1、少次多量少量多次流加微机控制流加；整个发酵过程 中不断地调节补料率，维持各项物质的供需平衡。（2）补料分批发酵是介于分批发酵和连续发酵之间的发酵形式；区别于分批发酵技术： 由于补加物料，补料分批发酵系统不一再是封闭系统；区别于连续发酵技术：补料分批系 统并不是连续地向外放出发酵液，罐内的培养液体积（V）不再是个常数，而是随时间（t） 和物料流速（F）而变化的变量（变体积操作）。而高密度发酵是在传统发酵技术上改进的 发酵技术。表补料分批发酵与分批发酵，连续发酵的区别补料函数Fex特征Fin特征发酵方式F二F（t）Fex = 0Fin=0分批发酵（Fin=Fex=0）Fin=Fin（t）补料分批发
2、酵Fex 70Fin乂FexFin二Fex连续发酵（Fin二Fex=0）4.通风发酵设备中的机械搅拌发酵罐必须满足的基本条件？机械搅拌通气发酵罐是一种既具有机械搅拌又有压缩空气分布装置的发酵罐。工作时 必须满足的基本条件是：发酵罐应具有适宜的径高比，高度与直径的比为2.54倍，罐身 越长，氧利用率越高；发酵罐能承受一定压力，由于发酵谜在灭菌及正常工作时，罐内 有一定压力（气压与液压）和温度，因此罐体各部件应具有一定的强度，能承受一定的压 力，发酵罐经加工制造后，必须进行水压试验，水压试验压力为工作压力的1.5倍；发酵 罐的通风搅拌装置要能使气泡分散细碎，使气液充分混合，保证发酵液必须的溶解氧，
3、提 高氧的利用率；发酵罐应具有足够的冷却面积，微生物生长代谢时会放出大量的热量， 不同产品发酵放出的热量各不相同，为控制发酵过程中不同阶段的所需的温度，发酵罐应 具有做狗的冷却面积；发酵罐内应抛光，尽量减少死角，避免藏污纳垢，使灭菌彻底， 避免染菌；搅拌器的轴封应严密，尽量减少泄漏。5.发酵液pH对发酵的影响包括哪些方面？影响酶的结构与活性；%1影响细胞膜所带电荷状态，改变膜的渗透性，影响对营养的吸收利用；%1影响某些底物和中间体的解离，影响菌对营养的利用；%1改变细胞形态，如：青霉素产生菌适宜pH 6.2 - 7.0 ,当pH大于7.0时，膨胀，菌 丝增多，壁的强度减弱，难以耐受内部渗透压；
4、%1改变代谢方向，如谷氨酸产生菌As 1.299 pH 7.0 - 8.0产生谷氨酸;PH5.0-5.8产谷 酰胺和N.乙酰谷酰胺；6 .比底物消耗速率方程？答:底物消耗的快慢也常用比底物消耗速率Qs（g/gh）表示，即相对单位质量干菌体单位时 间内的底物消耗量,Qs = rs/X ;若u用Monod方程表示：7.补料分批发酵的适用范围？Qsmax是最大比底物消耗率高菌体浓度培养（高密度培养）系统；%1存在高浓度底物抑制的系统；如苯酚等，通过流加底物降低抑制。%1存在Crabtree效应的系统（酵母培养中，初糖过高，即使溶氧充足，也会产生乙醇, 影响菌体得率）；%1受异化代谢物阻遏的系统（葡萄
5、糖作碳源时，分解代谢物抑制异化代谢有关的酶合 成）；%1利用营养突变体的系统；%1希望延长反应时间或补充损失水分的系统。Note:Crablree效应:在酵母培养中，糖浓度过高，即使溶解氧很充足，也由糖生成乙醇，从而使菌体得 率下降的现象。细菌Crabtree效应:细菌需氧培养中糖浓度过高生成副产物如醋酸等有机酸，抑制菌体生长。异化代谢物阻遏:指利用葡萄糖等容易被利用的碳源分批培养时，某种酶尤其是与异化代谢有关的 酶的生物合成抑制的现象。也称为分解代谢物抑制作用。8.优良的发酵装置应具有的基本特征包括哪些内容？一个优良的发酵装置应具有严密的结构，必须能完全防止杂菌的污染；具有良好 的液体混合性
6、能及较高的传质、传热速率；具有配套而又可靠的检测及控制仪表。能 够满足不同的发酵工艺要求，以获得最大的生产效率；易于操作。9.控制发酵过程pH的方法？培养基中适当添加生理酸性盐或生理碱性盐；%1培养基中适当添加缓冲剂；磷酸盐；%1自动检控，补酸或碱氨水（NH4）2SO4 CaCO3%1补料：按需补糖；恒速补糖，酸，碱调节；10.生长关联型产物合成动力学方程？产物合成与利用糖类有化学计量关系的发酵，糖提供了生长所需的能量。糖利用速度的 变化与产物合成速度的变化是平行的。如利用酵母菌的酒精发酵和酵母的好气性培养属于 此型。该型为生长关联型，这一类型是由碳原直接氧化进行的初级代谢物的生产，其合成动
7、力学可表为:dP/dt = a uX, a为生氏关联型产物的形成比率（g产物/g菌体）。【图见参考 资料】11.简介单罐连续发酵单罐连续发酵：通常先要进行一段时间的分批发酵.当反应器中的细胞浓度达到一定 程度后，以恒定的流量向反应器中流加培养基,同时以相同流量取出发酵液，使反应器内的发 酵液体积保持恒定.如果在反应器中进行充分的搅拌，则培养液中各处的组成相同，并且也与 流出液的组成相同，成为一个连续流动搅拌罐反应器（CSTR）。单罐连续发酵的控制方式有两 种:a.恒浊器法（turbidostat）通过自控仪表调节输入料液的流量，以控制培养液中的菌体浓 度达到恒定值。b.恒化器法（chemost
8、at）与a相似之处是维持一定的体积，不同之处是菌体 浓度不是直接控制的，而是通过恒定输入的养料中某一种生长限制基质的浓度（共余组分均 为过量）来控制.产生幽的生长最终便由生长限制因素所决定。%1单罐连续发酵动力学以恒化器法培养为例：（1）稀释速率与菌体生长的关系：在连续培养中菌体的物料平衡关系为:V（dX/dt） = FX 0+ xV - FX（净增加量）=（输入量）+（生长量）-（输出量）式中：F:单位时间内输入或输出的培养液体积,L/h； 0:输入料液中的菌体浓度,g/L; V:发酵过程中的培养液的体积,L； X:输出培养液中的菌体浓度,g/L;x:单位时间内单位体积培养液中菌体的增长量,
9、g/Lh;在连续培养中基质的物料平衡关系为:V（dS/dt） = FS0 - FS - Vs（基质浓度的变化）=（输入）（输出）（消耗度）上式两边除以V则:dt = DS0 - DS - s -式aS0 :新鲜培养基中的基质浓度,g/L;S：培养罐中及放出培养液中的基质浓度,g/L;s：单位时间内单位体积培养液中基质的耗用量,g/L h;dS /dt：培养液中基质浓度随时间改变的变化率,g/Lh。12.简介灭菌工程中的对数残留定律对数残留定律：微生物受热死亡的原因是因为高温使微生物体内的一些重要蛋白质发生 凝固、变性、如：某些酶类；从而导致微生物无法生存发生死亡。在灭菌过程中，活菌数逐 渐减少
10、，其减少量随残留活菌数的减少而递减，即微生物的死亡速率与任一瞬时残留的活 菌数成正比，如前页图大肠杆菌的死亡曲线为线性关系，称为对数残留定律，即反映为一级 化学反应动力学为：dN/dt = KN ；N:残存的活菌数;t:灭菌时间（s）; dN/dt:活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。K:灭幽速度常数（s.l）; K也称为反应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与微生物的 种类与加热温度有关。将前式积分得：/No= eft t = 1/Kln NO / N t = （2.303 / K）lg NO/NtN 0 :开始灭菌（t = 0）时原有活菌数；Nt:经时间t后残存活菌数；上式是计算灭菌的基本
11、公式，灭菌速度常数K是判断微生物受热死亡难易程度的基本依 据。各种微生物在同样的温度下K值是不同的,K值越小，则此微生物越耐热。同一微生物在不同的生理条件，生长条件以及灭幽方法等多种因素的影响下，其营养 细胞和芽如的比死亡速率也有极大差异，就热阻而言，如子热阻要比生长期细胞大得多。13.发酵过程中泡沫的控制？在发酵中由于通气，搅拌和幽体代谢所产生的气体分散于液体中，并被一层膜彼此隔 开的一些气泡称为泡沫。机械消沫：浆式消沫器，伞形旋风分离器，超声波;加消沫剂: 天然油脂类，如：植物油，豆油等；聚囊类，如：聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油（泡 敌）等用量为:0.03%；高级醇类，如：十八醇，或十
12、八醇+猪油（青霉素发酵），聚二醇等; 硅酮类，主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物。（CH3）3SiO（Si（CH3）2）nSi（CH3）3不溶于水，单 独使用效果差；与分散剂微晶SiO2一起使用。另一类羟基聚聚二甲基硅氧烷；工艺控制: 综合治理方式，调节通气，搅拌，罐压，不加或少加起泡物质；自动控制。14.简介部分生长关联型产物合成动力学方程？菌体生长和产物合成是分开的。发酵过程可分为两阶段。第一阶段为菌体生长阶段，菌 体生长与基质消耗成正比，无产物生成。第二阶段为产物合成阶段，产物的合成，菌体的生 长和基质的消耗成正比，但菌体生长量比前一阶段要小。某些氨基酸和柠檬酸的发酵属于此种类型，这类发酵的
13、动力学行为可表示为：dP/dt = Q uX + f3X Qp = dP/X dt = a U + B8为非生长关联型产物形成常数（g产物届菌体3。故：产物形成的速度分别受生长关联和非生长关联常数。和3的影响。15.连续发酵的特点?设备方面设备的体积可以减小能合理 的按照发酵阶段实行连续化将原有分批发酵设备改装成连续化有一定困难设 备的合理性和加料设备的精确性要求甚高操作情况操作时间可以缩短总的操作 管理较方便必须与全部工艺系统中的其它工段保持连续一致生产情况中间产物和最终产物稳定生 产系统化可节约人力、物力、 降低生产费用营养成分的利用较分批发酵稍差产物浓度较分批 发酵略低微生物的 情况对微
14、生物的生理、生态和反应 机制比较容易分析杂菌污染的机会较多，菌种发生变异的问题没有解 决名称优存在的问题点复习B1.发酵过程中溶解氧的控制措施？（从供氧和需氧量方面考虑） 答：从供氧和需氧两个方面考虑供氧方: dC/dt = KL u （C* -CL）dC/dt :单位时间内培养液氧浓度的变化，（mmolO2/L） /hKL :氧传质系数,（m/h）; a :比表面面积，m2/m3C*：在罐内氧分压下培养液中氧的饱和浓度mmol/LCL :发酵液中的溶02浓度mmol/L由此可见，凡是使KLa和C*增加的因素都能使发酵供氧改善，通常采用：%1在通入的空气中掺入纯氧，使氧分压增高；%1提高罐压，
15、有负作用，需提高设备强度；增加水中C02溶解度，影响pH;%1改变通气速率，其作用是增加液体中夹持气体体积的平均成分。%1增加搅拌作用，改善罐内液体的混合和循环，抑制气泡聚合的效果。从需氧方面考虑：需氧方面的表示：丫二Q02CcY :摄氧率,mmolO2/Lh; Q02：呼吸强度,mmol02/g菌（干重）h； Cc :菌的浓度,g/L 若氧浓度处在暂时的稳定状态，贝U： KLa （C* CL） = Q02Cc显然，那些影响此方程的因子会改变溶氧的浓度。（1）通过减少菌的生长速率也可达到限制菌对氧的大量消耗从而提高溶氧水平。这样看 来有“消极作用”，但 从总的经济效果来看，这样是合理的。（2）
16、由于氧传质的温度系数比生长速率的温度系数低，降低培养温度可得到较高的溶氧 值。2.什么是分批发酵、补料分批发酵和连续发酵？分批发酵是指生物反应器的间歇操作，在发酵过程中，除了不断进行通气（好氧发酵）和 为调节发酵液的pH而加入酸碱溶液外，与外界没有其它物料交换。这种培养方式操作简单, 是一种最为广泛使用的方式。分批发酵的主要特征是所有工艺变量都随时间而变化。主要 的工艺变量是各种物质的浓度及其变化速率。补料分批发酵技术的含义：在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统中补加一定 物料的培养技术。通过向培养系统中补充物料，可以使培养液中的底物浓度较长时间地保 持在一定范围内，即保证微生物的生长需要
17、，又不造成不利影响，从而达到提高容量产率， 产物浓度和得率的目的。连续发酵的概念：亦称连续培养是指以相同的速度向培养系统内连续流加新鲜的培养 基并同时输出发酵液，使培养系统内各状态变量恒定的培养方法。相对于分批发酵的封闭 培养系统和补料分批发酵的半开放培养系统，连续发酵是一个开放的培养系统。它可以根 据发酵目的，把微生物分批培养到某个阶段后，人为地固定其生长和代谢速率。也就是说, 连续发酵中，可以人为地将微生物的生长代谢活动保持在最旺盛状态，而且pH、营养成分、 溶解氧等状态变量也可通过系统外部调控保持恒定，如此连续发酵的时间越长，设备利用 率就越高。（补料分批发酵与分批发酵，连续发酵的区别？
18、补料分批发酵是介于分批发酵和连续 发酵之间的发酵形式；由于补加物料，补料分批发酵系统不一再是 封闭系统；补料分批系统并不是连续地向外放出发酵液，罐内的培 养液体积（V）不再是个常数，而是随时间（t）和物料流速（F）而变化的变量（变体积操作）。3.由于基因工程菌具有自身特点，在进行微生物发酵工程时应注意考虑哪些因素？质粒不稳定性，产物不稳定性；建立合适的载体；选择适当的宿主并施加选择压，控制基因过表达，控制培养条件，固定化重组菌可以提高基因工程菌的稳定性。4.什么是高细胞浓度培养技术？高细胞浓度培养技术的原理是什么？进行高细胞浓度培养需要解决的关键问题？进行高细胞浓度培养常用的方法?高细胞密度发
19、酵是一个相对概念，是指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度比普通发酵培养有显著的提高，最终提高特定产物的比生产率。用以描述的单位是干细胞重量/升（DCW/ L） o原理：它采用增加发酵菌种对数期的生长时间、相对缩短衰亡时间来提高菌体的发酵 密度，极大地改进了发酵工艺，最终提高产物的比生产率（单位体积单位时间内产物的产量）, 不仅可减少培养体积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期，减少设备投资从而降低生产成本，在一定程度上减少废水量，极大地提高了发酵产品在市场上的竞争力。建立高细胞密度发酵试验方案可从三个方面的考虑:（1）使用最低合成培养基以便进行准确的培养基设计和计算生长得
20、率，这也有助于避免引入对细胞生长不利的养分限制；（2） 细胞生长速率应优化，使得碳源能被充分利用并获得较高的产率，用养份流加来限制 菌的生长速率还能控制培养物对氧的需求和产热速率；（3） 可用碳源作为限制性养分，因为其用量比其他养分大且易控制，为了能得到最大的细 胞浓度和减轻连续恒化培养所带来的菌种不稳定等问题，：ft采用补料分批发酵来实现高密 度培养。常用方法：1.高密度发酵生物反应器：2重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键技术是补料策略，根据重组幽的生长特点及产物的表达方式，采用合理的营养物流加方式。碳源和 氮源是两种常用的限制性基质，葡萄糖因细菌利用快且价廉易得，己广泛用作重组菌高密 度发酵
21、的限制性基质。大肠杆菌在过量葡萄糖的条件下会发生“葡萄糖效应”，积累大量有 机酸而影响重组菌的生长和外源蛋白的有效表达因此，大肠杆菌高密度发酵中合理流加碳 源使葡萄糖效应降低，是发酵成功的关键，常用的流加模式有3种：恒速流加补料、变速 补料和指数流加补料3高浓度细胞连续培养中除去抑制物质的方法：1）透析培养：是通过半透膜是培养液与培养基接触，培养液中的细胞不能透过半透膜, 只有反应产物透过膜进入培养基溶液。在此类培养中，透析装置作用有二： 将生长抑制 性物质透过膜排出培养罐，从而减少抑制作用。 使培养液储罐中的营养物透过膜进入微 生物培养罐，补充消耗。2） 萃取培养：像发酵罐内加入难溶于水的有
22、机溶剂，选择性的萃取抑制生长的物质， 从而减轻有毒负作用的产物对发酵速率的抑制作用，目的在于获取尽量多的代谢产物，减 少副作用，提高菌体浓度。需要选择分配系数大、对微生物毒副作用小的廉价的溶剂。3） 过滤培养：采用只能使培养液通过而不能使微生物通过的微滤膜，边过滤边发酵的 方法。过滤的同时流加物料。滤液沿着与过滤膜垂直的方向通过膜流出，称为错流过滤。4）细胞固定化包埋培养:：细胞固定化包埋培养技术是以应用化学或物理手段，将细胞包埋 在多孔载体内部，可使细胞保持活性并可反复利用的细胞高密度培养技术。该技术可提高 单位时间、单位容积的生产能力，使发酵产物易于与菌体分离，且固定化细胞对杂菌的污 染和
23、代谢产物的反馈抑制作用比游离细胞具有更高的抵抗力5.生物反应器的类型，发酵对微生物反应器设计的要求？三 生物反应器的类型对微生物反应器设计的基本八要求1.避免将需蒸汽灭菌的部件与其它部件连接，因为即使阀门关闭，细菌也可在阀门 内生长；2.尽量减少法兰连接，因为设备震动和热膨胀会引起连接处的移位，导致染菌。应 全部焊接结构（焊接部位磨光）消除积蓄耐灭菌物质3.防止死角、裂缝等一类情况，以避免固体物质在此堆积，形成使杂菌获得热抗性的环境；4.发酵系统的某些部分应能单独灭菌；5.与反应器相通的任何连接能应采用蒸气加以密封，如取样门在不取样时也要一直通蒸气；6.所有阀门要易清洗、易使用、易火菌，球阀、
24、隔膜阀和截止阀比较好;7.反应器应始终保持正压以排除渗漏；8.为了便于清洗，反应器主体应尽量简单。7.通过Fin和Fex来介绍分批发酵、补料分批发酵和连续发酵各自的特点？8.大规模微生物发酵工程生产，选择菌种应遵循的原则是什么？（微生物发酵工程对微生 物菌种的要求主要包括哪些内容）发酵工程对生产菌种的基木要求1） 菌种应为“纯种培养”；2） 具有稳定的遗传性。3） 能生长出营养细胞、如子或其它可再生的单位；4） 在逐级放大培养、生长迅速而强健；5） 应在短时间内合成目的产物；6） 自我保护、防污染能力强。7） 能产生多量目的产物、在多组分产物中目的组分应易于分离。9.在灭菌过程中，影响培养基灭
25、菌的因素有哪些？ 培养基成分（2）培养基的物理状态（3）培养基的pH值（4）培养基中的微生物数量5）微生物细胞中水含量6）微生物细胞菌龄7）微生物的耐热性8）空气排除情况9）搅拌10）泡沫10 .为什么说湿热灭菌中高温短时优于低温长时？培养基加热灭菌时:微生物固然会被杀死，但培养基中的有用成分也会随之遭到破坏，那 么有何良策可以即达到灭菌要求，同时乂不破坏或尽可能少破坏培养基中的有用成分。微生 物的死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分的破坏速率的增加倍数。当灭菌温度上升时, 微生物杀死速率的提高要超过培养及成分的破坏速率的增加。可以在灭菌时选择较高的温 度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌
26、程度，同时又可减少营养物质的损失。11.如何提高高产菌的稳定性？（1） 首先在菌种选育中应把菌株产量分布中的稳度作为评价菌株的条件之一。不仅以产量 局低为基准；（2） 菌株选育中避免使用含有多核的包子和菌丝片断；（3） 用单倍化试剂处理高产幽株，有提高幽株稳定性的作用；（4） 在培养基中加入某些金属离子可增加菌株的稳定性；（5） 利用营养缺陷型和原养型在生理和抗性上的不同，在发酵培养基中加入抗生素也会有 防止回复突变发生的效果；（6） 在生产过程中应尽力减少菌种传代次数，这是发酵工业中普遍遵循的原则（7） 杂菌污染、发酵条件改变都能引起发酵生产产量波动，应注意区分原因。12.提高次级代谢产物产
27、量的方法？1.补加前体类似物:在合成途径己基本清楚的条件下，向发酵培养集中补加前体物或 前体类似物是增加次级产物的有效方法，如青霉素G的生产中，苯乙酰.CoA是限速因子， 补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的产量。需要说明的是，次级代谢产物形成中并 不是所有前体类似物都是限制因2.加入诱导物:把一些对次级代谢产物产生有诱导作用的物质加入发酵培养基中会增加产 量，如增加甲硫氨酸或硫腿可使顶头泡霉增加头如霉素C产量3.防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生:碳分解代谢物阻遏或抑制是指微生物在混合碳源发 酵时优先利用速效碳源（如葡萄糖），且该碳源的代谢产物会抑制其他非速效碳源代谢相关的 基因表达和蛋白活性
28、，从而影响非速效碳源利用的现象.使用寡糖、多糖等缓慢利用的碳 源，葡萄糖与麦芽糖、葡萄糖与蔗糖、葡萄糖与淀粉混合碳源的利用，也都能减少碳分解 阻遏的发生。4.防止氮代谢阻遏的发生：氮代谢阻遏是指能够被微生物迅速利用的氮源（如铉离子）能 阻遏某些参与其它含氮化合物代谢的酶的合成。避免使用高浓度的铉盐作氮源以防止氮代 谢阻遏的发生，是抗生素发酵工业生产中比较成熟的经验。为防止氮分解阻遏的发生，可 选用黄豆饼粉、蛋白豚类等物质为主要氮源。5.筛选耐前体或前体类似物的突变株：前体添加过量会对菌体产生毒害作用。筛选对前体 及其结构类似物有抗性的突变株以减少或消除前体的反馈阻遏，可获得高产幽株。6.选育抗
29、抗生素突变株：链霉素、氯霉素、金霉素等多种抗生素都具有抑制菌体自身合 成蛋白质的能力。一株高产抗生素产生菌，必然应具有对其自身所分泌的抗生素的抗性。 筛选抗抗生素生产菌也就成了菌种选育中的常用方法。如金霉素、链霉素产生菌的抗性菌 株其产量数倍增加。7.筛选营养缺陷型的回复突变株：次级代谢产物都来自初级代谢产物，其营养缺陷型的产 量一般都较低，研究结果表明其回复突变型可提高次级代谢产物的生成量8.抗毒性突变株的选育：重金属离子、羟胺类似物质对B 内酰胺类抗生素生产菌有毒害 作用，但与抗生素相结合后其毒害作用消失。选择适当浓度的此类毒性物质使其恰好抑制 产生菌生长，在此条件下能生长的菌株，应为抗 生素类物质过量生产的突变株。13.试述提高初级代谢产物产量的方法？1 .使用诱导物2.
