1、乳酸菌发酵改善小麦胚芽的营养品质与贮藏特性的研究魏一星百现代食品科技Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.4147乳酸菌发酵改善小麦胚芽的营养品质与贮藏特性的研究魏一星1，董英1，周兴华1，常宪辉2，陈国平2（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013）（2.丹阳市江南面粉有限公司，江苏丹阳 212300）摘要：利用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum dy-1）发酵小麦胚芽，研究其发酵前后营养品质与贮藏特性的变化。结果表明，Lactobacillus plantarum dy-1中存在谷氨酸脱
2、羧酶（GAD ），能够转化L-谷氨酸生成-氨基丁酸（GABA ）；发酵后的小麦胚芽总游离氨基酸的含量提高了13.64倍，其中天冬氨酸、亮氨酸、-氨基丁酸以及蛋氨酸、赖氨酸等增加显著；发酵过程中植酸酶活性增强，抗营养因子植酸的含量下降；发酵麦胚的脂肪酶活力比发酵前降低55.31%，脂肪氧化酶活力降低76.32%；顶空固相微萃取-气质联用（SPME-GC-MS ）分析显示，发酵麦胚的贮藏特性发生显著改变，经过60 d的室温贮藏，发酵麦胚的氧化酸败程度明显低于未发酵麦胚。因此，乳酸菌发酵小麦胚芽可显著改善其营养品质与贮藏特性，采用该方法加工的小麦胚芽可作为食品营养强化的原料或食品配料。关键词：酶活力
3、；氨基酸类；脂肪酶类；-氨基丁酸；植物乳杆菌 文章篇号：1673-9078(20144-147-153Improvement of Nutritional Qualities and Storage Characteristics ofWheat Germ by Lactic acid bacteria FermentationWEI Yi-xing1, DONG Ying1, ZHOU Xing-hua1, CHANG Xian-hui2, CHEN Guo-ping2(1.School of Food and Biological Engineering, Jiangsu, Univers
4、ity, Zhenjiang 212013, China(2.Danyang Jiangnan Flour Co., Ltd, Jiangsu, Danyang 212300, ChinaAbstract: Lactobacillus plantarum dy-1 was used as starters for the wheat germ fermentation, and the nutritional qualities and storage characteristics were analyzed. The results show that, Lactobacillus pla
5、ntarum dy-1 had glutamate decarboxylase (GAD activity, which was enabled to catalyze the irreversible decarboxylation of glutamate to -amino butyric acid. The concentration of free amino acids in Lactic acid bacteria fermented wheat germ increased by 13.64 times, especially aspartic acid, leucine, -
6、amino butyric acid, methionine and lysine increased significantly; during the fermentation process, phytase activity increased, while phytic acid content decreased. Lipase activity after fermentation was 55.31% lower than that found in wheat germ, and lipoxygenase activity decreased by 76.32%. The S
7、PME-GC-MS analysis indicated that, the storage characteristics of fermented wheat germ were significantly changed. After 60 days, the oxidative rancidity of fermented wheat germ was significantly lower than the unfermented. Therefore, Lactic acid bacteria could improve the nutritional qualities and
8、storage characteristics of wheat germ, making the fermented wheat germ suitable to be food nutritional supplements or ingredients.Key words: enzyme activity; amino acids ; lipases; -amino butyric acid; Lactobacillus plantarum小麦胚芽（简称麦胚）是小麦籽粒中营养最丰富的组成部分，但其不易贮藏及抗营养等问题却影响着麦胚深加工与高效利用。主要表现为：麦胚中抗营养因子植酸会明显降
9、低矿物质与氨基酸的生物利用率1；而内在的脂肪酶和脂肪氧合酶活力则导致了麦胚收稿日期：2013-12-05基金项目：江苏省产学研前瞻性联合研究项目（BY2012172） 作者简介：魏一星（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品工程 通讯作者：董英（1954-），女，教授，博士生导师，研究方向：食品营养与安全的不耐贮藏特性，即易产生水解和氧化产物。对于脂肪酶类的钝化通常采用微波、挤压、蒸煮等方法进行处理23，或添加抗氧化剂4等加以控制，虽然具有不同程度的作用，但仍存在成本高、效率低、效果差及其合成抗氧化剂的安全性受到质疑等问题4。因此，高效、安全的麦胚加工方法仍是值得探索和深入研究的课题。发
10、酵是一种传统的食品加工及贮藏方法。在发酵过程中不仅可以降解食物原料中的有害物质、控制致病菌的生长，还可以通过生物转化产生活性酶和多种148营养物质，如维生素氨基酸脂肪酸等。此外，发酵过程中蛋白质降解可产生大量的多肽和氨基酸，并具有多种生理功能，且更易于吸收。GABA 是一种非蛋白氨基酸，是哺乳动物大脑和脊髓中重要的抑制性神经传递物质，具有降低血压、调节心跳速率，缓解疼痛和紧张等功能。同时，GABA 也是胰腺产胰岛素的一种强促分泌素，能够有效预防糖尿病。GABA 是由谷氨酸脱羧酶（GAD ）催化L-谷氨酸不可逆的脱羧反应生成。麦胚中含有大量酶原，给予适当的处理，内源性酶原可被激活。麦胚经孵育后通
11、过自身蛋白酶可将蛋白质水解成肽和氨基酸，通过生物调控技术可以富集GABA 5。另外，利用微生物GAD 催化L-Glu 脱羧生产GABA ，也是有效的富集GABA 的途径。近年来，国内外学者在利用乳酸菌发酵法合成GABA 方面的研究已越来越成为热点。但目前关于乳酸菌发酵麦胚进行GABA 富集的研究尚少见报道。近年来，麦胚发酵多采用酵母菌，且主要集中在生物活性物质67及其功能研究方面，而对其营养与贮藏特性变化的研究则较少。乳酸菌作为人体重要的益生菌，在发酵食品工业中得到了广泛的应用，但目前国内外关于乳酸菌发酵麦胚的研究尚少见报道。本研究利用实验室自行分离鉴定的植物乳杆菌发酵麦胚，研究其发酵前后营养
12、和贮藏特性的变化，以期为麦胚的加工贮藏与高效利用提供理论依据和技术支持。1 材料与方法 1.1 材料与仪器 1.1.1 试验材料新鲜小麦胚芽（山东永乐食品公司提供）；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum dy-1）实验室自行分离鉴定；其它试剂均为分析纯。1.1.2 仪器与设备UV-9600紫外可见分光光度计，北京瑞丽分析仪器公司；K-350/355半自动凯氏定氮仪，瑞士步琪公司；Sykam S433D氨基酸分析仪，德国sykam 公司；HB43-S 卤素水分测定仪，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LC-20A T 液相色谱仪，日本岛津公司；75um Carboxen/
13、PDMS熔融石英SPME 萃取头，美国sigma 公司；HP6890/5973气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司。1.2 试验方法 1.2.1 麦胚发酵工艺新鲜的麦胚磨粉过筛，按料液比1:0.6混合均匀。按1108接种活化至对数后期（活菌数达到1109 CFU/mL）的Lactobacillus plantarum dy-1，搅拌5 min，30 发酵24 h，40 烘干至水分含量达到10.50.05%左右，磨粉过筛备用。1.2.2 基本组分的测定水分含量测定：105 常压干燥法，参照GB/T 5009.3-2003；灰分含量测定：参照GB/T 5009.4-2010；粗蛋白含量测
14、定：凯氏定氮法，参照GB/T 5009.5-2003；粗脂肪含量测定：索氏抽提法，参照GB/T 5009.6-1985。1.2.3 GAD活力测定1.2.3.1 乳酸菌GAD 活力测定参照许建军8等人的方法，利用比色法测定一定条件酶反应后GABA 的生成量来反映GAD 活力大小。一个酶活力单位（U ）定义为：在测定条件下，每分钟产生1 mol GABA所需酶量为一个酶活力单位U (mol/min。1.2.3.2 麦胚中GAD 活力测定称取1 g麦胚，加入10 mL底物溶液（含10 mmol/L L-谷氨酸钠和0.1 mmol/L 5-磷酸吡哆醛，Macllvaine 缓冲液体系pH 4.7），
15、40 反应2 h，离心取上清液测定GABA 含量。在测定条件下，每分钟产生1 mol GABA 所需酶量为一个酶活力单位U （mol/min）。1.2.4 游离氨基酸分析采用氨基酸分析仪测定WG 和LFWG 提取液中游离氨基酸含量。参考Rizzello 等人的方法9，15 g样品中加入60 mL 50 mM的Tris-HCl （pH 8.8）溶液，4 条件下磁力搅拌1 h，9000 r/min离心20 min。取上清液，加入9倍体积的1%磺基水杨酸沉淀蛋白，8000 r/min离心15 min，上清液用于测定游离氨基酸含量。1.2.5 植酸酶活及植酸含量的测定植酸酶活力测定：参照Shimizu
16、 等人的方法10；植酸含量测定：参照GB/T 5009.153-2003。1.2.6 脂肪酶及脂肪氧化酶活力测定参照徐斌11等人的方法。1.2.7 贮藏期间挥发性化合物的测定利用SPME-GC-MS 方法分别测定发酵前后麦胚在贮藏第0 d和第60 d时挥发性化合物成分。顶空固相微萃取（SPME ）方法：将首次使用的萃取头在气相色谱进样口老化至无杂峰。取3 g样品放入15 mL样品瓶中，将SPME 萃取头插入瓶中，使之与样品面保持1.5 cm的距离，40 条件下萃取30 min。GC-MS 参数条件：色谱条件：毛细管色谱柱DB-W AX （60 m0.25 mm ，0.25 m ）；进样口温度2
17、50 ，SPME 插入进样149孔解吸6 min；程序升温：始温40 ，保持2 min，以5 /min升温至230 ，保持10 min；载气(He 流速1.0 mL/min，不分流。质谱条件：接口温度250 ，离子源温度200 ，电子能量70 eV，质量扫描范围33450 amu。2 结果与讨论2.1 麦胚发酵前后主要组分的变化麦胚经植物乳杆菌发酵，发酵前后基本组分变化列于表1。表1 麦胚发酵前后主要组分分析（以干基含量计算） Table 1 The analysis of main components in wheat germ beforeand after fermentation主要
18、组分 /% 麦胚 (WG乳酸菌发酵麦胚(LFWG水分 12.480.46a 10.580.10b 灰分 7.680.09a 7.840.07a 粗蛋白 41.530.24a 41.760.15a 粗脂肪11.910.43a 11.970.22a注：ab同一列中不同字母表示存在显著性差异（P0.05）。由表1可以看出，麦胚发酵前后其粗蛋白和粗脂肪的含量变化不大。其中，乳酸菌发酵过程虽然可增加部分菌体蛋白，但是对粗蛋白含量的影响甚微。但是，麦胚蛋白在乳酸菌分泌的蛋白酶和麦胚内源性蛋白酶作用下水解，生成人体易吸收的小分子蛋白或小肽，可以提高麦胚蛋白的利用率。2.2 GAD活力分析及麦胚发酵前后的游离
19、氨基酸分析采用比色法计算得到的Lactobacillus plantarum dy-1中GAD 粗酶液活力为0.0290.0015 U/mL，这一结果与许建军8等研究乳酸菌GAD 时粗酶液的活力结果相似。而麦胚内源性GAD 活力为1.7210.323 U/g。结果表明Lactobacillus plantarum dy-1中以及麦胚中都含有GAD ，在发酵过程中催化L-谷氨酸不可逆脱羧生成GABA 。乳酸菌在发酵的过程中产生乳酸，造成低的pH 环境，而这样的环境不利于乳酸菌维持自身的活力，必须启用某种耐酸机制，而GAD 的活性在低pH 下（pH5.5）得到激发，催化脱羧反应。Takeshi 等
20、认为在此过程中，L-谷氨酸被携带者由细胞外运输至细胞膜内，在胞内GAD 的催化作用下消耗一个H +生成GABA ，并释放CO 2。细胞内的谷氨酸脱羧反应消耗H +，这种一对一的转化使细胞膜两侧两极化，造成细胞膜两边的pH 压差和质子势差，而这种质子运动作用力促使化合物运输，脱羧过程用于合成A TP ，CO 2向外自由扩散则使循环不可逆的进行下去。因此，乳酸菌富集GABA 的能力可能与乳酸菌的耐酸能力有关12。本试验研究中发酵麦胚游离氨基酸中的GABA 含量，谷氨酸含量下降仅为未发酵麦胚的10.95%，这是由于谷氨酸转换成GABA 的缘故。闻秀梅13等人采用水浴保温的方法对麦胚中GABA 进行富
21、集，GABA 最大富集量约为麦胚原料的5.51倍，而经过乳酸菌发酵，GABA 含量提高约7.47倍。因此，乳酸菌发酵麦胚更有利于-氨基丁酸的生成与富集。麦胚发酵前后氨基酸组成变化见表2。表2 WG和LFWG 游离氨基酸含量Table 2 Concentration of free amino acids in WG and LFWG游离氨基酸种类 WG/(g/g LFWG/(g/g 磷酸丝氨酸(PSer 39.953.12b 91.424.02a 牛磺酸(Tau 10.651.25b 37.841.35a 天冬氨酸(Asp 17.992.01b 183.134.03a 苏氨酸(Thr 153.
22、7610.56b 443.5816.21a 丝氨酸(Ser 174.1411.23a 92.749.68b 天冬酰胺(Asn 7182.7058.23b 7323.9267.32a 谷氨酸(Glu 2424.7539.21a 265.4915.11b 甘氨酸(Gly 764.1420.31b 1072.4025.26a 丙氨酸(Ala 1175.5129.56b 1573.3329.65a -氨基丁酸(-Aba 29.872.13 - 缬氨酸(Val 183.3210.22b 587.1020.36a 蛋氨酸(Met 54.5611.36b 270.3815.28a 异亮氨酸(Ile 191.
23、7310.56b 282.9320.46a 亮氨酸(Leu 103.2810.55b 1029.4645.21a 酪氨酸(Tyr 344.1221.89 a 330.0020.65b 苯丙氨酸(Phe 138.919.88b 409.156.33a -氨基丙酸(-Ala 39.231.25b 132.745.66a -氨基异丁酸(-Aiba 197.9010.55b 868.769.88a-氨基丁酸(-Aba 533.1125.46b 3981.0745.33a 组氨酸(His 149.908.66b 198.425.23a 色氨酸(Trp 219.9010.22b 693.1316.77a
24、鸟氨酸(Orn 1102.5225.32a 514.5446.22b 赖氨酸(Lys 281.755.68b 1261.5528.95a 精氨酸(Arg 984.1826.78b 3088.8735.33a 脯氨酸(Pro 332.5915.21b 496.6420.33a 总游离氨基酸1784.9030.22b 26139.23336.88a注：ab同一列中不同字母表示存在显著性差异（P0.05）。乳酸菌是能够分泌多种蛋白酶的发酵菌种之一，在发酵过程中主要由蛋白酶系统的肽酶（内肽酶、氨150基肽酶、二肽酶等）降解寡肽产生游离氨基酸，从而满足自身合成代谢对氨基酸的需求14，同时使发酵产物中的游
25、离氨基酸显著增加。麦胚中含有丰富的蛋白酶类，内源性蛋白酶能够水解不溶性蛋白为可溶性蛋白、多肽和氨基酸。Mumford 等人发现麦胚中存在一种类似胰蛋白酶活性的中性蛋白酶15，Runqiang Yang 等人从麦胚中分离出一种半胱氨酸蛋白酶16。不同蛋白酶的酶切位点不同，因而水解生成的多肽和氨基酸种类也有所差异。在发酵过程中，大分子蛋白质在内源性蛋白酶和乳酸菌分泌蛋白酶共同作用下水解为多肽及小肽，小肽在外肽酶作用下继续水解为游离氨基酸，从而使游离氨基酸的含量增加。由表2可以看出，麦胚经发酵后其总游离氨基酸含量增加了13.64倍，其中尤以天冬氨酸、亮氨酸、-氨基丁酸以及蛋氨酸、赖氨酸等增加显著，分
26、别是麦胚的10.18、9.97、7.47、4.96、4.48倍。天冬氨酸是生物体内赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶碱基的合成前体，可以用于辅助治疗心脏病、肝病及高血压症，具有防止和缓解疲劳的作用；亮氨酸及其代谢产物在体内对营养物质代谢、神经内分泌调节、基因表达、信号转导及免疫功能等方面都具有调控作用。蛋氨酸被认为是动物生长限制性氨基酸，具有降血压、保护肝脏与心肌等功能；赖氨酸为碱性必需氨基酸，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。而谷物中赖氨酸和蛋氨酸的 含量往往都很低，且在加工过程中易被破坏，因此被 称为限制性氨基酸。乳酸菌发酵麦胚使这两种氨基酸的
27、含量均得到显著提升，从而提高了麦胚的营养功能。2.3 麦胚发酵过程中植酸酶活力的变化图1 麦胚发酵过程中植酸含量及植酸酶活力的变化 Fig.1 The changes of phytic acid content and phytase activity ofwheat germ during fermentation植酸是谷物中常见的一种肌醇六磷酸盐，是一种抗营养因子。它不仅可以螯合Ca 2+、Mg 2+、Fe 2+和Zn 2+等矿物质元素，影响其吸收利用，同时还可以与蛋白质中的碱性氨基酸形成复合物，从而降低其生物利用率。有研究表明17，发酵过程能够通过微生物的作用调节最适pH ，提高植酸酶
28、活力，从而降低植酸含量，释放矿物质离子，提高其营养价值。有文献表明18，麦胚内源植酸酶在最适温度及最适pH 条件下，催化水解48 h后，麦胚中的植酸水解率为31.49%。乳酸菌发酵可能产生一个合适的pH 来激活或提高麦胚内源植酸酶的活力，且乳酸菌也可能成为植酸酶的来源9。由图1可以看出麦胚发酵过程中植酸含量逐渐下降，同时植酸酶活力逐渐增强，发酵24 h植酸水解率为37.02%，优于麦胚内源植酸酶催化水解植酸的效果。2.4 麦胚发酵过程中脂肪酶及脂肪氧化酶活力的变化脂肪酶能催化麦胚脂质中的三酰甘油水解为高级脂肪酸和甘油，而脂肪氧化酶则催化其不饱和脂肪酸如亚油酸氧化，生成氢过氧化油酸，并进一步分解
29、生成挥发性的醛和酮类等。麦胚中内源脂肪酶和脂肪氧化酶活力均很高，酶解产生的游离脂肪酸可导致含有麦胚的烘焙食品酸败而影响营养与感官品质。有研究表明，麦胚中的脂肪酶具有热稳定性，6090 处理1 h，仍可保持20%以上的残余活力。但由于麦胚脂肪 酶最佳 pH 约为 8.0，故在酸性条件下其活力明显降低19。图2 麦胚发酵过程中脂肪酶及脂肪氧化酶活力变化 Fig.2 The changes of lipase activity and lipoxidase activity ofwheat germ during fermentation从图2可以看出，乳酸菌发酵降低了麦胚脂肪酶和脂肪氧化酶的活力。
30、发酵24 h后，脂肪酶活力降低了约55.31%，脂肪氧化酶活力降低了约76.32%。因此，乳酸菌发酵麦胚可以钝化其脂肪酶和脂肪氧化酶活力，提高其贮藏稳定性。Jha 等人利用射线辐照麦胚来降低脂肪酶活力，结果显示30 kGy高剂量辐照151仅能使脂肪酶活力降低31.20%20，而麦胚发酵24 h时其脂肪酶活力降低了55.31%，效果优于射线辐照。2.5 发酵麦胚及其贮藏期内挥发性化合物分析 图3 WG和LFWG 贮藏0 d和60 d挥发性化合物分析 Fig.3 The analysis of volatile compounds of WG and LFWGafter 0d and 60d st
31、orage注：a ：WG ，b ：WG （60 d），c ：LFWG ，d ：LFWG （60 d ）。麦胚和发酵麦胚贮藏前后挥发性化合物分析如图3所示。表3 部分挥发性化合物的相对含量Table 3 The relative content of part volatile compounds峰号保留时间/min化合物名称 相对含量/%WG /0 dWG /60 dLFWG /0 dLFWG /60 dA 5.25己烷 39.25 4.03 29.96 20.51B 8.12乙酸乙酯1.750.63 0.63 0.63C 8.763-甲基-正丁醛- 1.83 1.23 4.71 D9.18乙醇 0.834.44 1.30 7.87 E 10.21戊醛 - 2.48 - 0.48 F 13.06己醛 1.7030.23 - 4.92G 16.04庚醛 - 0.39 -H17.83戊醇 - 2.72 1.63 0.98 I 20.482-羟基丙酸乙酯- 1.94 - 3.96 J 20.71己醇 - 2.36 - 1.04 K25.313,5-辛二烯-2-酮- 4.27 -L 28.27丁内酯- 2
