1、整理P53蛋白的研究与发展综述3.建设项目环境影响评价文件的审查要求1.环境的概念（3）环境影响分析、预测和评估的可靠性；（三）环境价值的定义（7）环境影响评价的结论。（3）安全现状评价。2.规划环境影响评价的内容1.法律1）采取防护措施。（1）生产力变动法P53蛋白的研究与发展综述 学院 药学院课程名称 生物技术制药年级 2010级制药工程组员 刘巧 曾琼英 陆凤慧 刘杨 姚瑶指导教师 胡昌华 廖国建 2013 年5月 22日 P53蛋白的研究与发展综述刘巧；曾琼英；刘杨；陆凤慧；姚瑶西南大学药学院 重庆 400716【摘要】P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高，研究最透彻，功能最强大的
2、一种抑癌基因。随着对其研究的深入发展,涉及的内容和应用范围越来越广泛。本文综合概述了P53基因的结构、性质、应用、发展历史，以及上市药物和在研药物，并详细介绍了典型重组P53药物今又生。【Abstract】 P53 gene is a tumor suppressor gene .it can be active with most of the cancer cell. This article provides a comprehensive overview of its structure , character , application, development history o
3、f the P53 gene , as well as marketed drugs and investigational drugs , and gave details of the typical restructuring P53 drugs Gendicine.【关键词】 P53基因； 抗癌； 应用 ；今又生1 前言 仅从90年代至今，关于p53作为肿瘤抑制因子的研究报道就有多于20000篇，是什么让p53得到科学界如此多的关注？在1979年，p53首次被发现。在上世纪80年代，TP53（p53的编码基因）被认为是一个原癌基因（proto-oncogene），直到90年代早期，TP
4、53被广泛认为是一个肿瘤抑制基因，它处在细胞各种胁迫反应途径的十字路口上。p53在细胞周期捕获，DNA修复，细胞衰老、分化、调亡等过程中都起着重要的作用，它能修复损伤细胞，或者除去严重损伤的细胞从而避免这些细胞对机体的危害作用。由于p53的多功能性，在它的编码基因TP53上发现很多突变都会影响到p53的功能。在很多（75%）人的癌症中都存在p53的突变。有关p53的研究已经拓展到毒物学和治疗学领域。P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。在短短的十多年里，人们对P53基因的认识经历了癌蛋白抗原，癌基因到抑癌基因的三个认识转变，现已认识到，引起肿瘤形成或细胞转化的P53蛋白是P53基因突
5、变的产物，是一种肿瘤促进因子，它可以消除正常P53的功能，而野生型P53基因是一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起重要作用。2 p53基因的简述2.1 p53蛋白的研究历史及现状第一个10年：1979年，英国癌症研究基金会、美国普林斯顿大学的研究者Lionel Crawford,，David.P.Lane等人首次追踪到了p53基因的踪迹。这些研究者或许没有料到，他们的发现开启了现代肿瘤研究与治疗的新时代。不久以后，俄罗斯科学家 Peter Chumakov从小鼠体内克隆到了这个基因你的完整版本。因为这一基因在细胞中翻译后产生的蛋白质(protein)的分子量为53千道尔顿，故而被命名为p53。
6、不过，在发现伊始，p53基因并未受到重视，甚至在最初的10年中，p53一直被视为能够诱发肿瘤产生的癌基因。导致这样南辕北辙认识的症结在于科学家在研究时并未找对p53基因的正确版本。众所周知，一条基因由一系列脱氧核糖核酸按照相应的顺序彼此串联而成，如果其中的某个或某些核苷酸发生改变就意味着这条基因发生了突变，而起初研究者拿到的基因就是p53的突变版本，按照这一版本翻译成的蛋白质自然就无法行使正常p53基因的功能。第二个10年蹉跎十年之后，美国约翰霍普金斯医学院的分子生物学家Bert Vogelstein最终找到了正确的p53基因，即野生型p53。不但如此，科学家的发现还为这一基因摘掉了癌基因的恶
7、名：与此前认识恰恰相反的是，p53是一个在人体内发挥广泛作用的强有力的抑癌基因。 p53蛋白实际上是一种转录因子，在细胞处于应激状态时可被诱导表达，从而促进细胞进入细胞周期的停滞阶段，继而凋亡或者衰老第三个10年 自打1990?年，美国国立卫生研究院的Freuch?Anderso博士启动了全球第一个真正意义上的基因治疗临床试验以来，已有1000余例基因治疗临床试验获批上马，其中大约70%是针对肿瘤，而p53基因更是成为其中不可或缺的靶点。在我国，深圳赛百诺基因技术有限公司从1998?年开始进行重组腺病毒p53?抗癌注射液的临床试验，2003年完成了全部临床试验，于2004?年1?月获得我国SF
8、DA?批准的新药生产批文，成为世界上第一例正式上市的基因治疗产品。自从p53基因被认定为一种重要的抑癌基因以来，它一直就是焦点中的焦点。1993年，p53还被科学杂志评为当年的明星分子。直到如今，每隔一段时间，国际上就会召开一次以p53为主题的学术例会。有关p53的研究也逐渐从癌症领域发散开来，在其他疾病和生理过程中，也出现了p53长袖善舞的身影。这些发现使之成为分饰多角的最熟悉的陌生人。例如2007年，美国先进研究所的科学家在自然杂志上报告称，他们在小鼠中观察到，一种特定类型的p53突变可能与雌鼠能否怀孕有关。对此新加坡医学生物学研究所的发育生物学家Colin?Stewart不无戏谑的评论道
9、：该研究结果味着，以p53为靶点的抗癌药物可能会有“额- 4 - 外”的效果“一些药物可能会通过提升p53在子宫中的作用成为有效的助孕剂，而另一些则可能通过阻碍p53发挥功能而成为避孕药。”另外据自然医学杂志的报道，有研究者还发现p53在胰岛素抵抗（insulin?resistance）的生理调控过程中发挥了重要作用第四个10年 我们正处于p53第四个10年的发展阶段，我们现在的主要目标是基于p53蛋白开发抗癌药物。2.2 p53基因及其表达产物2.2.1 p53基因人类 P53基因定位于17P13.1,约20Kb长，都由11个 外显子和10个内含子组成，第1个外显子不编码，外显子2、4、5、
10、7、8、分别编码5 个进化上高度保守的结构域，P53基因5个高度保守区即第1319、117142、17119 2、236258、270286编码区。P53基因的转录由P1、P2二个启动子控制.P1启动子位于第一外显子上游100250bp， P2位于第一内含子内在启动子中包含1个NF1蛋白结合位点和一个转录因子AP1相关 蛋白的结合位点，对正常P53基因的转录，不仅需要二个启动子的平衡作用，而且P53 基因内含子也起.作用。P53 基因位于人类17号染色体含11 个外显子，其转录翻译编码的野生型P53 蛋白由393个氨基酸残基组成，包含多个功能域。 图1 p53蛋白空间结构 P53 基因还有：序
11、列特异的DNA结合结构域，位于氨基酸100-300位间；核定位信号NLS位于氨基酸残基316-325；四聚体寡聚化结构域，定位于氨基酸残基334-356；C-末端非专一DNA调节结构域，同时在碰到DNA损伤时，P53 可能补充其它蛋白质到损伤部位，提供DNA损伤信号。2.2.1 p53基因的失活图1：P53蛋白结构 引起肿瘤形成的p53蛋白是基因突变后产生的，影响了正常p53基因的抑癌作用，p53蛋白构像发生改变主要是由于p53基因的突变。 野生型P53以四聚体形式与特异位点结合，反式激活下游生长抑制基因的表达，是否具有这种直接与DNA结合并激活临近基因转录的特点是野生型p53蛋白和其它具有“
12、致癌”作用的突变型蛋白之间的差别。一系列的方式能使P53失活，在一些肿瘤中，单一或两个P53位点的丧失降低四聚体浓度，无义突变造成P53翻译中断，C端酸性结构域的丢失 影响四聚体形成;最常见的是错义突变，野生型与突变体形成更稳定的四聚体，丧失正常功能。2.2.2 P53蛋白的作用机制 P53蛋白N一端为酸性区180位氨基酸残基，C-端为碱性区319393位氨基酸残 基，正常的P53蛋白在细胞中易水解，半衰期为20分钟，突变性P53蛋白半衰期为1.4 7小时不等，P53蛋白N端有一个与转录因子相似的酸性结构域，与GAL4的DNA结合区重 组时，融合蛋白能激活GAL4操纵子转录，激活功能定位在P5
13、3第2040位密码子，P53 细胞定位及反式激活功能提示，P53蛋白可能直接或通过与其他蛋白作用参与转录控制.图2：p53蛋白的抑癌机制P53基因是一种转录因子，他会根据细胞的状态，从而做出不同的反应，如图2所示：当细胞受到轻度生理应激反应刺激时，会通过p53蛋白下游靶基因发挥调控作用如：维持代谢稳定状态，抗氧化作用，DNA修复，细胞代谢生长抑制等方式来修复细胞，当受到重度应激反应如原癌基因被激活，p53蛋白则会启动细胞凋亡程序，使得细胞程序性死亡。 要研究某个蛋白的生化活性有一种最为常用的方法，那就是寻找能够与该蛋白发生相互作用的其它蛋白。这个方法在p53蛋白的研究当中被应用得最为广泛，也找
14、到了非常多的能够与p53蛋白发生相互作用的其它蛋白。迄今为止，在众多p53蛋白的“伴侣”蛋白中最为著名，也最为重要的蛋白就是在1992年发现的MDM2蛋白。研究发现，MDM2蛋白能够与p53蛋白紧密结合，并抑制其生物学活性。从那以后，MDM2蛋白（人体的MDM2蛋白也被称为HDM2蛋白）就被认为可能是最重要的p53蛋白调控因子，并且是最有效的p53蛋白的“把关人”。MDM2蛋白可以通过多种方式抑制p53蛋白的作用。比如，它可以与p53蛋白的反式激活结构域相结合并抑制其活性。另外，MDM2蛋白还能起到E3泛素连接酶的作用，特异性地催化p53蛋白经泛素化途径降解。 图3：p53-MDM2环路后来的
15、研究又发现MDM2基因居然是受p53蛋白调控的靶基因。p53蛋白和MDM2蛋白之间形成了一个负反馈环路。p53蛋白诱导MDM2蛋白表达，然后MDM2蛋白促进p53蛋白降解，从而限制胞内p53蛋白活性。经过多年的深入研究，我们了解到在非应激细胞中，p53蛋白的活性一直维持在一个较低的基础水平。这主要得益于p53MDM2负反馈环路的作用。不过，在细胞受到各种应激信号的刺激时，p53蛋白就会迅速被激活。最早发现p53蛋白的这种可诱导特性的是Warren Maltzman，他发现细胞经紫外线照射后，胞内p53蛋白的含量会升高。随后，Michael Kastan得到的实验结果也进一步证实了Warren的
16、结论。在这些实验数据的支持下，p53蛋白当之无愧地被誉为“细胞基因组的卫兵”。后来的研究也进一步证实了这个观点。p53蛋白具有的这种能够被应激信号所激活的开关是p53蛋白发挥各种抑癌作用的关键（图3）。MDM2蛋白就是控制这个开关的主要调控因子，MDM2蛋白能够保证p53蛋白不会被错误激活。当细胞面临各种致瘤刺激信号时，MDM2蛋白的含量就会减少，抑制作用就会被取消，p53蛋白就会被活化（图3）。Chuck Sherr等人的研究结果就支持了上述观点。他们发现ARF这种抑癌因子主要就是通过与MDM2蛋白相结合，从而“解放”p53蛋白，使p53蛋白发挥抑癌作用。3 重组p533.1主要药物及类似药
17、物（上市药物和在研药物）重组人p53腺病毒(rAd-p53)是一种广谱抗癌制品。自1995年在美国批准进入临床试验，目前已有51项各种临床试验方案在世界各国实施，涉及到多种类型的肿瘤治疗。所有临床试验用rAd-p53制品均来源于美国和中国的三家公司即Introgen、Schering-Plough（先灵葆雅 ）和深圳市赛百诺基因技术有限公司（SiBiono），这也是目前世界上具有重组腺病毒制品规模化生产能力的三大产业化基地。针对P53的基因治疗，已有了数种上市药物及多种处于临床研究的药物，这里着重介绍两种上市的药物: 今又生和Advexin。3.1.1 今又生重组人 p53 腺病毒注射液（今又
18、生），由深圳赛百诺公司研发，是一种广谱的抗肿瘤药物。是世界上第一个获准上市的肿瘤基因治疗药， 由正常人 p53 肿瘤抑制基因和改构的5 型腺病毒基因重组而成。前者是 “今又生” 发挥肿瘤治疗作用的主体结构， 后者主要起载体作用， 携带治疗基因 p53进入肿瘤细胞内发挥作用。今又生在头颈部癌，肺癌，肝癌等恶性肿瘤中均有较好的疗效，目前已有多篇今又生治疗全身性实体瘤的研究论文在国内外发表，其临床研究效果分析如下：戚晓东等应用静脉滴注、 肿瘤局部注射等方法治疗42 例晚期肿瘤患者， 其中 15 例用“今又生” 进行基因治疗，27 例接受 “今又生” 治疗并联合化疗。结果显示 : “今又生”单用组15
19、 例患者， 无 CR， PR 4例( 267%)，SD 6例( 40 0%) ，PD 5 例( 33 3%) ， 临床获益率为66 7%。“今又生” 联合化疗组27 例患者， 无 CR， PR 9例( 33 3%)， SD 10 例( 37 0%) ，PD 8 例( 29 6%) ， 临床获益率为 70 3%。总的临床获益率为69 4%( 29 /42 ) 。“今又生” 对头颈部癌、 肺癌、 胰腺癌及胃癌均显示出良好疗效。未观察到“今又生” 相关的严重副反应。结论: 单用 “今又生” 能让多数的晚期肿瘤病人获益;联合化疗同样安全有效。同样的，张雷等采用静脉滴注， 肿瘤局部注射， 胸、 腹腔内注
20、射等方法联合综合免疫疗法在临床上也取得了不错的疗效，基因治疗作为一种新的治疗手段， 初步研究结果证实对恶性肿瘤已取得较理想的疗效， 联合综合免疫疗法可增强恶性肿瘤的整体疗效。3.1.2 Advexin：INTROGEN公司研发主治头颈部癌Advexin是利用非复制和非整合腺病毒载体表达肿瘤抑制基因p53，适应症是头颈部肿瘤。普遍认为，p53基因产物是最重要的癌症抑制蛋白，其表达缺陷或功能缺陷在肿瘤中最为常见。Advexin正是利用这一发现，在患者体内或肿瘤局部表达正常的p53蛋白。Advexin的III期临床研究以氨甲蝶龄为对照组，适应症是难治性头颈部肿瘤，以临床表现（肿瘤反应和总体生存率）和
21、p53蛋白水平为评判标准，采取随机可控的研究模式。最后三期临床成功，获FDA批准上市。3.1.3临床阶段的药物 表1 部分处于临床阶段的药物：药物类型临床试验阶段公司名称、国家疾病类型治疗方式P53 -SLP疫苗临床 期格罗宁根大学医学中心卵巢癌注射抗- P53淋巴细胞药临床 期美国国家癌症研究所转移性癌症注射RAD- p53基因治疗单药临床或期深圳市赛百诺GENETECH有限公司晚期期口腔颌面部恶性肿瘤注射+手术重组人p53腺病毒基因药临床 期深圳市赛百诺GENETECH有限公司晚期期非小细胞肺癌手术+基因治疗Ad5CMV-p53 gene临床 期美国国家癌症研究所口腔或咽癌癌前基因治疗重组
22、人p53腺病毒基因药临床期深圳市赛百诺GENETECH有限公司头颈恶性肿瘤化疗+基因治疗p53的瘤内基因治疗与化疗临床期美国国家癌症研究所乳腺癌化疗+基因治疗腺病毒介导的野生型P53基因治疗临床 期北美脑肿瘤协会大脑和中枢神经系统肿瘤重组人p53腺病毒基因药临床期美国国家癌症研究所顺铂和紫杉醇耐药的卵巢癌腹腔镜手术Ad5CMV-p53 gene临床 期Introgen 公司乳腺癌手术+肿瘤辅助疗法Ad5CMV-p53 gene临床 期东部肿瘤协作组非小细胞肺癌基因治疗3.2 以重组人P53腺病毒注射液（今又生）来具体介绍重组p533.2.1 重组人P53腺病毒的实验方法 用粘性末端连接法构建了
23、重组野生型P53- PXT1 真核表达载体, 并成功地转化Cacl2 处理的RR-1细胞,经多种方法测定其连接率和转化率。实验大致流程如下：3.2.1.1 PXT1的酶切及去磷酸化处理在纯化的PXT1中加BamHI以切开LTRS间的单一BamHI酶切部位。使PXTI线性化，并具有与P53互补的粘性末端加牛小肠碱性磷酸酶进行去磷酸化处理。并纯化。3.2.1.2 连接PXT1和P53 CDNA： 取连接混合物与处理后感受态细胞混合孵育 3.2.1.3 转化RR-1受体菌： 取4Ll 连接混合物和4Ll纯化的PXT1 分别加入100Ll 刚复苏的, 用Cacl2 处理并冻存于零下70度的RR-1感受
24、态细胞, 轻轻旋转混匀,置冰上孵育40分钟(其间轻轻混匀3次) 后置42度水浴孵育2分钟,再置37度 孵育5分钟, 加LB培养基1ml, 于37e 水浴摇床振荡培养( 120转/分)1小时, 然后分别涂布含Amp、Tet 抗生素和不含抗生素的LB平板,于37摄氏度 培养箱中孵育过夜, 次日观察细菌生长情况3.2.1.4 含重组PXT1-P53转化子的筛选与鉴定 a用插入失活试验筛选阳性转化子 b用快速细胞破碎法鉴定转化子质粒大小，筛选阳性转化子 c纯化质粒的酶切及电泳分析 3.2.2 重组人p53腺病毒注射液的质量控制重组人p53腺病毒注射液的质量控制主要包括产品鉴别、纯度含量测定、生物活性效
25、价、安全性及其他常规理化质控项目。表1列举了其中一些质量标准。表2：重组人p53腺病毒注射液质量标准 检测项目 检测方法 规定标准 基因组酶切图谱 mluI酶切法 与对照品一致 P53基因检定 PCR扩增 与对照品一致 活性单位 TCID50 =3.3*10 HPLC纯度 阴离子交换HPLC 95.0% 表达蛋白质定性（定量）检测 Western Blot /Elisa 阳性/待定 生物活性检测 SAOS2细胞杀伤法 100500 腺相关病毒（AVV）检测 PCR扩增法 阴性 3.2.3 今又生的抗癌特点广谱p53基因的广谱性：p53基因是人体最重要的肿瘤抑制基因，是基因组保护神。人类60以上
26、肿瘤的发生与p53基因突变有关，而无论肿瘤细胞是否发生p53基因突变，p53基因治疗均有效。腺病毒载体的广谱性：病毒对人体细胞具有天然的感染能力，腺病毒可感染几乎所有类型的细胞；临床试验证实广谱抗肿瘤；国内外临床试验证实：重组人p53腺病毒注射液对40余种主要实体瘤均有明确疗效。特异特异杀伤肿瘤细胞，对正常细胞没有影响：a.进入少 正常细胞表面CAR（柯萨奇腺病毒受体）少，今又生难以进入；b.表达少 正常细胞多为静息状态，缺乏p53基因启动的激活因素；c.活性低 正常细胞中缺乏P53蛋白活化的应激条件；d.清除快 正常细胞中有完善的P53蛋白泛素化降解途径。安全p53基因的安全性：国内外对该基
27、因长达26年的研究中，未观察到它对人体细胞有不良作用。腺病毒载体的安全性载体源于第一代人5型腺病毒，为腺病毒中致病力最弱的病毒株，野生型该病毒株也仅会偶致普通感冒；载体基因不整合到宿主细胞基因组中，无遗传毒性；载体经基因工程改构，只对细胞实施一次感染，不能复制，无环境污染。3.2.4 目前存在的问题及正在进行的优化改进、提出可能的解决方案 重组人p53腺病毒注射剂安全性良好。大剂量静脉注射时，除肝脏功能轻微受损外，未见有其他脏器明显受损。主要存在不良反应有注射部位疼痛，自限性发热，偶有流感症状和过敏反应。所以一般先给予肾上腺皮质激素预防，采用不同给药途径和剂量。对多种肿瘤的临床研究结果以及采用
28、不同给药途径、不同剂量和疗程、联合手术和放/化疗治疗多种肿瘤的研究显示，患者耐受性良好，没有出现严重毒副作用及引起免疫缺陷。 重组人p53腺病毒的治疗在动物模型中取得重大的成功，但由于人类于动物本身的区别，在由于肿瘤的发生时受到多种因素作用的结果，因此rAd-p53单一治疗模式的疗效有限，而且缺少靶向性。另外wt-p53在肿瘤细胞对药物和涉嫌耐受中所起的作用机制还不甚清楚。Wt-p53基因治疗能否启动肿瘤细胞凋亡这一问题目前还不清楚。尽管大多数肿瘤存在p53基因失活突变等，仍有近40%肿瘤保持着wt-p53.这部分肿瘤存在p53凋亡通路商其他一些关键词调控蛋白的基因突变，因此也致使凋亡通路失活
29、。且p53突变细胞中可能还存在该凋亡通路商其他组分的基因突变。这些可能是在许多肿瘤中重建wt-p53功能的方案疗效有限的原因。 解决该问题的一个可能有效的方法是靶向转染wt-p53调控的下游基因。对这些基因的研究多处于动物实验阶段，仅少数期临床实验在验证转染p16或Rb基因的疗效。 另外, 高效率基因载体的优化, 病毒载体的安全性, 载体的组织特异靶向性、导入基因的调控, 如何将p53与其他治疗手段更加有效地结合, 以及如何进行准确的疗效评价等, 都是p53基因治疗中需要进一步解决的问题。4 P53基因的研究展望 再过10年，p53蛋白能给我们带来些什么呢？当然我们肯定需要弄清楚各种p53蛋白
30、亚型在器官和个体发育中的作用。我们现在已经有了一点头绪，那就是p53蛋白、p63蛋白和p73蛋白（详见背景知识2）之间的比例关系，它们之间的作用是彼此拮抗的，有的是转录促进因子，有的又是转录抑制因子，但是它们对于细胞功能来说都是必不可少的。当然还有一些其它的线索帮助我们深入研究，比如p53蛋白单体或者二聚体能够和p63蛋白或p73蛋白一起形成异源四聚体（heterotetramers）。这三种转录因子结合在一起或许能够产生一种新的作用，使得p53蛋白的功能更加复杂多样。 更为复杂的是，p53蛋白（包括各种亚型蛋白）还能发生多种翻译后修饰，比如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、苏素化、类泛素化以及
31、N乙醯葡萄糖胺（N-acetyl glucosamine）等。在细胞面临各种应激刺激信号或者发生某些生理改变时，p53蛋白会发生各种相应的翻译后修饰，因此我们认为这些翻译后的修饰机制对于p53蛋白的功能也具有非常重要的作用，但是目前还缺乏实验依据。比如，WIP1磷酸酶（又名PPM1D）是一种癌蛋白，它在多种肿瘤细胞中都会大量表达，它在p53蛋白上游发挥作用，能够使共济失调性毛细血管扩张症突变激酶（ATM）失活，阻止MEK对p53蛋白的磷酸化修饰作用，这样就能使胞内野生型p53蛋白失活，因此也说明了这些翻译后修饰机制的重要意义。也许在这个10年里我们有望看到WIP1蛋白抑制剂的临床实验结果。 虽然体外培养细胞的实验结果表明这些翻译后修饰机制具有非常重要的作用，但是对Trp53突变基因敲入小鼠进行研究的结果似乎又不能支持上述观点。究竟这些翻译后修饰机制起何种作用，这将是我们在这10年里研究的一大重点。 对于果蝇、线形动物、斑马鱼、小鼠乃至人体发育的研究将有望解决上述翻译后修饰的问题，也有可能阐明p53蛋白各个亚型的功能。已经有研究表明p53蛋白、p63蛋白和p73蛋白在女性生育系统发育、女性生殖细胞基因组稳定性维持方面具有重要作用。因此我们有信心，在下一个
