1、导入动物细胞：最常用方法是显微注射法。导入微生物细胞：常用Ca2处理使受体细胞处于感受态。（4）目的基因的检测与鉴定。分子水平检测：以目的基因单链作探针，进行分子杂交；抗原抗体杂交。个体水平鉴定：抗虫、抗病的接种实验。3应用：（1）植物基因工程。抗虫、抗病、抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质。（2）动物基因工程。提高动物生长速度；改善畜产品的品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体。（3）基因工程药物。（4）基因治疗。体外基因治疗；体内基因治疗。二、植物组织培养与动物细胞培养的比较三、植物体细胞杂交、动物细胞融合与细胞核移植1若该图为植物体细胞杂交示意图：（1）原生质体的
2、制备。用纤维素酶和果胶酶除去植物细胞的细胞壁，得到原生质体A和B。（2）促融方法。过程中，常用的化学试剂是聚乙二醇。（3）新细胞壁的形成。过程形成的D细胞具有一定的形状，该过程与细胞中的高尔基体密切相关。（4）杂种植株的培育。过程为植物组织培养，依据的原理是细胞的全能性，所得杂种植株可育（“可育”或“不可育”）。2若该图为动物细胞融合示意图：（1）促融方法。与植物体细胞杂交相比，过程中特有的方法是灭活病毒处理。（2）原理：过程的完成依赖于细胞膜的流动性。（3）应用。若A细胞为骨髓瘤细胞，B细胞为B淋巴细胞，那么D细胞称为杂交瘤细胞，由D细胞连续分裂产生大量细胞的过程，称为克隆。这种细胞既能无限
3、繁殖，又能产生专一抗体。3若该图为体细胞核移植过程示意图，假设C细胞的细胞核来自于A细胞：（1）受体细胞（B细胞）的选择理由。第一：营养物质丰富，能满足早期胚胎发育的需要。第二：体积较大，易于操作。第三：含有使已分化的细胞核恢复分裂能力的物质。（2）克隆动物的性状。通过该过程克隆的动物主要性状由A细胞决定。1在诱导离体菊花茎段形成幼苗的过程中，不可能同时进行ATP的合成与分解。（）【答案】分析：在诱导离体的组织或器官形成幼苗的过程中，伴随细胞的增殖与分化等需要能量的生理过程，一定会进行ATP的合成与分解。2重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接。DNA分子杂交是通过
4、碱基互补配对原则形成的。3将目的基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞。目的基因必须经构建形成基因表达载体，才能导入受体细胞，否则不能正常表达。4培养草莓脱毒苗所采用的主要技术是组织培养。【答案】分析：植物的茎尖一般没有病毒感染，因此可以通过组织培养技术培养茎尖细胞以获得脱毒苗。5应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达。应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否转录，但不能检测其是否表达。6体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体。克隆动物通过核移植技术获得，不能通过体细胞杂交技术获得。7动物的生长激素基因转入植物体后
5、不能表达。不同生物的基因具有相同的化学成分和空间结构，合成蛋白质时共用一套密码子，因此动物基因可以在植物体内表达。8单克隆抗体技术可以用于治疗老年痴呆症。单克隆抗体特异性强，可以定向清除抗原，达到治疗疾病的目的。基因工程的基本工具【典例1】（2012新课标全国卷）根据基因工程的有关知识，回答下列问题：（1）限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有_和_。（2）质粒运载体用EcoR切割后产生的片段如下：AATTCGGCTTAA为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoR切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是_。（3）按其来源不同，基因工程中所使用的
6、DNA连接酶有两类，即_DNA连接酶和_DNA连接酶。（4）反转录作用的模板是_，产物是_。若要在体外获得大量反转录产物，常采用_技术。（5）基因工程中除质粒外，_和_也可作为运载体。（6）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是【解析】（1）当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。（2）为使运载体与目的基因相连，不同的限制酶应该切出相同的黏性末端。（3）DNA连接酶根据其来源的不同分为两类，一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为Ecoli DNA连接酶；另
7、一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4DNA连接酶。（4）反转录是指以RNA为模板在反转录酶的作用下合成DNA的过程，可以在体外短时间内大量扩增DNA的技术叫PCR（多聚酶链式反应）。（5）基因工程中可以作为运载体的除质粒外，还有噬菌体的衍生物、动植物病毒等。（6）大肠杆菌细胞有细胞壁和细胞膜，能阻止质粒（外源DNA）等物质的进入，只能通过Ca2处理细胞，使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞），才能作为受体细胞。【答案】（1）黏性末端平末端（2）切割产生的DNA片段末端与EcoR切割产生的相同（3）EcoliT4（4）mRNA（或RNA）cDNA（或DNA）PCR（5）
8、噬菌体的衍生物动植物病毒（6）未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱（1）基因工程常用的工具包括哪些？分别起什么作用？（2）限制酶的特异性及其作用：特异性：_；1 作用部位：末端分析：同种限制酶切出的末端_（填“一定”或“可能”）相同；不同种限制酶切出的末端_（填“一定”或“可能”）相同。【答案】（1）提示：限制酶分子手术刀，DNA连接酶分子缝合针，运载体分子运输车。（2）提示：识别并切割特定的脱氧核苷酸序列DNA单链中两个相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键一定可能【总结提升】与核酸有关的酶的辨析【变式训练】（2014南通模拟）普通棉花中含甘露糖苷酶基因（GhMnaA2），能在纤维细胞中
9、特异性表达，产生的甘露糖苷酶催化半纤维素降解，棉纤维长度变短。为了培育新的棉花品种，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体，利用农杆菌转化法导入棉花细胞，成功获得转基因棉花品种，具体过程如下。请分析回答：（1）和过程中所用的限制酶分别是_、_。（2）基因表达载体除了图示组成部分外，至少还有_等（至少答两个）。（3）过程中用酶切法可鉴定正、反义表达载体。用Sma酶和Not酶切正义基因表达载体获得0.05 kb、3.25 kb、5.95 kb、9.45 kb四种长度的DNA片段，则用Not酶切反义基因表达载体获得DNA片段的长度应是_和_。（4）利用农杆菌介导转化棉花细胞的过程中，整合到棉花
10、细胞染色体DNA的区段是_，转化后的细胞再通过_形成植物体。（5）导入细胞内的反义GhMnaA2转录的mRNA能与细胞内的GhMnaA2转录的mRNA互补配对，从而抑制基因的表达，其意义是_【答案】（1）Hind、BamHSma（2）复制原点、终止子、标记基因等（3）6.0 kb12.7 kb（4）（含有E6启动子和GhMnaA2基因的）TDNA植物组织培养（5）阻止甘露糖苷酶合成，使棉纤维更长基因工程的操作步骤【典例2】肺细胞中的let7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将let7基因导入肺癌细胞实现表达增强后，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术
11、基本流程如图1。（1）进行过程时，需要用到_酶。（2）研究发现，let7基因能影响癌基因RAS的表达，其影响机理如图2。据图分析，可从细胞中提取_进行分子杂交，以直接检测let7基因是否转录。肺癌细胞增殖受到抑制，可能是由细胞中_（填“RAS mRNA”或“RAS蛋白”）含量减少引起的。（3）进行过程时，需用_酶处理贴附在培养皿壁上的细胞，以利于细胞培养。过程常用的方法是_。【解析】（1）构建基因表达载体时，应用限制酶切开载体并插入目的基因，再用DNA连接酶连接为基因表达载体。（2）检测目的基因是否转录，可以从细胞中提取mRNA，与基因探针进行分子杂交。let7基因表达增强，会使RAS蛋白翻译
12、受阻，RAS蛋白含量减少，使肺癌细胞增殖受到抑制。（3）进行细胞培养时，需要用胰蛋白酶处理贴附在培养皿壁上的细胞。转化动物细胞常用显微注射法。【答案】（1）限制酶、DNA连接（2）mRNARAS蛋白（3）胰蛋白显微注射法（1）反转录法合成目的基因。需要的酶：2 模板：原料：（2）目的基因的检测与鉴定。检测目的基因是否导入受体细胞用什么方法？检测目的基因是否转录所使用的基因探针是什么？反转录酶RNA脱氧核苷酸（2）提示：DNA分子杂交法。提示：基因探针为放射性同位素或荧光标记的目的基因单链。目的基因的检测与鉴定方法【变式训练】（2012天津高考改编）如图为采用基因工程技术生产AFB1解毒酶的流程
13、图。据图回答问题：（1）在甲、乙条件下培养含AFB1解毒酶基因的菌株，经测定，甲菌液细胞密度小、细胞含解毒酶；乙菌液细胞密度大、细胞不含解毒酶。过程应选择_菌液的细胞提取总RNA，理由是_（2）过程中，与引物结合的模板是（3）检测酵母工程菌是否合成了AFB1解毒酶，应采用_方法。（4）采用蛋白质工程进一步改造该酶的基本途径是：从提高酶的活性出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的_。（5）实际上生物分子间的结合具有特异性。以下实例为体外处理“蛋白质DNA复合体”获得DNA片段信息的过程图，请回答。a若将得到的DNA片段用于构建重组质粒，需要将过程的测序结果与限制酶的_进行
14、对比，以确定选用何种酶。b如果复合体中的蛋白质为RNA聚合酶，则其识别、结合的DNA序列区为基因的_。【答案】（1）甲甲菌液细胞的AFB1解毒酶基因已转录生成mRNA，而在乙菌液细胞中该基因未转录（2）AFB1解毒酶基因的cDNA（3）抗原抗体杂交（4）脱氧核苷酸序列（5）a.识别序列b启动子植物细胞工程【典例3】（2012新课标全国卷）为了探究6BA和IAA对某菊花品种茎尖外植体再生丛芽的影响，某研究小组在MS培养基中加入6BA和IAA，配制成四种培养基（见下表），灭菌后分别接种数量相同、生长状态一致、消毒后的茎尖外植体，在适宜条件下培养一段时间后，统计再生丛芽外植体的比率（m），以及再生丛
15、芽外植体上的丛芽平均数（n），结果如下表。回答下列问题：（1）按照植物的需求量，培养基中无机盐的元素可分为_和_两类。上述培养基中，6BA属于_类生长调节剂。（2）在该实验中，自变量是_，因变量是_，自变量的取值范围是_。（3）从实验结果可知，诱导丛芽总数最少的培养基是_号培养基。（4）为了诱导该菊花试管苗生根，培养基中一般不加入_（填“6BA”或“IAA”）。【解析】（1）组成生物体的元素分为大量元素和微量元素两类，6BA属于细胞分裂素类植物生长调节剂。（2）表格中6BA浓度不变，自变量是IAA，取值范围是00.5 mgL1；因变量是再生丛芽外植体的比率和再生丛芽外植体上的丛芽平均数。（3）
16、根据表格中数据，得出1号培养基再生丛芽外植体上的丛芽平均数（n）最小，即诱导丛芽总数最少。（4）6BA可以促进生芽，IAA可以促进生根，为了诱导该菊花试管苗生根，培养基中一般不加入6BA。【答案】（1）大量元素微量元素细胞分裂素（2）IAA浓度丛芽外植体的比率及丛芽平均数00.5 mgL1（3）1（4）6BA（1）植物体内有哪几类激素？组织培养过程中加入植物激素的作用是什么？（2）根据表格数据推测：当6BA相对较高时，_相对较高，此时_（有利于、不利于）根的产生。有5类，分别为生长素类、细胞分裂素类、赤霉素类、乙烯类、脱落酸类。协同调控植物组织培养的脱分化、再分化、生根和丛芽的产生。再生丛芽外
17、植体的比率和再生丛芽外植体上的丛芽平均数不利于植物组织培养原理和过程分析（1）原理：细胞的全能性。理论依据。生物体的每一个细胞都含有本物种所特有的全套遗传物质。表达的容易程度。a受精卵配子细胞体细胞。b分化程度低的细胞分化程度高的细胞。c植物细胞动物细胞。体内细胞未表现全能性的原因：基因的表达具有选择性。（2）植物激素的使用。脱分化阶段细胞分裂素比例较高，以促进细胞的分裂；再分化阶段生长素比例较高，以促进芽与根的形成。（3）光照的使用。脱分化阶段不需要给予光照，再分化阶段需要给予光照，以利于叶绿素的形成。【变式训练】如图是通过土壤农杆菌与植物细胞原生质体共培养的方法获得转基因植物的过程。请回答
18、下列问题。（1）图a表示从已经消毒的叶片中剪取部分植物组织细胞。图b表示用_酶来制备原生质体。（2）图c表示用培养基培养原生质体，为了防止原生质体_，培养基的浓度要适宜。培养一段时间后，将其与_共同培养，使携带目的基因的_进入植物细胞。然后通过离心（图d）的方法，除去多余的土壤农杆菌。（3）图e表示将原生质体培养成_，然后将其转移到含有一定抗生素的_培养基中进行筛选培养（图f）。（4）将获得的含有目的基因的愈伤组织转移到_培养基中继续培养（图g），同时注意调整_的种类和_，最终获得完整的植株（图h）。【答案】（1）纤维素酶和果胶（2）吸水涨破土壤农杆菌重组Ti质粒（3）愈伤组织选择（4）分化植
19、物激素比例动物细胞工程【典例4】（2014课标）某研究者用抗原（A）分别免疫3只同种小鼠（X、Y和Z），每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价（能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数），结果如图所示。若要制备杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的B淋巴细胞（染色体数目40条），并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞（染色体数目60条）按一定比例加入试管中，再加入聚乙二醇诱导细胞融合，经筛选培养及抗体检测，得到不断分泌抗A抗体的杂交瘤细胞。（1）制备融合所需的B淋巴细胞时，所用免疫小鼠的血清抗体效价需达到16 000以上，则小鼠最少需要经过_次免疫后才能有符合要求的。达到要求后的X、Y、Z
20、这3只免疫小鼠中，最适合用于制备B淋巴细胞的是_小鼠，理由是_。（2）细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有_，体系中出现多种类型细胞的原因是_（3）杂交瘤细胞中有_个细胞核，染色体数目最多是_条。（4）未融合的B淋巴细胞经多次传代培养后都不能存活，原因是_。【解析】（1）由图可知，小鼠至少经过4次免疫后，免疫小鼠的血清抗体效价可达到16 000以上，其中Y小鼠的血清抗体效价最高。（2）由于细胞融合是随机的，且并不是所有细胞都能参与融合，融合体系中含有五种细胞：未融合的B淋巴细胞、未融合的骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞、B淋巴细胞相互融合
21、形成的细胞。（3）两个细胞的细胞核融合成一个细胞核标志着融合的完成，杂交瘤细胞中有一个细胞核，染色体数量为两者之和，即100条染色体。（4）未融合的B淋巴细胞不能无限增殖，经多次传代培养后都不能存活。【答案】（1）4YY小鼠的血清抗体效价最高（2）B淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞细胞融合是随机的，且融合率达不到100%（3）1100（4）（经免疫的B淋巴细胞是高度分化的细胞）不能无限增殖（1）动物细胞培养分析。制备单细胞悬液时应该用何种物质处理幼龄动物的器官或组织？动物细胞培养过程有什么特点？（2）正常细胞与癌细胞的区别。癌细胞中数目较多的细胞器：癌细胞能无限增殖的原
22、因：【答案】（1）提示：胰蛋白酶。贴壁生长、接触抑制。线粒体、核糖体癌细胞表面糖蛋白减少，无接触抑制现象动物细胞培养的特殊条件归纳（1）胰蛋白酶的使用：首先用胰蛋白酶处理动物的器官或组织，以制备单细胞悬液；培养过程中发生接触抑制时，同样需要用胰蛋白酶使细胞分散开。（2）避免杂菌污染的措施：培养液及培养用具灭菌处理，加入一定量的抗生素，定期更换培养液。（3）特殊的营养条件。液体培养基。加入动物血清、血浆等。通入氧气以满足代谢的需要。通入二氧化碳以维持培养液的pH。【变式训练】红豆杉，又名紫杉，可从其树皮中分离出高抗癌活性的紫杉醇。下面是某同学设计的有关紫杉醇抗肿瘤实验的研究流程，请分析并回答：（1）酶X是_酶，其主要作用是_
