1、I血液中 45 种有毒生物碱成分的液相色谱-串联质谱检验方法1 范围本技术规范规定了血液中45种有毒生物碱成分（见附录A）的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检 验方法。 本技术规范适用于血液中45种有毒生物碱成分的定性定量分析。也适用于尿液及体外样品、可疑物证中45种有毒生物碱的定性分析。2 规范性引用文件 下列文件中对本技术规范的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本技术规范。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本技术规范。GA/T 122 毒物分析名词术语GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义GA/T 122
2、中界定的术语和定义适用于本技术规范。4 原理 本法利用 45 种有毒生物碱成分可在碱性条件下被有机溶剂从血液中提取出来的特点，以 SKF525A为内标，用液相色谱-串联质谱法的多反应监测（MRM）模式进行检测，经与平行操作的有毒生物碱对照品比较，以保留时间、两对母离子/子离子对进行定性分析；以定量离子对峰面积为依据，内标法或外标法定量。5 试剂和仪器5.1 试剂5.1.1 乙腈。5.1.2 甲酸：优级纯。5.1.3 甲醇。5.1.4 乙醚：分析纯。5.1.5 乙酸铵。5.1.6 超纯水：由纯水系统制得，电阻率18.2Mcm。5.1.7 pH9.2 硼砂缓冲液。5.1.8 流动相缓冲液：20mm
3、ol/L 乙酸铵和 0.1%甲酸缓冲液：分别称取 1.54g 乙酸铵和 1.84g 甲酸置于1000mL 容量瓶中，加水定容至刻度，pH 值约为 4。15.1.9 45 种有毒生物碱对照品标准溶液：分别精密称取 45 种有毒生物碱对照品各适量，用甲醇配成1.0mg/mL 对照品标准储备溶液，置冰箱中冷冻保存，保存时间为 12 个月。试验中所用其它浓度的对照品标准溶液均从上述储备液用甲醇稀释而得。5.1.10 内标物 SKF525A 对照品标准溶液：精密称取 SKF525A 适量，用甲醇配制成 1.0mg/mL SKF525A 对照品标准储备溶液，置冰箱中冷冻保存，保存时间为 12 个月。将储备
4、液用甲醇稀释得 5g/mL SKF525A内标工作液，置冰箱中冷藏保存，保存时间为 6 个月。注：本技术规范所用试剂除另有说明外均为色谱纯，试验用水为一级水（见GB/T 6682规定）。5.2 仪器5.2.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。5.2.2 分析天平：感量 0.1mg。5.2.3 涡旋混合器。 5.2.4 离心机。 5.2.5 精密移液器。5.2.6 恒温水浴锅。6 测定步骤6.1 样品预处理6.1.1 待测样品取待测血液 1mL，加 5g/mL SKF525A 内标工作液 10L，加 1mL pH9.2 硼砂缓冲液后，用乙醚 3mL提取，涡旋混合，离心，将乙醚层转
5、移至另一试管中，同法提取两次，合并乙醚液，置 60C 水浴中挥干，残留物用 100L 流动相（乙腈流动相缓冲液=7030）定容，供 LC-MS/MS 分析。6.1.2 空白样品取空白血液 1 mL，按“6.1.1”项下进行操作和分析。6.1.3 添加样品取空白血液 1 mL，添加待测样品中出现的可疑有毒生物碱对照品，按“6.1.1”项下进行操作和分析。6.2 测定6.2.1 液相色谱-串联质谱仪参考条件a） 液相色谱柱：Capcell Pak C18 （250mm2.0mm，MG 5m）或相当者； b） 柱温：室温；c） 流动相：V（乙腈）V（流动相缓冲液）=7030；d） 流速：200L/m
6、in； e） 进样量：5L；f） 离子源：电喷雾电离-正离子模式（ESI+）；g） 检测方式：多反应监测（MRM）；h） 离子源电压（IS）：5500V；i） 碰撞气（CAD）、气帘气 （CUR）、雾化气 （GS1）、辅助气2 （GS2）均为高纯氮气，使用前调节各气流流量以使质谱灵敏度达到检测要求；2j） 各成分去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）等电压值应优化至最佳灵敏度（见附录A）。6.2.2 定性分析定性分析以两对母离子/子离子对进行（见附录 A）。如果待测样品出现某一有毒生物碱两对母离子/子离子对的特征色谱峰，保留时间与添加样品中相应对照品的色谱峰保留时间比较，相对误差在2%内，且所选择
7、的离子对相对丰度比与添加对照品的离子对相对丰度比之相对误差不超过表 1 规定的范围，则可认为待测样品中检出此种有毒生物碱成分。表 1 相对离子对丰度比的最大允许相对误差（%）相对离子对丰度比 50 2050 1020 10允许的相对误差 20 25 30 506.2.3 定量分析6.2.3.1 定量方法根据待测样品中有毒生物碱的浓度情况，用空白血液添加相应有毒生物碱对照品，采用内标法或外标法，以定量离子对峰面积进行定量测定。定量方法可采用工作曲线法或单点校正法。采用工作曲线法时待测样品中有毒生物碱的浓度应在工作曲线的线性范围内。配制系列浓度的有毒生物碱血液质控样品，按“6.1.1”进行样品处理
8、，按“6.2.1”条件进行测定，以有毒生物碱和内标定量离子对峰面积比（或有毒生物碱定量离子对峰面积）为纵坐标，血液中有毒生物碱浓度为横坐标绘制工作曲线，用工作曲线对待测样品中有毒生物碱浓度进行定量。采用单点校正法时待测样品中有毒生物碱的浓度应在添加样品中有毒生物碱浓度的50%内。6.2.3.2 结果计算6.2.3.2.1 内标-工作曲线法在系列浓度的有毒生物碱血液质控样品中，以有毒生物碱与内标SKF525A定量离子对的峰面积比（Y）为纵坐标、有毒生物碱质量浓度（C）为横坐标进行线性回归，得线性方程。根据待测样品中有毒生物碱与内标 SKF525A 定量离子对峰面积比，按公式（1）计算出待测样品中
9、有毒生物碱的质量浓度。CY a （1）b式中：C待测样品中有毒生物碱质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；Y待测样品中有毒生物碱与内标峰面积比；a线性方程的截距； b线性方程的斜率。6.2.3.2.2 内标-单点校正法根据待测样品及添加样品中有毒生物碱与内标SKF525A定量离子对峰面积比，按公式（2）计算出待测样品中有毒生物碱的质量浓度。3 A A c i （2）A AiA待测样品中有毒生物碱的峰面积；A添加样品中有毒生物碱的峰面积；Ai待测样品中内标的峰面积；Ai添加样品中内标的峰面积；c添加样品中有毒生物碱的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）。6.2.3.2.3 外标-工作曲线
10、法在系列浓度的有毒生物碱血液质控样品中，以有毒生物碱定量离子对的峰面积（Y）为纵坐标、有毒生物碱质量浓度（C）为横坐标进行线性回归，得线性方程。根据待测样品中有毒生物碱定量离子对峰面积，按公式（3）计算出待测样品中有毒生物碱的质量浓度。 （3）Y待测样品中有毒生物碱的峰面积；6.2.3.2.4 外标-单点校正法根据待测样品及添加样品中有毒生物碱定量离子对峰面积，按公式（4）计算出待测样品中有毒生物碱的质量浓度。Ac （4）Ac 添加样品中有毒生物碱的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）。6.2.3.3 平行试验待测样品同时平行测定两份，双样相对相差按公式（5）计算：| C1 - C2|RD
11、（%）= 100 （5）4RD相对相差； C1、C2两份待测样品平行定量测定的质量浓度；C两份待测样品平行定量测定质量浓度的平均值。6.2.4 空白试验用空白血液进行空白试验。7 结果评价7.1 定性结果评价7.1.1 阴性结果评价如果待测样品中仅检出内标SKF525A未检出附录A中45种有毒生物碱成分，则阴性结果可靠；如果待测样品中未检出内标，则阴性结果不可靠。7.1.2 阳性结果评价如果待测样品中检出附录A中有毒生物碱成分且空白样品无干扰，则阳性结果可靠；如果待测样品中检出有毒生物碱成分且空白样品亦呈阳性，则阳性结果不可靠。7.2 定量结果评价平行试验中两份检材的双样相对相差不得超过20%
12、（腐败检材不得超过30%），结果按两份检材浓度的平均值计算，否则需要重新测定。8 检出限和定量下限内容见附录A5雪上一枝蒿甲素 Bullatine 2.47344.158.1344.1235.0344.158.1 665460氧化苦参碱 Oxymatrine 2.46264.7247.2264.7205.1264.7247.2 4042氧可酮 Oxycodone 2.44316.2298.1316.2241.1316.2298.1 273680延胡索乙素Tetrahydropalmatine3.63356.4192.3356.4165.3356.4192.3 3534药根碱 Jatrorrhi
13、zine 3.11335.8292.2335.8321.4335.8292.2 4440罂粟碱 Papaverine 3.62340.1202.2340.1324.3340.1202.2 3741原阿片碱 Protopine 3.03352.1336.1352.1308.2352.1336.1 41表 A.2 45 种有毒生物碱的检出限（LOD）和定量下限（LOQ）（单位：ng/mL）化合物 LOD LOQ 化合物 LOD LOQ阿托品 1 2 毛果芸香碱 0.5 2巴马汀 0.5 1 马钱子碱 1 2草乌甲素 0.1 0.2 那可汀 0.1 0.1茶碱 2.5 10 羟基喜树碱 25 50次
14、乌头碱 0.1 0.1 青藤碱 5 7蒂巴因 1 1 秋水仙碱 2.5 10东莨菪碱 0.2 0.5 山梗菜碱 0.5 1毒扁豆碱 0.5 0.5 山莨菪碱 25 50二羟丙茶碱 5 10 士的宁 0.2 0.5粉防己碱 2 10 石杉碱甲 10 20高三尖杉酯碱 0.5 1 筒箭毒碱 5 10后马托品 1 2 乌头碱 0.1 0.1槐定碱 2 5 小檗碱 0.2 0.5胡椒碱 0.1 0.1 新乌头碱 0.1 0.2加兰他敏 0.5 1 喜树碱 2 58可待因 2 2.5 雪上一枝蒿甲素 1 2可卡因 0.1 0.1 氧化苦参碱 5 8可可碱 20 40 氧可酮 1 2苦参碱 0.2 0.5 延胡索乙素 0.1 0.2利血平 0.5 1 药根碱 2 5吗啡 5 7 罂粟碱 0.1 0.2麻黄碱 0.5 1 原阿片碱 1 2麦角新碱 0.5 19
