1、复习重点试题临床微生物检验1绪论，1.细菌的发现者：安东尼范列文虎克，1665年，列文虎克研制出了第一台显微镜，1675年，通过显微镜看到了细菌。法国的化学家、微生物学家巴斯德：“曲颈瓶实验”建立了病菌学说；创立了巴氏消毒法；研制了鸡霍乱杆菌、炭疽杆菌减毒菌苗、狂犬疫苗。德国的细菌学家郭霍：发明了固体培养基，并创立了细菌染色法；创立了实验动物感染方法。英国细菌学家亚历山大弗莱明发现了青霉素2.微生物：是存在于自然界的一大群形体微小、结构简肉眼直接看不见，必须借助光学显微镜和电子显微镜放大数百至数万倍才能观察到的微小生物。按照微生物的大小、结构和组成分类：原核细胞型微生物（细胞核无核膜、核仁，呈
2、环状裸DNA结构，包括细菌、放线菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体）真核细胞型微生物（细胞核分化程度高，有核膜、核仁，细胞器完整，包括真菌和原虫）非细胞型微生物（仅有一种核酸类型，包括病毒、亚病毒、朊粒）根据微生物与人类的关系分类：正常菌群：定居在人类皮肤和黏膜上的各类微生物，在正常情况下无害，而且具有拮抗外来病原微生物和提供某些营养物的作用。 条件致病微生物：原属正常菌群中的细菌，由于机体抵抗力下降、寄居部位改变或寄居微生物丛平衡失调，能引起内源性感染。病原微生物：指少数能引起人类和动、植物致病的微生物。3.微生物学：是生物学的一个分支，它是研究微生物的类型、分布、形态结构、生命活动及规律
3、、遗传、进化以及与人类、动物、植物等相互关系的一门学科。随着其研究的深入，形成了很多分支学科。4.医学微生物学：是研究与医学和疾病有关的病原微生物的生物学特性、致病性、免疫性以及特异性诊断和预防治疗措施的学科。5.临床微生物学的性质和任务：1.研究感染性疾病的病原体特征2.提供快速而准确的病原学诊断3.指导临床合理使用抗菌药物4.对医院感染进行监控6.临床微生物检验的思路与原则：1.确保分析前质量2.全面了解机体的正常菌群3.保证检验过程中的质量4.采用三定一结合（定性、定量和定位，结合病情）5.重视和加强与临床的联系第一章1.生物安全：采用微生物学技术、安全设施、保护设备,防止实验室工作人员
4、、环境及公众暴露于实验室中处理储存的已知或潜在的感染性微生物。2.实验室生物安全：描述防止实验室发生病原体或毒素意外暴露及释放的原则、技术及实践。3.获得性感染主要是由于处理感染性物质时的操作不当造成的。4.危险度评估是生物安全的核心。5.生物安全基本设备：生物安全柜和个人防护设备6.实验室生物安全保障：指单位和个人为防止病原体或毒素丢失 被窃、滥用、转移或有意释放而采取的安全措施。7.生物恐怖：是指使用致病性微生物或毒素等作为袭击手段, 通过一定的途径散布危险因子，造成疾病的暴发、流行，导致人群失能和死亡。8.消毒（disinfection）：通过物理或化学方法去除或杀灭大多数微生物的过程。
5、 灭菌（sterilization）：通过物理或化学方法杀灭或去除所有微生物的过程。消毒灭菌技术包括：热力（湿热灭菌和干热灭菌）、化学（液体或气体）、辐射（辐射和紫外线）、过滤技术。 9.医院感染的定义：医院感染又称医疗机构相关感染。指病人入院时不存在也不处于潜伏期而在住院期间发生的感染，同时也包括在医院内感染而在出院后发病的感染。医院感染的分类：外源性感染：交叉感染和医源性感染；内源性感染：又称自身感染10.常见医院感染：泌尿道感染最常见：与留置导管有关、 呼吸道感染、外科伤口感染、血流感染占医院感染的小部分，但是最重要的院内感染，近年来日益增加、其它：烧伤、皮肤和软组织感染，眼和结膜感染、
6、子宫内膜炎、产后生殖道感染，胃肠炎、肝炎等 。第二章1.标本采集的一般原则：1无菌采集（标本部位和盛放容器）2早期采集3根据目的菌的特性用不同方法采集4采集适量标本5安全采集2.临床常见采血指征 ：1发热（38C）或低温（36C） 2寒战 3白细胞增多（计数大于12，000109/L，特别有“核左移” 未成熟的或杆状核的白细胞） 4粒细胞减少（成熟的多核白细胞1cmX1cm）结晶紫染色1min，水洗甩干 加碘液媒染1min，水洗甩干加95%乙醇脱色30s，水洗甩干 用稀释复红或沙黄复染30s，水洗吸干后镜检临床意义：鉴别细菌 选择治疗用药 与细菌致病性有关4.培养基：由人工方法配置而成的，专供
7、微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。5.培养基的种类按物理状态分： 液体、半固体、固体培养基（高层、斜面、高层斜面、平板）按用途分：基础、营养、鉴别、选择和特殊培养基5.细菌的培养方法需氧培养法（37，1824h） 二氧化碳培养法：二氧化碳培养箱和烛缸法 厌氧培养法6.生化反应 （一）碳水化合物的代谢试验1.糖（醇、苷）类发酵试验（1）原理：不同细菌分解糖（醇、苷）的酶各异，代谢能力产物各不同，有的不分解，有的仅产酸，有的既产酸又产气，利用此特点鉴别细菌。（2）培养基：0.51.0%糖类等，内有指示剂。（3）方法：细菌接种糖发酵管，37、24h孵育后观察结果结果判断：有的细菌能分解某些糖产酸产
8、气（AG/+），有的只能产酸而不产气（A/+），有的则不能分解糖类（N/-）2. 葡萄糖代谢类型鉴别试验（O/F试验） 原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必需有氧分子参加，在无氧环境下不能分解葡萄糖，称为氧化型; 在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解，称为发酵型，此型细菌在有氧和无氧环境下都能分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。 培养基：H-L培养基（O/F 氧化-发酵培养基） 阴性杆菌指示剂为溴麝香草酚兰；阳性球菌指示剂为溴甲酚紫。 方法：2支试管，一支加灭菌的液体石蜡覆盖，使培养基与空气隔绝；另一支不加灭菌的液体石蜡，培养基暴露于空气中。35培养1824h后，观察结果 结果及应用：氧
9、化型细菌（O）仅在有氧环境中分解葡萄糖，在无氧环境中不分解，加液体石蜡不变色，不加液体石蜡变色；发酵型细菌(F)在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，两管均变色不利用型细菌(N)有氧或无氧的环境中都不能分解葡萄糖，两管均不变色产碱型细菌(K)开放管变蓝，封闭管不变色3.-半乳糖苷酶试验（ONPG）（1）原理：具有-半乳糖苷酶的细菌，可分解邻-硝基酚- -D-半乳糖苷（ONPG），生成黄色的邻-硝基酚，在很低浓度下亦可检出。（2）试剂：0.75M ONPG溶液（3）方法：取纯化菌落于0.25ml无菌生理盐水中，制成浓的菌悬液，加入一滴甲苯使酶释放，375min，再加入等量的ONPG溶液，水浴20mi
10、n-3h观察结果。（4）应用：迅速或迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定a 细菌分解乳糖需要两种酶，一种是半乳糖苷渗透酶，可是乳糖通过细菌的细胞壁进入菌体内另一种是-半乳糖苷酶，可将乳糖分解成半乳糖和葡萄糖，进而再分解。缓慢分解乳糖的细菌缺乏渗透酶，不能将乳糖快速运到细胞内所以需几天乳糖才能被分解。b 乳糖：葡萄糖和半乳糖通过-半乳糖苷键连接 ONPG：邻硝基酚取代了葡萄糖，其分子小很多可直接进入菌体内。4.七叶苷水解试验（1）原理：有的细菌可将七叶苷水解成七叶素和葡萄糖，前者与二价铁离子反应，生成黑色化合物（2）培养基：七叶苷培养
11、基、胆汁七叶苷培养基（3）方法及应用：肠球菌阳性，其他链球菌阴性5.甲基红试验（MR） 原理：细菌在代谢糖的过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸的代谢有两种途径，一种是丙酮酸进一步分解成甲酸、乙酸、乳酸等混合酸，使PH降低到4.5以下，加入甲基红试剂显红色（阳性）。如果酸进一步转化为其它物质（醇、酮、醛、气体和水），或丙酮酸按另一途径代谢，则PH仍保持在6.2以上，加入甲基红试剂呈黄色（阴性）。 培养基 ：葡萄糖蛋白胨水 方法：将待测纯菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育后加入甲基红试剂，立即观察结果。结果应用：大肠埃希菌阳性，产气肠杆菌阴性。6. V-P试验 原理 ：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮
12、酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化生成二乙酰，二乙酰再与培养基中精氨酸、肌酐等所含的胍基结合，形成红色化合物（胍缩二乙酰）。培养基：同甲基红试验方法：将待测纯菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育后加入V-P试剂，35放置1530分钟观察结果。 结果与应用: 同甲基红试验一起使用。甲基红阳性者V-P试验常阴性(二)蛋白质和氨基酸的代谢试验1.明胶液化试验（1）原理：细菌分泌的明胶酶（胞外蛋白水解酶）能分解明胶使明胶失去凝固能力而液化（2）方法：将待检菌接种于明胶培养基中， 35孵育24h到7日，每24h取出放入4 冰箱约30min以上，观察有无液化。（明胶的凝固点2
13、0 ，高于24 呈液化状态 ）（3）应用：a 肠杆菌科细菌鉴别b 厌氧菌鉴定c 非发酵菌鉴定常用2. 吲哚试验（靛基质试验）原理：具有色氨酸酶的细菌，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚（靛基质），吲哚与加入试剂对位二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚呈红色。培养基：蛋白胨水培养基方法与结果：将待测菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，35培养1824h，再在培养基中加入靛基质指示剂（对二甲基氨基苯甲醛），试剂与培养基两液面接触处呈红色为阳性，无色为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。3.硫化氢试验原理：有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，产生H2S，H2S与培养基中Fe2+（或Pb2+）反应生成黑色的硫化
14、亚铁或硫化铅方法：接种细菌，35培养1824h，呈现黑色沉淀者为阳性，无变化者为阴性应用：主要用于肠杆菌科细菌属与种的鉴定4.尿素酶试验原理：有些细菌能产生尿素酶，可分解尿素生成氨和CO2，氨在水液中形成碳酸铵，使培养基呈碱性方法：将待检菌接种于尿素培养基中，培养后出现红色为阳性，不变色（橙色）为阴性应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定5.苯丙氨酸脱氨酶试验原理：细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸氧化脱氨生成苯丙酮酸，后者与三氯化铁(10%)产生深绿色反应。培养基：已用色氨酸作为替代反应。（深褐色经久不退）方法与结果：将待测菌接种于苯丙氨酸琼脂斜面上（接种量稍大），培养后在斜面上直接
15、滴加45滴10%氯化铁试剂，出现绿色反应者即为阳性。注意应立即观察结果，延长时间会引起褪色。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定6.氨基酸脱羧酶试验 原理：细菌分泌的氨基酸脱羧酶，使氨基酸脱羧生成胺和CO2，培养基变碱而指示剂发生颜色变化。 培养基：氨基酸培养基和氨基酸对照培养基。 方法及结果：将待检菌分别接种于氨基酸脱羧酶培养基（含葡萄糖、精氨酸或鸟氨酸或赖氨酸，指示剂为溴甲酚紫）和氨基对照管（不加氨基酸），培养后观察结果。对照管为黄色，若培养基由黄色变为紫色为氨基酸脱羧酶试验阳性，若仅发酵葡萄糖显黄色者为阴性。测定管由淡桔黄变紫（溴甲酚紫）或由淡绿变蓝，而对照管黄色，则为阳性。 应用：主要用
16、于肠杆菌科细菌的鉴定（三）碳源利用试验枸橼酸盐（丙二酸盐）利用试验（1）原理：某些细菌能枸橼酸盐（丙二酸盐）为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，将其分解生成碳酸钠，使培养基变为碱性，指示剂溴麝香草酚兰由淡绿色变为深蓝色。（2）方法：将待测菌接种于枸橼酸盐培养基上，培养后观察。阳性淡绿色变为深蓝色。（3）结果及应用：主要用于肠杆菌科细菌属间的鉴定（四）各种酶类试验1. 氧化酶试验原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统中的最终呼吸酶。氧化酶首先使细胞色素C氧 化，然后氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色琨类化合物（二甲基为红，四甲基为蓝）。方法与结果： 1）滤纸片法 2）菌落法
17、3）试剂纸片法：制成干纸片，便于保存。为保证实验结果的准确性，应设阴、阳性对照菌株。阳性者立即出现红色，继而变为深红色至深紫色。应用： 1）奈瑟菌属阳性、莫拉菌属阳性的鉴定2）肠杆菌科阴性、弧菌科、假单胞菌阳性及其它非发酵菌的鉴别注意事项1.培养物应新鲜2.试剂应每周配制，空气中易氧化3.避免接触含铁物质4.不宜采用含葡萄糖的培养基上的细菌，因为葡萄糖发酵可抑制氧化酶活性2. 过氧化氢酶试验（触酶试验）原理：细菌分泌的过氧化氢酶，使过氧化氢分解成水和新生态氧，后者进一步形成氧分子出现气泡方法与结果：取洁净滤纸条，粘取被检菌菌落，滴加氧化酶试剂1滴于菌落上；或将试剂直接滴加在被检细菌的菌落上。阳
18、性者立即出现红色，继而变为深红色至深紫色。应用：主要用于革兰阳性球菌的初步鉴别注意事项 不宜用血平板上的菌落作试验，以免出现假阳性。不宜用陈旧的培养物，以免出现假阴性 需设阴（链）、阳（葡）性对照试剂需新鲜配制3.硝酸盐还原试验 （1）原理：某些细菌可将硝酸盐还原成亚硝酸盐，后者在与乙酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，形成重氮苯磺酸，在与萘胺合成红色的萘胺偶氮苯磺酸。（2）试剂：甲液：对氨基苯磺酸和乙酸，乙液： 萘胺和乙酸（3）结果：a 加入试剂后显红色阳性b 加入试剂后不显红色加入锌粉，显红色为阴性,不显红色为阳性4. DNA酶试验 原理：细菌产生的DNA酶，可使长链脱氧核糖核酸（
19、DNA）水解成寡核苷酸。因为长链DNA可被酸 沉淀，而寡核苷酸则溶于酸，所以当在长有产酶菌落的培养基上加酸后，由于DNA 已被水 解，菌落周围出现透明环。培养基：0.2% DNA琼脂平板方法与结果 ：于DNA琼脂平板上点种待测菌，培养后，在培养基上加入1mol/L的盐酸覆盖平板，观察结果。出现透明环者为阳性，无透明环为阴性。应用：用于金葡菌+的鉴定。 用于G杆菌的鉴定。（沙雷+、变形+）。5凝固酶试验原理：金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白。凝固酶有两种，一种是结合凝固酶，结合在细菌细胞壁上，可用玻片法检测；另一种是分泌到菌体外的游离凝固酶，可用试管法检测方
20、法：a.玻片法：取未稀释的兔血浆和生理盐水各一滴分别置于载玻片的两侧，挑取金黄色葡萄球菌少许分别混匀，立即观察结果。细菌在生理盐水中无自凝，菌液呈均匀混浊状态，为阳性；菌液聚集呈团块或颗粒状，为阴性b.试管法：3支洁净试管，各加入0.5ml 1:4稀释的血浆，在其中一只中加入0.5ml待检菌的肉汤培养液，另两只中加入0.5ml凝固酶阳性和阴性的菌株肉汤培养物做对照，37水浴箱中孵育14h后观察结果。细菌使试管内血浆凝固成胶冻状，为阳性；试管内血浆能流动、不凝固，则为阴性（24h后不凝固才报告阴性）。注意事项1）玻片法为筛选试验，阴、阳性结果均需进行试管法。2）血浆必需新鲜。3）应使用EDTA抗
21、凝血而非枸橼酸盐抗凝。有些凝固酶阴性的葡萄球菌和肠球菌可利用枸橼酸盐，使抗凝血再次凝固而出现假阳性结果。4）最好不用人血。存在潜在的感染因子和凝固障碍6.CAMP试验（1）原理：B族链球菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的溶血素溶解红细胞的活性，因此在两菌（B族链球菌和葡萄球菌）的交界处溶血力增加，出现半月形的溶血区。（2）培养基：血琼脂平板（3）应用：B族链球菌阳性，特异性鉴定（4）注意事项血平板的质量影响试验结果，因此每次需同时做阴、阳性对照。指示菌只能用ATCC25923，而不能用其它金葡代替：因为ATCC25923结果明显，其它金葡结果不典型，甚至出现假阴性结果。试验时必须将待测菌垂
22、直于指示菌划线接种，否则结果不典型。7.胆汁溶菌试验（1）原理：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，可能是胆汁降低了细菌细胞膜表面的张力使菌体裂解，也可能是胆汁加速了肺炎链球菌的自溶过程。（2）培养基：10%去氧胆酸钠或纯牛胆汁（3）方法：平板法 3530min 试管法 培养液0.9ml+0.1ml试剂，同上放置（4）应用：肺链+与甲链-的鉴别（五）抑菌试验1.O/129敏感（抑菌）试验（1）原理：O/129对弧菌属和邻单胞菌属有抑菌作用，而对气单胞菌无此作用。（2）培养基：碱性琼脂平板（3）方法：10ug/片、 150ug/片（4）结果与应用：属间鉴定2.杆菌肽试验（1）原理：A群链球菌对杆菌肽几乎
23、全部敏感，而其他群链球菌绝大多数对其耐药。（2）培养基：血琼脂平板（3）结果及应用：d10mm敏感3.奥普托欣试验（1）原理：肺炎链球菌对奥普拖欣敏感，而其他链球菌对其耐药。（2）培养基：血琼脂平板（3）结果及应用：用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别（六）其它试验1.氢氧化钾拉丝试验 原理：革兰阴性菌的细胞壁在强的稀碱溶液中易于破裂，释放出未断裂的 DNA螺旋，使氢氧化钾菌悬液呈粘性，可用接种环搅拌后拉出丝来，而革兰阳性菌无上述变化。 方法与结果：4%的KOH溶液保存期限不超过一周取一滴4%的氢氧化钾水溶液（应新鲜制）于洁净 的玻片上再取新鲜菌落少许，与 氧化钾溶液搅拌均匀， 每隔几秒上提接种环
24、，观 察能否拉出丝来。能拉出粘丝为阳性结果（革兰阴性 菌），仍为菌悬液者阴性（革兰阳性菌）。大多革兰阴性菌于510s出现阳性反应，革兰阳性菌60s以后仍为阴性反应。 应用：用于染色结果不明显的革兰阴性菌和革兰阳性菌的鉴别。2. 克氏双糖铁试验（复合生化反应） 原理：克氏双糖铁（KIA）琼脂用于观察细菌对糖（葡萄糖和乳糖）的利用能力,以及是否产生硫化氢,可对细菌的种属进行初步鉴定。克氏双糖铁培养基制成高层（下层）和短的斜面（上层）其中乳糖浓度为葡萄糖浓度的10倍，。如果细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，葡萄糖分解产生少量的酸，在最初培养的8 12h内也足以使高层和斜面变黄（酚红指示剂6.8 8.4，
25、黄红），但随着培养时间的延长，培养基斜面部分所产的酸因接触空气被氧化，并因细菌利用含氮物质生成碱性化合物，经18 24h后整个斜面又恢复成红色，深层在相对缺氧的情况下，所产生的酸暂时不被氧化而仍呈黄色；如果细菌既分解葡糖糖，又分解乳糖，因培养基中含乳糖的浓度较高，产生大量的酸，所以整个培养基变黄；如果细菌分解培养基中的蛋白质产生硫化氢，与培养基中的亚铁离子生成硫化亚铁黑色沉淀，使培养基的底层出现黑色。7. 抗原检测：凝集反应、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验（ELISA）8.抗体检测：血清学诊断试验以抗体效价明显高于正常人水平或患者恢复期抗体效价比急性期升高4倍才有意义。9. 细菌毒素检测：内毒
26、素（革兰阴性）鲎试验；外毒素：体内试验动物试验、体外试验抗原抗体反应第四章1.对革兰阳性球菌的抗菌效果：一代头孢菌素二代三代；对革兰阴性球菌的抗菌效果：一代头孢菌素二代三代2.抗菌药物敏感试验（AST）的意义预测抗菌治疗的效果指导抗菌药物的临床应用发现或提示细菌耐药机制的存在，帮助临床选择合适的药物，避免产生或加重细菌的耐药。监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药菌感染的爆发和流行。3.敏感（S）:血药浓度达到MIC48倍或以上。是指分离菌株能被测试药物使用推荐剂量时，在感染部位通常可达到的抗菌药物浓度所抑制。耐药（R）：MIC高于药物在血液或组织中的浓度
27、。是指分离菌株不能被测试药物使用推荐剂量时在感染部位通常可达到的抗菌药物浓度所抑制；和/或证明分离菌株存在某些特定的耐药机制；治疗研究显示药物对分离菌株的临床疗效不可靠。4.中介（I）:血药浓度相当于或略高于MIC。是指抗菌药物MIC接近血液和组织中通常可达到的浓度，疗效低于敏感菌株，在药物生理浓集的部位具有临床效力，或者可用高于正常剂量的药物进行治疗；另外中介还作为缓冲区，以避免微小的不能控制的技术因素造成重大的结果解释错误。5.非敏感（NS）:由于没有耐药菌株或耐药菌罕见，此分类特指仅有敏感解释标准的分离菌株。对于这些菌株应当确证鉴定结果和药敏结果。6.常用的药敏试验方法:1.纸片扩散法（
28、K-B法）2.稀释法:（1）宏量肉汤稀释法（2）微量肉汤稀释法（3）琼脂稀释法3.E-test法 4.自动化仪器法7.K-B法药敏试验的原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在涂有测试菌的琼脂平板上，纸片中的药物吸收培养基中的水分，溶解后不断向纸片周围扩散，形成递减的浓度梯度；在纸片周围可抑菌的浓度范围内，测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌圈，圈的大小反应测试菌对测定药物的敏感性程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关，即抑菌圈越大，MIC值越小。根据CLSI最新抑菌圈直径解释标准折点，判定为敏感(S)、中介(I)或耐药（R）培养基和抗菌药物纸片： M-H水解酪蛋白琼脂平板（pH7.27.4，厚度为4mm），纸片为直径6.35mm，吸水量为20微升的专用敏感纸片。试验方法1）菌悬液的调配：
