVD-AMC?C反应1h?UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。 结果：图3三、细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜（1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。（2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块
21、状和凋亡小体等典型的凋亡形态。2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342 （Hoechst 33342），HO 33258 （Hoechst 33258）, DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10 ug/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10
22、ug/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；b期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体（图4）。 3 透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构（图2）；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。图4 四、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析 TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导
23、的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的*之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期
24、所发生的*，提供了一种新的技术和指标。（一）TFAR19蛋白的细胞定位分析材料试剂：FITC标记的单克隆抗体，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，荧光细胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip头，移液器。仪器：低温水平离心机, 37C水浴箱，荧光显微镜，共聚焦激光扫描显微镜，流式细胞计1 悬浮细胞的染色：（1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.51106），PBS洗2次，1000rpm10min。（2）3%多聚甲醛冰浴1
25、0min，PBS洗2次，1000rpm10min。（3）加入PBS-T溶液，37C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm10min。（4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。（5）加入5ml FITC标记的TFAR19单抗（终浓度为1：40），4C反应30min（6）荧光细胞洗液洗2次，1000rpm10min。结果观察：将细胞沉淀滴片，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。图52：贴壁细胞的原位染色（1） 贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到50%80%满
26、时，凋亡诱导剂处理细胞。（2） 将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。（3） 将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ml）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。结果观察：图133：临床病理切片的染色、检测。4：原代细胞的培养、检测。5：分析TFAR19蛋白在人体内各组织器官的分布及定位（二）TFAR19蛋白的表达与临床疾病1 ELISA法检测正常人和疾病状态下，以及疾病的不同时期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗体水平。材料和试剂：1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸盐Buffer2. 洗涤液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 203. 封闭液： 3%BSA（用洗涤液配制）4. 酶标抗体的稀释：用封闭液稀释5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g柠檬酸 0.51g DDW 100ml6. 显色液（现配现用）：底物Buffer 10mlOPD 2mg30% H2O2 2ml7. 终止液 2Mol/L H2SO48. 重组人TFAR19,
