1、DNA连接酶和限制酶的关系归纳提升与DNA相关的五种酶的比较名称作用部位作用结果限制酶磷酸二酯键将DNA切成两个片段DNA连接酶将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶将单个脱氧核糖核苷酸依次连接到单链末端DNA （水解）酶将DNA片段水解为单个脱氧核糖核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链（3）载体种类：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等。质粒的特点深化拓展载体上标记基因的作用载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素
2、，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：1有关工具酶的判断（1）限制酶只能用于切割目的基因（）（2）切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列（3）DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来（4）EcoliDNA连接酶既可连接平口末端，又可连接黏性末端（5）限制酶也可以识别和切割RNA（6）限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶（2有关载体的判断（1）载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因（2）每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点（）（3）质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体（）（
3、4）载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达（）（5）外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制（下图中的图1和图2分别表示的是EcoR限制酶和Sma限制酶的作用示意图，据图分析：（1）请说出EcoR限制酶和Sma限制酶识别的碱基序列及切割的位点。提示EcoR限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；Sma限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在C和G之间。（2）以上实例说明限制酶有何特性？提示说明限制酶具有专一性（特异性）。命题点一工具酶的应用分析1（2018北京，5）用Xho和Sal两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切
4、位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（）A图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B图2中酶切产物可用于构建重组DNAC泳道中是用Sal处理得到的酶切产物D图中被酶切的DNA片段是单链DNA答案D解析通过图1可知，两种限制性核酸内切酶切割DNA分子的不同部位，说明两种限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列不同，A正确；图2中的酶切产物是DNA分子片段，可用于构建重组DNA，B正确；观察图1可知，该DNA片段有3个Sal酶切位点，故用Sal处理后，可形成4个DNA分子片段，电泳后出现4条电泳带，C正确；限制性核酸内切酶作用的是双链DNA片段，因此图中被酶切的DNA片段应是双链DNA，D错误。2用限制
5、酶EcoR单独切割某普通质粒，可产生14kb（1kb即1000个碱基对）的长链，而同时用限制酶EcoR、Mbo联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA片段，见下图（其中*表示EcoR限制酶切割后的一个黏性末端）。若用Mbo限制酶单独切割该普通质粒，则产生的DNA片段的长度为（）A2.5和5.5 B2.5和6C5.5和8 D6和8解析依图示可知，该质粒上有1个EcoR限制酶的切点、2个Mbo限制酶的切点，故用限制酶Mbo单独切割该质粒时，将产生长度为6和8的两种片段。3（2016全国，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位
6、点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的）。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：（1）经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_酶切后的产物连接，理由是_。（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_，不能表达的原因是_。（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_和_，其中既能连接黏性末端又能连接平口末端的是_。答案（1）Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端（2）甲、丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的
7、基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录（3）EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶解析（1）分析图（a）可知，限制酶Sau3A与BamH切割DNA后形成的黏性末端相同，故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。（2）构建基因表达载体时，为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达，目的基因应插入在启动子和终止子之间，据此可判断甲、丙均不符合要求，目的基因均不能表达。（3）常见的DNA连接酶有Ecoli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平口末端。科学思维限制酶的选择方法根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。（1
8、）应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst。（2）不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma。（3）为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst和EcoR两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）。命题点二载体的应用分析4（2019南京高三一模）质粒是细菌中的有机分子，下列对其描述，不正确的是（多选）（）A质粒完全水解后最多可产生4种化合物B质粒能够自主复制C质粒中含有两个游离的磷酸基团D质粒是基因工程的工具酶答案ACD解析质粒是一种具有自主复制能力的很小的双链环状DNA分子，不含游离的磷酸基团，完全
9、水解后最多可产生6种化合物：脱氧核糖、磷酸、4种含氮碱基，A、C错误，B正确；质粒是基因工程的载体，不是工具酶，D错误。5（2016全国，40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamH酶切后，与用BamH酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：（1）质粒载体作为基因工程的
10、工具，应具备的基本条件有_（答出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有_的固体培养基。（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_。答案（1）能自我复制、具有标记基因（2）二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒
11、（或含有重组质粒）二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素（3）受体细胞解析（1）质粒作为载体应具备的基本条件有：能自我复制、具有标记基因、含有一个至多个限制酶切割位点等。（2）由题意可知，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞中均不含有氨苄青霉素抗性基因，所以在含有氨苄青霉素的培养基上均不能生长。质粒载体上含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，插入了目的基因的重组质粒中仅含有氨苄青霉素抗性基因，所以含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞均能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，但前者可以在含有四环素的培养基上生长而后者不能，所以可用含有四环素的培养基，筛选出含有插入了目的基
12、因的重组质粒的大肠杆菌单菌落。（3）噬菌体属于病毒，病毒增殖过程中所需的原料、酶等均来自于受体细胞。考点二基因工程的操作过程与蛋白质工程1基因工程的基本操作过程（1）获取目的基因目的基因：主要是指编码蛋白质的基因。获取目的基因的方法a直接分离法：从自然界已有的物种中分离，如从基因组文库或部分基因文库中获取。b人工合成：如果基因比较小，脱氧核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。扩增目的基因：通过PCR技术扩增目的基因。（2）构建基因表达载体基因工程的核心目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的组成小贴士
13、启动子起始密码子，终止子终止密码子（1）启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别、结合的部位。（2）终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端。作用是使转录过程停止。（3）起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。构建过程（3）将目的基因导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法显微注射法感受态细胞法受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞染色体的DNA上表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2
14、处理细胞感受态细胞重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子（4）检测和鉴定目的基因2基因工程的应用（1）植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质和利用植物生产药物。（2）动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。（3）比较基因治疗与基因诊断项目原理操作过程进展基因治疗基因表达利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗（疾病）临床实验诊断碱基互补配对制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况应用3.蛋白质工程（1）
15、流程图A转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。（2）结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。（3）应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。1有关基因工程原理与操作的判断（1）设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列（2）用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列（）（3）为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体（4）抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达（）（5）检测目的基因是否成功表达可用抗原抗体杂交技术（）（6）应用DNA分子杂交法，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达（2有关基因
16、工程的应用及蛋白质工程的判断（1）将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，可获得能产生人干扰素的菌株（）（2）利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中（3）由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用（4）蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质（）（5）蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构（据图分析抗虫棉的培育过程（1）该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？提示目的基因是Bt毒蛋白基因，载体是Ti质粒。用同一种限制酶处理目的基因
17、和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。（2）该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？提示采用的方法是农杆菌转化法，由于Ti质粒上的TDNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了TDNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞染色体的DNA上。（3）该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？提示抗原抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。1基因组文库与cDNA文库（部分基因文库）的比较文库类型部分基因文库基因组文库构建基因文库的过程某种生物发育的某个时期的mRNA逆转录cDNA与载体连接导入受体菌群体某种生物体内
18、全部DNA限制酶许多DNA片段分别与载体连接导入受体菌群体文库大小小大基因中启动子无有内含子基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以说明基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性2.通过PCR技术扩增目的基因（1）PCR的含义：是一项在生物体外通过酶促反应有选择地大量扩增目的基因或DNA序列的技术。（2）目的：短时间内大量扩增目的基因。（3）原理：DNA分子半保留复制。（4）前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。（5）过程加入反应物质：在离心管中加入所需要的模板DNA、引物、4种
19、脱氧核苷酸以及TaqDNA聚合酶。变性：加热至94左右，使DNA中的氢键断裂，双链解开。退火（复性）：冷却到55左右，引物与单链DNA相应互补序列结合。延伸：加热至72左右，在TaqDNA聚合酶的作用下，沿模板延伸子链，最终合成2条DNA分子。3蛋白质工程与基因工程的比较（1）区别蛋白质工程基因工程过程预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核糖核苷酸序列获取目的基因基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的
20、蛋白质（2）联系蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。命题点一基因工程操作程序的分析全国，38）回答下列问题：（1）博耶（H.Boyer）和科恩（S.Cohen）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_（答出两点即可）。（2）体外重组的质粒可通过Ca2参与的_方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与_组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是_。（
21、3）真核生物基因（目的基因）在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用_的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加_的抑制剂。答案（1）体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达（2）转化外壳蛋白（或噬菌体蛋白）细菌（3）蛋白酶缺陷型蛋白酶解析（1）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是基因工程。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。（2）重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬
22、菌体DNA和外壳蛋白（或噬菌体蛋白）进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。（3）为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。2（2018海南，31）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。（1）用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜_（填“受伤的”或“完好的”）叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是_。（2）若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中_已转移到植物细胞
23、中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为11，则说明甜蛋白基因已经整合到_（填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”）中。（3）假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用_作为外植体进行组织培养。（4）通常，基因工程操作主要有4个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为答案（1）受伤的叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞（2）甜蛋白基因核基因组（3）茎尖（4）按照人们的愿望进行
24、设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型解析（1）用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜受伤的叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，理由是叶片伤口处的细胞会释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞。（2）若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中甜蛋白基因已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为11，则说明甜蛋白基因已经整合到核基因组中。（3）假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用茎尖作为外植体进行组织培养。因此，基因工程的含义可概括为按照人们的愿望进行设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型。命题点二基因工程与蛋白质的关系的分析3（2018天津，31）甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。（1）改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用_技术扩增，并将其中某些基因（不包括表面抗原基因）内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与
