1、第六章同核核磁实验方法第六章 同核核磁实验方法 通常所谓同核核磁谱指的是1H同核谱，因为一般有机物富含氢，而1H的天然丰度达99.98%，而且1H的旋磁比最大，因而核磁信号最强。其他核的核磁信号的检测相对来讲都比较困难，尤其是蛋白质中有意义的如13C，15N的天然丰度分别只有1.11%和0.36%,相对1H的检测灵敏度只有0.0159和0.00104，因此要检测蛋白质中的13C及15N一定要有同位素标记才行，而且还需长时间累加。 一般同核谱可研究的蛋白质分子量的上限在1万左右，当然还要求蛋白质在溶液中有足够的溶解度，化学位移的分布比较分散。蛋白质中质子的化学位移基本上是random coil的
2、化学位移加上不同构象的影响。如折叠多的蛋白质同螺旋多的蛋白质相比，化学位移更为分散，谱峰也更容易解析；同种氨基酸残基多的蛋白质，即使分子量较小，由于化学位移可能会比较密集，谱峰解析可能比稍大一些的蛋白质还要困难。 已经发表的脉冲序列有上百，但通常可以看作常规实验的为数不多。6.1 一维氢谱 在记录二维谱或三维谱等之前均需要记录一维氢谱，通常蛋白质溶于水或适当的缓冲液，加5-10%的D2O作为锁场介质。一维氢谱可用于检查样品是否有足够浓度，通常1632次采样要能得到足够信噪比的谱图，甲基由于快速旋转呈现窄峰，而酰胺质子由于化学交换及14N的标量弛豫呈现宽峰；一维氢谱还可用于检查样品的共振峰宽是否
3、合理，蛋白质在高浓度下容易聚集从而增宽谱线，严重时甚至1H谱上看不到明显的峰，样品在这种条件下显然无法进行核磁研究；一维氢谱还可用于判别样品的化学位移分布情况，可判别样品是否变性，同时也对研究工作的难度提供一些预测。上图显示ubiquitin（一种蛋白质，76个残基）的一维谱：a 水溶液中，b 箭头所指甲基区的放大，c 8M尿素溶液中，显示变性谱。 蛋白质的一维氢谱一般不应该有非常尖的峰，若出现这种峰，往往是残留的小分子杂质，当然蛋白质的末端及loop区由于分子运动较快也会出现一些较尖的峰。 当样品条件不佳时，一维谱（以及若干信号强的二维谱）可用来探索适合的样品条件。6.2 COSY型实验6.
4、2.1 COSYA COSY(correlated spectroscopy),是人们发明的第一种二维谱，同时也是研究蛋白质的最有用的二维谱之一。二个有J偶合的核在COSY上可产生一个交叉峰，由于蛋白质（包括多数其他有机物）中有J偶合意味着这两个核最多通过3个共价键连接，所以COSY谱对于分子结构的拓扑连接可提供非常有价值的信息。左图是COSY的脉冲序列，只由2个90度脉冲组成，两脉冲之间是演化期，理想脉冲本身不产生其他杂信号，故不需相循环抑制：因此基本的相循环为：1=x;2=x;ref=x实际上由于演化期的弛豫以及第一个90度脉冲的不准确会产生轴峰，需要用2步循环抑制：第一个脉冲及接收机相位
5、同时反转通常还加上CYCLOPS循环以抑制硬件不平衡产生的其他杂信号这样形成8步循环：1= 0 2 1 3 2 0 3 12= 0 0 1 1 2 2 3 3ref= 0 2 1 3 2 0 3 1 二维谱有幅度谱和相敏谱之分，由于相敏谱的分辨率高，通常要尽量用相敏谱。B 以下是可以在Bruker核磁谱仪上用于记录蛋白质COSY谱的脉冲程序，脉冲序列在Bruker谱仪上称作微程序:;cosyprst.WJH#include “p2=p1*2”“d0= in0/2 - p1*4/3.14159”“d11=30m”“d12=20u”“d13=3u”“l3=(td1/2)”1 ze2 d113 d1
6、14 d12 pl9:f1 d1 cw:f1 d13 do:f1 d12 pl1:f1 p1 ph1 d0 p1 ph2 go=2 ph31 d11 wr #0 if #0 ip1 zd lo to 3 times 2 d11 id0 lo to 4 times l3exitph1= 0 2 2 0 1 3 3 1ph2= 0 0 2 2 1 1 3 3ph31=0 2 2 0 1 3 3 1C 脉冲序列分析a 二自旋体系 考虑相循环的第一步 第一项为纵向磁化，第二项为多量子项，均不能被观测到； 第三项仍然是第一核的横向磁化，在检测期的频率同演化期类似，均是第一核的，对应于对角峰； 第四项是第
7、二核的反向磁化，在检测期的频率为第二核的化学位移，与演化期不同，对应于交叉峰，这是二维谱最有意义的峰。 进一步将后两项的系数分解： 可见，对角峰在F1维位于1，同相裂分成两个成分，距离2J12； 而交叉峰在F1维也位于1，但反相裂分成两个成分，距离也是2J12。由于一个信号为正弦调制，另一个为余弦调制，对角峰信号与交叉峰信号在相位上相差90度，故在F1维两者不能同时调相成吸收型信号。 再看F2维，对角峰为同向磁化，在检测期呈现同相裂分，距离2J12； 交叉峰在F2维为反向磁化，在检测期呈现反相裂分，距离也是2J12。由于一个信号在x方向，另一个在y方向，两者在相位上也相差90度，故在F2维两者
8、也不能同时调相成吸收型信号。 COSY的交叉峰为反相峰，这一点非常重要，决定了COSY型实验采样及处理时需要注意的问题。而交叉峰与对角峰在相位相差90度，对于谱图在对角线附近的质量有重要的影响。b 多自旋体系 考虑I1和I2间的交叉峰，类似的计算可得其系数为： 其中的余弦项表明在F1维第一核相对除第二核（称为主动偶合）外的其他核（称为被动偶合）呈现同相裂分；同样在F2维由于交叉峰的密度算符为第二核相对第一核的反相磁化，其中没有出现被动偶合核的算符，即相对于被动偶合核为同相磁化，因此也呈现同相裂分。 当其中一个核为甲基时，由于磁全同的缘故，出现多重裂分：同相峰可用pascal三角形描述；反相峰用
9、反pascal三角形描述。D 实验方案同其他二维谱相同处 如确定谱宽，照射频率，测定90度脉宽，选择循环延迟时间等反相谱的特殊处1 由于两维的交叉峰均是反相峰，因此两维都要有足够的分辨率，否则正负两部分的信号产生部分重叠，而使信号减弱；2 交叉峰的观测信号包含，由于同核偶合常数不大，通常几Hz至十几Hz，因此t1及t2的最大值要达到至，这样才能获得足够强度的信号，这相当于62-125ms（假定4Hz的偶合常数）。对于t2一般不成问题，但t1则不然：因为t1的增量由谱宽确定，t1的最大值越大意味着F1维的数据点数也越大，而实验时间与F1维点数成正比。 对一般蛋白质而言，通常置照射频率在水峰处，谱
10、宽大致10ppm，接近5000Hz，因此t1的增量为0.2ms，若F1维点数取512，t1的最大值可达50ms左右；若F1维点数取1024，t1的最大值可达100ms左右。因此一般F1维点数取512至1024。左图显示不同F1维点数的效果：a t1max=69ms,NS=16;b t1max=34.5ms,NS=32;c t1max=17.2ms,NS=64E 数据处理通常交叉峰总是调相成吸收线型，此时对角峰呈色散线型。由于色散峰的长拖尾对靠近对角线的交叉峰产生干扰，所以必须加适当的窗函数，通常以不带相移或略有相移的正弦函数或正弦平方函数。左图显示不同相移的正弦窗函数作用于F1维的效果：a 3
11、0度; b 20度; c 10度; d 5度F 应用 在高场区由于化学位移的简并，谱峰的重叠，对角峰的干扰，通常不容易由COSY辨认整个自旋系统，在蛋白质COSY特别有用处是用于检查所谓的指纹区特别是酰胺质子与质子的交叉峰。在这个区域，脯氨酸由于没有氨基没有交叉峰；甘氨酸有两个质子故有两个交叉峰（除非两者的化学位移相同）；N端残基上的NH由于与水交换快也没有交叉峰。除特殊情况外，对于不大的蛋白质，所有的峰都应该能找到。蛋白质COSY上的几个主要区域leucine,isoleucine,valine侧链交叉峰alanine,threonine甲基区1HN-1H指纹区G J偶合常数的测量 在没有被
12、动偶合时，COSY的精细结构可以用于测定J偶合常数，但直接由谱峰的裂分得到的值有较大的误差。显示表观裂分与线宽的关系H COSY的变型1 COSY- 第二个90度脉冲用小于90度的脉冲代替，其结果是： 对角峰被减弱 多核体系中被动偶合产生的某些交叉峰被减弱，导致精细结构的变化，起到简化图谱的作用上图比较COSY-35同普通COSY的图谱，GLY的1HN-1H交叉峰结构发生变化，因而有利于J偶合常数的测定2 pre-TOCSY COSY 预饱和同时抑制接近水峰的H信号，因而从H到其他质子特别是NH的交叉峰减弱甚至消失，而NH到H的交叉峰往往淹没在水峰产生的t1噪声中。在pre-TOCSY COS
13、Y中，在COSY序列前插入一个短时间的TOCSY混合脉冲，使其他质子的信号先传递给H，这样可部分恢复H到其他质子的信号。6.2.2 Relayed COSY(R-COSY)A 所谓接力谱，COSY的一种扩展，在COSY的二个脉冲后加一个延迟，使反向磁化进一步传递给第三个核，最后一个90度脉冲完成第二核至第三核的相干传递，这样观测的第一核同第三核的交叉峰，虽然两者可能并没有J偶合。显然，接力谱中的交叉峰表明两个自旋同属一个自旋系统。左图为R-COSY的脉冲序列，基本相循环为8步：1= 0 2 0 2 0 2 0 22= 0 0 0 0 2 2 2 23= 0 0 0 0 0 0 0 04= 0
14、0 2 2 0 0 2 2ref= 0 2 0 2 0 2 0 2整个循环由二步1，二步2，二步4组成，而ref=1，选择条件变成，即，由于三者均是完整的二步循环，因此得选择的相干传递途径为：p1=1; p2=0,2; p4=0,2需要时可加上CYCLOPS扩展成32步循环B 脉冲序列分析 考虑三核体系，1，2核间以及2，3核间有J偶合，而1，3核间无J偶合。同样只考虑第一步相循环。经过前二个脉冲作用，第一核产生的信号如COSY中所计算，在回波序列的作用下： 最后一个90度脉冲产生: 其中第4项是不可观测信号，第6项为接力信号，这个信号在F2维位于3处，相对第2核反向，在F1维位于1处，相对第2核也是反向。通常在调相时将这种峰调成吸收线型。 第1项和第3项均是对角峰，但两者分别为同相和反相峰，且相位差90度。第2项和第5项为普通COSY中可见的交叉峰，但相位及线型不同。C 实验及处理 同普通COSY类似，通常取几十ms。6.2.3 Double-Relayed COSY(DR-COSY) 在RCOSY序列后再加一个回波及90度脉冲就形成双接力谱。 下图显示COSY中交叉峰的精细结构
