1、这种物质，称为荧 光素。由光激发所引起的荧光，为光致荧光；由化学反应所引起的荧 光，为化学荧光。四、荧光素的荧光特性：1）停止供能，荧光现象随即终止2）对光的吸收和荧光的发射具高度选择性入射光波长 发射光波长3）荧光效率：荧光效率 =发射荧光的光量子数 / 吸收光的光量子数4）荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱五、常见荧光素：1）异硫氰酸荧光素 （fluorescein isothiocyanate, FITC）FITC 纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种 异构体，其中异构体I型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更 优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490
2、495nm,最大 发射光波长为520530nm呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干 燥处可保存多年， 是目前应用最广泛的荧光素。 其主要优点是人眼对 黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。（2）四乙基罗丹明（rhodamine, RB200） : RB200为橘红色粉末,不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光 波长为570nm,最大发射光波长为595600nm,呈现橘红色荧光。3）四甲基异硫氰酸罗丹明 （tetramethyl rhodamineisothiocynate, TRITC）: TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末,较稳定。最大吸收光波长为5
3、50nm,最大发射光波长为620nm,呈现 橙红色荧光，与 FITC 的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记 或对比染色。因其荧光淬灭慢,也可用于单独标记染色。（4）镧系：镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范 围窄,荧光衰变时间长,最适合用于分辨荧光免疫测定。（5）藻红蛋白（P-Phycoerythrin ，P日：PE是在红藻中所发现 的一种可进行光合作用的自然荧光色素， 分子量为240kD的蛋白，最 大吸收峰为564 nm,当使用488 nm激光激发
4、时其发射荧光峰值约为576 nm对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用 585 21 nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用 575 13nm的带通滤光片。FL2探测器检测P吕6）多甲藻叶绿素蛋白 （ Peridinin chloroPhyll ProteinPerCP : PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为35kD,最大激发波长的峰值在490nm附近, 当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为 677nm FL3探测器检测 PerCP。7）碘化丙啶（ propidium iodide ，PI ）：可选择性地嵌入核酸（DNA RNA的双
5、螺旋碱基对中。在对 DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA寸DNA荧光定量精度的影响。在488nm波 长激发下， PI 的发射光谱为 610-620nm。 FL2 探测器检测 PI。常见荧光素的特性：（1）FITC:黄色结晶粉末，吸收光：490-495nm发射光：520530nm明亮的黄绿色荧光。（2） RB200橘红色粉末，吸收光570nm发射光595600nm橘红色荧光。TRITC:紫红色粉末，吸收550nm发射光620nm橙红色荧光。镧系： Eu、TbPE:吸收光490560nm 发射光595nm,红色荧光。其它：酶作用后产生荧光物质。酶作用后产生荧光物质：酶 底物 产
6、物 激发光 发射光B-G MUG MU 360 450AP MUP MU 360 450HRP HPA 二聚体 317 414酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶 作用便形成具有强荧光的物质。例如，4-甲基伞酮-B -D半乳糖苷受B -半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm发射光波长为450nm其他如碱性磷酸酶的底物4-甲 基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。 镧系螯合物 某些 3 价稀土镧系元素如铕 （Eu3+） 、铽 （Tb3+） 等的螯合物可发射 特征性的荧光，而且激发光波长范围宽、发射光波长范围窄、荧光衰 变时间长，
7、最适合于时间分辨荧光免疫测定。六、合适荧光素的选择：1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。荧光效率高，标记后下降不明显。荧光色泽与背景色泽对比鲜明。标记后能保持生物学活性和免疫活性标记方法简单、快速。安全无毒CDC 实验一. 实验原理细胞表面抗原与相应的抗体（lgG13或IgM）特异性结合形成的 免疫复合物，可通过经典途径激活补体形成攻膜复合体而导致细胞膜二. 实穿孔。因此，水溶性染料如台盼蓝可进入受损细胞，染成蓝色，为阳 性反应；不带抗原的细胞，未损伤，不染色，为阴性反应。验步骤1.胸腺细胞悬液制备 颈椎脱臼法处死小鼠J暴露胸腔，分离出胸腺J镊子夹住胸腺反复轻轻研磨J单个细胞PBS 洗2次，
8、lOOOrpm, 10minJ加入5%J、牛血清PBS制备细胞悬液 调节细胞浓度至3-4 X 107/ml3.结果判断细胞膜穿孔的细胞呈蓝色， 细胞膜完整的活细胞不着色。 细 胞毒性作用的判断标准如下： 阴性反应 （ ） 死细胞占 0-10% 可 疑阳性反应 （ ） 死细胞占 11-20% 弱阳性反应 （ + ） 死细胞占21-50% 阳性反应 （ + ） 死细胞占 51-80% 强阳性反应 （+ ） 死 细胞占 81-100%4.结果记录1. 表格记录2. 照片展示5.讨论.第组成阳性的原因：实验中加入抗原、抗体、补体、 LG抗原抗体能形成抗原抗体免疫复合物， 通过经典途径激活补体， 形成攻
9、 膜复合物，从而导致细胞膜穿孔，细胞受损，台盼蓝进入细胞，染成 蓝色，呈阳性反应。说明CDC实验必须要有抗原、抗体、补体共同参 与。.第组成阴性的原因：实验中加入抗体、LG因为无抗原和补 体，不能形成抗原抗体免疫复合物，也无补体，因此不能形成攻膜复 合物，不能使细胞膜穿孔，细胞无损伤，台盼蓝无法进入细胞，不能 被染成蓝色，呈阴性反应。说明 CDC实验必须要有补体的参与。.第组呈阴性的原因：试验中加入 LC和补体，因为无抗原抗体，所以没有抗原抗体免疫复合物的形成，补体不能被激活，不能形 成攻膜复合物，细胞无受损，台盼蓝不能进入而不被染色，呈阴性反 应。说明CDC实验必须要有抗原、抗体的参与。.第
10、组呈阴性的原因：实验中只加入 LC,既无抗原抗体免疫复合物的形成，也无补体，细胞无受损，台盼蓝不能进入而不被染色， 呈阴性反应。说明CDC实验必须要有抗原、抗体、补体的共同参与。免疫学诊断技术军事医学科学院附属医院 陈建魁主要内容：第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 抗原抗体反应 免疫学检测常用标记技术 免疫细胞的检测 免疫分子的检测 免疫相 关基因的检测 免疫学检测方法的应用第一节 抗原抗体反应抗原抗体反应 : 抗原与相应抗体在体内或体外发生的 特异性结 合反应。 应用已知抗体或抗原检测抗原或抗体，可以对感 染性、非 感染性致病因子或疾病相关因子进行诊断或辅助 诊断。1 、特异性
11、 2 、适合比例性 3 、可逆性抗原抗体反应的特异性：一种抗原一般只能与由它刺激所产生的抗体结合， 这种 抗原抗体 结合反应的专一性即特异性。 抗原抗体结合力的大小，常用亲和力（affinity） 或亲合 力 （avidity） 来表示。 亲和力是指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原 决定基之间的结合强度。 亲合力是指 整个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。适合比例性:抗体含量抗原含量前带等价带后带在抗原抗体特异性反应时，当抗原与抗体达到最适比例时，沉淀物形成 最多。如果抗原或抗体极度过剩则无沉淀物形成，这种现象 称为带现象。 出现在抗体过量时，称为前带。在抗原过量时，称为 后带。抗体过剩
12、抗原抗体比例合适抗原过剩网格学说（ lattice theory ）可逆性：Ag+AbK （亲和常数）Ag Ab抗原抗体反应的影响因素1、电解质浓度2、酸碱度（pH: 68） 3、温度（3742C）抗原抗体反应类型：根据抗原性质、出现结果的现象、参与反应 成分的不同，可将抗 原抗体反应分为： 凝集反应 沉淀反应 补体参加的反应 采用标记物 的抗原抗体反应等颗粒性抗原 （ 细菌、红细胞等 ） 与相应 抗体结合后形成凝集团块， 这一类反应称 为凝集反应 （agglutination） 。该类反应 可检测到ug/ml 水平的抗体。1. 直接凝集反应细菌或红细胞 等颗粒性抗原抗体2. 正向间接凝集反应
13、载体颗粒可溶性抗原 例如，用丫球蛋白包被的胶乳颗粒，检测病人血清中 的 抗人丫球蛋白的抗体（类风湿因子）。3. 反向间接凝集反应可溶性抗原可溶性抗原 （ 如：血清蛋白质、 细胞裂解 液等）与相应抗体结合后 出现沉淀物，此类反 应称为沉淀反应 （precipitation）液相沉淀反应絮状沉淀反应 环状沉淀反应抗血清 抗原 + 抗原 抗体 +免疫比浊法：在定量抗体中分别加入不同浓度的抗原， 经一定 时间后可形成免 疫复合物。 用浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越 多，浊度 越高，可根据标准曲线计算出样品中的 抗原含量。 该法快速简便， 可取代免疫扩散法测定 Ig 含量。凝胶内沉淀反应免疫扩散
14、技术 免疫电泳技术火箭电泳 单向扩散试验 对流电泳 双向扩散试验 免疫电泳Ag Ab Ag第二节 免疫学检测常用的标记技术免疫标记技术 （immunolabelling technique） 是指用荧光素、 放 射性核素、酶、发光剂或电子致密物质 （ 胶体金、铁蛋白 ） 作为示踪 剂标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。 此类方法具有灵敏、 特异、 快速，能够定性、定量甚至 定位测定，结果易于观察、适合自动化 检测等很多优点。广 泛用于各种生物活性物质的分析鉴定与定量检 测。根据标记物与检测方法不同，标记 技术可分为 :免疫荧光技术 放射免疫测定 免疫酶标技术 发光免疫分析 免疫 金标记技术主要的
15、免疫标记物类别 荧光素 标记物 FITC、 藻红蛋白（ PE） 用途 免疫组化 免 疫分析测定 放射性核素 酶 3H、51Cr、32P、 125I 、131I免疫分析测定 免疫组化 免疫分析测定HRP 、AP化学发光物 Luminol 金属颗粒 胶体金用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检 标本中的抗原反应， 抗原抗体复合物散发荧光， 借此对标本中的抗原作鉴定和定位。（ 一） 免疫荧光显微技术1 直接荧光法：将荧光素直接标记抗体，作标本染色。优点 : 简 便易行。缺点 : 每检查一种抗原必须制备相应的荧光抗体。 2 间接 荧光法：首先用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素 标记的二抗 染色。 敏
16、感性高，制备一种荧光素标记的 二抗可用于多种抗 原的检查。缺点：非特异性荧光容易增多。 3 补体结合免疫荧光法 行 示踪。 在抗原-抗体反应时加入补体， 使之 与抗原-抗体复合物结合； 再用荧光素标记的抗补体抗体进直接法间接法补体法双标记法（ 二）流式细胞术 （flow cytometry ，FCM）免疫荧光技术应用于流式细胞仪 , 可对细胞的表面标 志（ 抗原或 受体） 进行快速、精确的分析和自动检测 , 并可将不同类型的细胞分 选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA RNA蛋白 质和细胞体积等 ） 进行多信息分析，是生命科学研究 领域广泛应用的一项 新技术。（ 三） 荧光免疫测定
17、 （fluoroimmunoassay ，FIA）1.荧光偏振免疫测定： （fluorescence polarization immunoassay，FPIA） 荧光物质经偏振光蓝光照射而跃入激发态，在 恢复至基态 后可释放出光子，经偏振仪形成偏振光，测定其强度可 得到样 品中待测物质的浓度。 主要用于小分子物质 （ 特别是药物浓 度）的测定。2. 时间分辨荧光免疫测定 （time-resolved fluoro -immunoassay，TR-FIA） 镧系稀土元素具有较长的荧光寿命， 用其标 记抗原或抗体， 并利用时间分辨荧光分析仪延缓 测量时间，可以消除非特异性本底 荧光的干扰， 所得
18、信号完全是特异荧光， 此法灵敏度高、特异 性好。3. 酶联荧光免疫测定 （enzyme linked fluoro -immunoassayELFIA） 应用具有潜在荧光的物质作为酶的底物， 经过酶解反应产生 高强度荧光，可用荧光仪进 行定量测定。放射免疫测定法 （radioimmunoassay,RIA） 是 用放射性核素标记 抗原或抗体进行免疫学检测的 技术。将放射性核素的高灵敏性和抗原抗体反应 的特异性相结合 ,使检测的敏感度达 pg/ml 水平。 常用 的放射性核素有 125I 和 131I 。常用于微量物质 测定，如胰岛素、 生长激素、甲状腺素、孕酮等 激素，吗啡、地高辛等药物以及
19、IgE等。三、免疫酶标技术以酶标记抗体 （ 或抗原）用于免疫学检测，通 过酶催化底物显色， 对细胞或组织标本中的抗 原- 抗体复合物进行定位、 定性分析； 亦可 根据 酶催化底物显色的深浅程度， 定量测定体液中抗 原或抗体的含 量。（ 一）酶免疫组织化学技术 （enzyme immunohistochemistry,EIH）通过酶解底物、显色来示踪抗原抗体结合物的存在部位。 酶免组化 染色标本可在普通光学显微镜下观察， 并能长期 保存。 辣根过氧化 物酶的底物二氨基联苯胺（DAB）的分解产物适 于电镜观察。 常用的 方法：亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法（avidin - biotin -
20、peroxidase plex ，ABC），过氧化物酶-抗过 氧化物酶法（PAP）和碱 性磷酸酶 -抗碱性磷酸酶法 （APAAP）。（二）酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA） 1.非均相酶免疫测定（heteroge neous en zyme immuno assay） 根据是否使用固相支持物作为吸附抗体（或抗原）的载 体，可分为固相EIA和液相EIA两类方 法。其检测的敏感度 达ngpg/ml水平。常用的固相EIA法是酶联 免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA），此法以聚苯乙烯制品或NC膜等作为固相载体。（1）
21、双抗体夹心法：用于检查特异抗原。首先将已知抗体 包被在 酶联板上，加入待检标本，标本中若含有相应 抗原即与固相上的抗 体结合，洗涤去除未结合成分， 加入抗原特异的酶标记抗体，洗去 未结合的酶标记抗 体，加底物后显色。一般而言，包被抗体和酶标 记抗 体是识别同一抗原上的不同抗原决定基的 2 种抗体。（2） 间接法：用于检查特异抗体。用已知抗原包被 固相，加入待 检血清标本，再加酶标 记的二抗，加底物观察显色反应。免疫印迹法 （Immunoblotting） ： 它将凝胶电泳与固相免疫结合， 是把电泳分区 的蛋白质转移至固相载体， 再用酶免疫、 放射 免疫等 技术测定。 此法能分离不同分子大小的蛋
22、白质并确定其分 子量，常 用于检测病毒的抗体或抗原。免疫 PCR（immuno-PC，RIM-PCR） 是将免疫反应的特异性与 聚合 酶链反应（PCR）的敏感性相结合的免疫学检测技术。首先用连接分子（如biotin） 将DNA分子连接到抗体上；然后与吸附在固相载体上的待测抗原结合，形成抗原 -抗体-DNA复合物；然后用特异性引物对 DNA&行PCRT增，检测其 扩增产物，可 定量测定与DNA标记抗体相对应的抗原。该法与ELISA基本相似, 不同的是用DNA标记代替了酶标记，通过观察PCR扩增产物来判定结果。2.均相酶免疫测定 （homogeneous enzymeimmunoassay， HE
23、I） 将 待测样品、酶标试剂和底物溶液混合， 待 抗原-抗体反应完成即可直 接测定结果，整个检 测过程都在均匀的液相中进行。四、发光免疫技术发光免疫测定 （luminescence immunoassay ， LIA） 是将发光系统 与免疫反应相结合，用于检测抗 原或抗体。1. 化学发光免疫测定 （chemiluminescenee immunoassay ， CLIA）以化学发光剂 （ 如鲁米诺、吖啶酯等 ） 标记抗体或 抗原，免疫反应完成后，直接引发化学发光反应进行 检测。 2. 生物发光免疫测定（bioluminescence immunoassay ，BLIA） 利用生物发光物质 （
24、如萤火 虫荧光素）或参与生物 发光反应的辅助因子（如ATR NAD等）标记抗原或抗 体，利用生物发光反应进行检测。3. 化学发光酶免疫测定 （chemiluminescence enzymeimmunoassav，剂，通过化学发光反应进 行检测。 4. 电化学发光免疫测定 （ECLIA） ， 该法是在电极表面由 电化学引发的特异性化学发光反应。化学电化学发光（electrochemiluminescenee ，ECL）是在电极表面引 发的特异性化学发光反应，包括电化学和化学发光两个过程。发光剂三联吡啶钉Ru（bpy）32+和三丙胺（TPA）在阳电极表面同时 各失去一个电子发生氧化反应。 二价的
25、 Ru（bpy）32+ 被 氧化成三价， 后者是一种强氧化剂。可将TPA氧化成阳离子自由基TPA+*，后者很 不稳定，自发地失去一个质子（H刃，形成自由基TPA*,这是一种 非常强的还原剂。可将三价的 Ru（bpy）33+ 还原成 激发态的二价Ru（bpy）32+* 。接着激发态的 Ru（bpy）32+* 衰减成 基态的Ru（bpy）32+，同时发射一个波长620nm的光子。TPA*自身被氧化成二丙胺和丙醛。 这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多 光子，使光 信号得以增强。五、免疫金标记技术免疫金标记技术 （immunogold labelling technique） 是以胶体金 作为
26、示踪标志物用于抗原抗体反应检测。 胶体金标记的抗体可直接 用于检测细胞表面和组织切 片中的抗原或受体，并可在普通光学显 微镜下观察， 称为免疫金染色法 （immunogold staining ， IGS）。 在IGS 的基础上，可用银离子增强免疫金标记技术的敏 感性，称为免疫金银染色法 （immunogold silver staining ， IGSS）。第三节免疫细胞的检测一、免疫细胞的分离与纯化（一）白细胞的分离 血液中红细胞与白细胞的比例约为 600 1000:1 ，两类细胞 比重（ 密度）不同，沉降速度各异，可采用下述方 法分离。 1. 自然沉降法 : 采用肝素抗凝静脉血，由于红细
27、胞的沉降 率 较快，可使白细胞与之分离。 2. 高分子聚合物加速沉降法 某些 高分子聚合物 （ 如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等 ） 可使红细胞呈 钱串 状凝聚，加速其沉降，从而更易与白细胞分离。（ 二） 外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞 （peripheralblood mononuclear cell,PBMC） 指淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.0751.090 ;红细胞和多核白 细 胞的密度为1.092左右；血小板为1.0301.035。因此，利用等渗 溶液进行密度梯度离心， 可分离不同类别的细胞。 1. 聚蔗糖-泛影葡 胺（ficoll-hypaque ，F-H）
28、法：将聚蔗糖和 泛影葡胺配制成密度为1.077 的分层液，将肝素抗凝血加在 分层液上，离心后形成不同层 次的液体和细胞区带，从而分离出PBMC分离动物MNC勺分层液 密度:大鼠 1.0841.087 ，小鼠 1.0802.Percoll 分层液法: Percoll 是经聚乙烯吡咯烷酮 （PVP） 处理的 硅胶微粒混悬液，对细胞无毒、无刺激性。 （1） 连续密度梯度离心 法： Percoll 混悬液的硅胶颗粒大 小不一，经过高速离心后，使分 层液形成一个从管底到液 面密度逐渐递减的连续密度梯度，可将密 度不等的细胞分 离纯化。 （2） 不连续密度梯度离心法：将 Percoll液和 Hanks 液
29、配制 成不同浓度的分离液，将分离液按浓度大小依次 叠加至离 心管中，形成不连续密度梯度分离液，用于分离PBMC悬液 的各细胞组分。（ 三） 淋巴细胞的纯化与亚群分离PBMC 悬液主要含淋巴细胞， 但还混杂有数量不等的单核细胞、 粒 细胞、红细胞和血小板。为获得高纯度的淋巴细胞或其 亚群，可采 用如下分离方法。 1. 去除红细胞 : 用无菌蒸馏水低渗裂解或 0.83%氯化铵处理。2.去除血小板：离心洗涤，可去除PBMC中绝大部分混 杂的血小板。 采用胎牛血清（FCS）梯度离心法去除血小板。FCS可让PBMCi过，而阻止血小板通过。3.去除单核细胞和粒细胞 （1） 黏附法：单核细胞和多核白细胞具 有黏附能力，可与玻璃、塑料或Sephadex作用，采集的非黏附细 胞 即为淋巴细胞。 （2） 羰基铁粉吞噬法： 单核细胞吞噬羰基铁粉后细胞 密度增大， 经聚蔗糖 -泛影葡胺密度梯度离心； 或待 单核细胞充分吞 噬羰基铁粉后，用磁铁将细胞吸至 管底，上层液中即含较纯的淋巴 细胞。
