1、正常血细胞形态观察血液病检验技术实验指导实验一、活化凝血时间测定 【实验原理】 同试管法CT测定。试验中加入白陶土-脑磷脂的悬液以充分激活因子和，并为凝血反应提供丰富的催化表面，故称为活化凝血时间（ACT）；还可以避免因接触激活阶段的不同结果带来的影响，从而提高了本试验的敏感性和重复性。【试剂】 1脑磷脂的制备 脑磷脂是将兔脑粉中的组织凝血活酶除去参与外源凝血途径的蛋白部分后所得的磷脂，故又称部分凝血活酶。取干燥兔脑粉1.2g加25ml丙酮，放置2h后过滤，将此兔脑粉加氯仿25ml，连续震荡2h，以滤纸过滤，滤液蒸发后为淡黄色蜡状物，刮入玻璃研钵中，加12ml生理盐水研磨成均匀乳剂，以每安瓶0
2、.25ml分装。 24%白掏土悬液 白陶土2g加入50ml生理盐水中，室温保存，用前摇动。 34%白陶土-脑磷脂悬液 将脑磷脂用巴比妥缓冲液作1：50稀释后，再加等量4%白陶土悬液混合而成。4C可保存3天，用时充分混合。 4巴比妥缓冲液 巴比妥钠11.75g、NaCl14.67g、0.1mol/L的HCl430ml，加蒸馏水至2000ml。此缓冲液pH应为7.3，否则影响试验稳定性。【操作方法】1在含4%白陶土-脑磷脂悬液0.2ml的试管中注入受检全血0.5，轻轻混匀。2其余操作同试管法CT测定。【参考值】 1.700.76 (1.142.05)min。【临床意义】 1同试管法CT测定，但较其
3、敏感，重复性也较好，可检出因子：C小于45%的亚临床型血友病。2是监测体外循环肝素用量的良好指标之一。实验二、血浆游离血红蛋白测定（邻一甲联苯胺法）【实验原理】 邻一甲联苯胺在酸性溶液中和过氧化氢与血红蛋白共同作用生成氧化型联苯胺，产生绿色蓝色紫色，其颜色的深浅与血浆游离血红蛋白的含量呈正相关。【试剂】 12g/L邻一甲联苯胺溶液 称取邻一甲联苯胺0.2g，溶于冰醋酸60ml，加蒸馏水至100ml,置于棕色瓶内于冰箱保存，色变暗应重配。21%过氧化氢溶液 用30%过氧化氢原液新鲜配制。310%冰醋酸溶液。取10ml冰醋酸，加蒸馏水至100ml。4血红蛋白应用标准液 将血红蛋白贮存液用生理盐水稀
4、释成10mg/100ml 备用。5抗凝试管 取0.2ml 100U/ml肝素于试管内，在80以下烘干，每管可抗凝2ml全血。【操作方法】 1将抗凝全血分离血浆。2取试管3支，分别标明测定、标准和空白，分别加入血浆、应用标准液，再向各管中分别加入邻一甲联苯胺溶液及1%过氧化氢溶液各1.0ml，充分混匀，放置10min。 3于上述3支试管内分别加入10%冰醋酸溶液10ml混匀，用435nm波长比色，以空白调“0”，读各管吸光度。 4计算： 测定管吸光度游离Hb( mg/L) = _ 100 标准管吸光度 【质量控制】 1. 一切容器均应避免血红蛋白污染，标本勿溶血，否则可引起假阳性。 2. 过氧化
5、氢溶液浓度要准，新鲜配制。 3. 联苯胺醋酸的含水量不能低于15%和超过30%，否则均可引起吸光度降低。 4. 标准液的加入量一定要准。【参考区间】 1m时才能从镜下见到。急性血管内溶血时，虽可有血红蛋白血症和血红蛋白尿，但还不能形成足够大的含铁血黄素颗粒，需在数日后才阳性，并可持续数周。实验五、红细胞渗透脆性试验【实验原理】 红细胞在低渗盐水中，水分透过细胞膜内渗，使之膨胀破坏而溶血。本试验是测定红细胞对不同浓度低渗盐水的抵抗力，以鉴别某些与红细胞形态有关的溶血性贫血。红细胞对低渗盐水的抵抗力与其表面积和体积的比值有关，厚度越大，该比值越小，即渗透脆性越大；反之，脆性越小。以浓度为横坐标，溶
6、血度为纵坐标绘制曲线，找出50%溶血对应的盐浓度，即红细胞中间脆性（MCF），后者较敏感。【试剂】 171mmol/L NaCl(10g/L)溶液：将100烘干的分析纯氯化钠1.0g置于100ml容量瓶中加少量蒸馏水溶解后，再加蒸馏水至刻度处。【操作方法】 取12支试管，按5-1分别加入10g/L NaCl和蒸馏水。表5-1红细胞渗透脆性试验操作表（国际单位制） 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1210g/L NaCl(ml) 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6蒸馏水（ml） 0.8 0.9 1.0 1.1 1
7、.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9NaCl SI g/L 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 制 mmol/L 116.3 109.4 102.6 95.8 88.9 82.1 75.2 68.4 61.6 54.7 47.9 41.0浓度 旧制（%） 0.68 0.64 0.60 0.56 0.52 0.48 0.44 0.40 0.36 0.32 0.28 0.24 然后各管立即加入新鲜静脉血各1滴，并从低浓度到高浓度逐管颠倒混匀，室温静置。【结果判断】 静置室温2h，观察结果，从高浓度开始，上清液呈透明
8、红色而管底有红细胞者为开始溶血管；溶液透明红色，管底完全无红细胞者为完全溶血管。【质量控制】 1NaCl溶液浓度要准确，故应干燥精称。2注射器和试管必须清洁干燥。3应用新鲜静脉血，忌用抗凝血，必要时可用去纤维蛋白血或肝素抗凝血。4结果不易判断时可离心后观察。5. 黄疸病人开始溶血不易观察，严重贫血红细胞太少时均可用等渗盐水将红细胞洗涤后再配成50%红细胞悬液进行试验。6每次试验均应做正常对照，与被检血相差0.4g/L，即有临床意义。【参考区间】 开始溶血：71.878.6mmol/L（4.24.6g/L）完全溶血：47.854.7mmol/L（2.83.2g/L）中间脆性：68.576.2mm
9、ol/L【临床意义】 患者比正常对照高6.8mmol/L或中间脆性76.2mmol/L有诊断价值。脆性增加：见于遗传性球形红细胞增多症，也见于自身免疫性溶血性贫血伴球形红细胞增多者。脆性降低：见于缺铁性贫血，各型地中海贫血，HbC、D、E病，脾切除术后及阻塞性黄疸等。实验六、酸溶血试验（Hams test）【实验原理】 正常人红细胞在酸化（pH6.66.8）的自身新鲜血清中（内含补体和备解素），经37孵育1h不溶血。而阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）患者，因红细胞膜缺陷，对补体溶血效应敏感性增强，则发生溶血。【试剂】 10.2mol/L HCl。28.5g/L NaCl溶液。【操作方法】1配制
10、50%红细胞悬液 取10ml离心管2支，标明患者、对照，均加入8.5g/L NaCl溶液56ml，分别加入患者和对照者未梢血十几滴，混匀，离心后弃去上清，如此重复洗涤红细胞2次，最后配成50%红细胞悬液备用。2分离正常对照血清 取与患者同型或AB型血35ml，待自然凝固后分离血清。3按表6-1操作。表6-1 酸溶血试验操作表正常对 50%红细胞 0.2mol/L管 别 孵育 照血清 悬液（ml） HCl(ml) 患 者 对 照 试验管 0.5 0.025 0.05 37对照管 0.5 0.025 0.05 水溶Ih 【结果判断】 试验管溶血，对照管不溶血为阳性；试验管和对照管均不溶血为阴性。【
11、质量控制】 1血清酸化后试管必须塞紧，否则CO2逸出使血清酸度降低。2抗凝剂中的Na、K可影响pH，故不宜用抗凝血，但可用脱纤维血。3为保证补体充足，最好用混合血清，但正常对照红细胞必须用“O”型血。4多次输血者，可因血中异常红细胞相对减少，本试验可呈弱阳性或阴性。【临床意义】正常人为阴性。阳性见于PNH。遗传性球形红细胞增多症及自身免疫性溶血性贫血也可呈阳性。主要与红细胞球形化有关。血清加热破坏补体，若本试验转为阴性则更支持PNH。实验七、蔗糖溶血试验 【实验原理】低离子强度的等渗蔗糖溶液，在温育条件下可促进补体与红细胞膜的结合，使红细胞对补体损伤的敏感性增强而导致溶血。 【试剂】92.4g
12、/L蔗糖溶液。 【操作方法】取新鲜抗凝血（枸橼酸盐或草酸盐抗凝）0.5ml加入4.5ml蔗糖溶液中，混匀，置37孵育箱内30min后离心，上清液呈红色为阳性，无色为阴性。 【质量控制】注射器、试管应清洁干燥，避免溶血。无蔗糖可用10%葡萄糖代替。 【临床意义】正常人为阴性。阳性见于PNH。本试验较Ham试验敏感，是PNH诊断的筛选试验，但特异性较差。再障-PNH综合征、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血也可呈阳性。本试验最好与Ham试验同时操作，用正常血清代替患者血清做试验，可除外患者补体异常所致的假阴性。实验八、热溶血试验 【实验原理】利用患者的红细胞和自身新鲜血清（含补体），经37孵育
13、后，由于葡萄糖分解产酸，使有内在缺陷的红细胞溶解而溶血。 【操作方法】抽取静脉血1-2ml，取下针头，沿管壁缓缓注入小试管内，避免产生气泡，置37孵育箱保温24h，取出后离心。上清呈红色（溶血）为阳性。 【质量控制】注射器要干燥，小试管要清洁，操作过程中避免溶血，防止出现假阳性。孵育24h血块未回缩者，可用小玻棒沿管壁轻轻分离，然后离心，观察结果。 【临床意义】正常人为阴性。阳性见于PNH，其他溶血性贫血亦呈阳性，但阳性率比PNH为低。本试验用于PNH的筛选。实验九、高铁血红蛋白还原试验一、比色定量法【实验原理】 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）在戊糖旁路中使6-磷酸葡萄糖转变为6-磷酸葡萄糖
14、酸，同时催化氧化型辅酶II（NADP）形成还原型辅酶II（NADPH），再使氧化型谷胱甘肽（GSSG）形成还原型谷胱甘肽（GSH）。NADPH是高铁血红蛋白还原酶的辅酶，在递氢体美兰和高铁血红蛋白还原酶的作用下，使暗褐色的高铁血红蛋白还原为红色的血红蛋白。当红细胞内G6PD含量不足或缺乏时，高铁血红蛋白还原速度减慢，甚至不能还原。【试剂】 112.5g/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液 亚硝酸钠1.25g，葡萄糖5g，加蒸馏水至100ml。置棕色瓶内4C下可保存1个月。20.0004mol/L美蓝溶液 美蓝15mg放乳钵中，加少量蒸馏水研磨后过滤，再加蒸馏水至100ml。室温可保存12个月。30.02m
15、ol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4） 取Na2HPO4 229.5mg，KH2PO452.2mg，加蒸馏水至100ml。【操作方法】1静脉采血1.5-2.0ml，加入含有38g/L枸橼酸钠抗凝剂的小瓶内（血：抗凝剂=9:1），再加葡萄糖20mg摇匀。2取血液1.0ml，加亚硝酸钠-葡萄糖溶液和美蓝溶液各0.05ml，颠倒混合12次，使与空气中的氧充分接触。加塞，370.5C水浴（或孵箱）保温3h。3取出后摇匀，取0.1ml加于10ml磷酸盐缓冲液中溶解，2min后于波长635nm处（或红色滤光板）比色，用蒸馏水作空白，测其吸光度（A）。4另取原血液0.1ml，按上法加缓冲液溶解后比色，测其吸光度
16、（B）。再于此液中加亚硝酸钠-葡萄糖液1滴，摇匀，5min后比色，测其吸光度（S）。【计算】 A-B高铁血红蛋白还原率%=（1- ）100 S-B【参考区间】 高铁血红蛋白还原率75%（比色法）【质量控制】 1红细胞比积低于30%时，高铁血红蛋白还原率显著降低，必须调整红细胞与血浆的比例。2本试验抗凝剂若用ACD保养液时，该保养液与血液之比为0.15:1。该抗凝血可保存1周。因草酸盐具有还原性，不宜使用。3标本不应有凝块或溶血，以免影响测定结果。4测定吸光度时，分光光度计的波长应准确。一般要求S比B大8倍以上。【临床意义】本试验用于G6PD缺乏症的过筛检查，蚕豆病和伯氨喹啉型药物溶血性贫血患者
17、，由于G6PD缺陷（隐性遗传），高铁血红蛋白还原率明显下降。杂合子型多在74%31%之间，纯合子型常在30%以下。二、细胞化学法【实验原理】 红细胞内血红蛋白可被亚硝酸钠氧化为高铁血红蛋白，后者可经美兰还原为血红蛋白；G6PD缺乏时则高铁血红蛋白不被还原。加入氰化物后形成氰化高铁血红蛋白，易被过氧化氢洗脱，染色后形成空影红细胞。正常的红细胞，氧合血红蛋白的过氧化酶活性，不被氰化物抑制，阻止了枸椽酸盐的洗脱作用，保证红细胞的正常形态。【试剂】 1反应试剂 取0.0004mol/L美蓝溶液1ml，12.5g/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液0.5ml，生理盐水8.5ml，混匀。此液于冰箱中可放置1周。20.
18、4mol/L氰化钠（或氰化钾）。3洗脱液 95%酒精40.0ml，0.2mol/L枸椽酸8.0ml，30% H2O22.5ml，混匀。4固定液 甲醇5染液 5g/L苏木素液，4g/L伊红液。【操作方法】1取ACD抗凝血0.05ml，置于预先盛有0.05ml反应试剂之小试管中，摇匀，放37C水浴（或孵箱）中保存4h。2取出后用滴管轻轻吸去上清液，于剩下的红细胞中加入0.4mol/L氰化钠0.005ml（细玻棒蘸起一小滴），摇匀。35min后加入1滴患者血浆（或AB型血浆），用滴管混匀，取出1滴作薄涂片，待干。4将玻片放入盛有洗脱液的染色缸内，上下移动1min，再静置于液中24min，取出后甲醇固
19、定半分钟，水冲洗，待干。5用苏木素染23min，水冲洗，再以伊红染14min水冲洗，待干。6在高倍镜下观察，计数1000个红细胞（涂片四角及中央各数200个），算出G6PD缺乏红细胞（空影红细胞）的百分率。【质量控制】 本法受洗脱液H2O2浓度的影响，因H2O2易分解，不易保存所需浓度，因此使用过程中宜随时补充少量H2O2。补充的量依使用次数的多少、放置时间和室温高低而定，需凭经验掌握，最好用阴性、阳性样本对比试验来确定。【临床意义】 正常人空影红细胞88.0%，杂合子0.4%88%。此法对于杂合子的检出敏感性较高，但作为筛选法则过于繁琐。实验十、变性球蛋白小体检查【实验原理】 氧化物质可使G
20、6PD缺乏患者的红细胞中积蓄多量的H2O2等氧化剂，使血红蛋白氧化变性。而与某些碱性染料（如煌焦油蓝）或结晶紫孵育后形成蓝黑色或紫黑色颗粒定位于红细胞内。【试剂】 用0.73%NaCl溶液配制成1%的结晶紫（龙胆紫）溶液。【操作方法】 滴1 滴试剂于载玻片上，用玻棒或竹签蘸一点患者血液于其上，混匀，加盖玻片，染510min后在高倍镜下观察。计算500个红细胞中含变性珠蛋白小体红细胞的百分率。含变性珠蛋白小体的红细胞是在红细胞中出现多个紫黑色、或细或粗、形状不规则的颗粒，位于细胞的边缘或中央，血红蛋白或仍均匀分布，或完全缺如。【参考区间】 正常人无变性珠蛋白小体，或偶见几个（0.01）细小者。【
21、临床意义】 阳性见于G6PD缺乏症患者（3%82%），随着溶血的恢复逐渐减少或消失。还见于不稳定血红蛋白病，呈单一的圆形或卵圆形粗大颗粒，附着于红细胞膜或突出于其外。另外，硝基苯、苯胺、苯肼等化学物质中毒者也可出现变性珠蛋白小体。实验十一、葡萄糖6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验【实验原理】 在葡萄糖-6-磷酸（G6P）和NADP存在下，G6PD能使NADP还原成NADPH，后者在紫外线照射下可发出荧光。【试剂】混合剂的成分与配方如下：0.1mol/L G6P1ml7.5mmol/L NADP1ml0.7mol/L Tris-HCl(pH7.8)3ml8mmol/L氧化型谷胱甘肽1ml10g/L皂素2
22、ml蒸馏水2ml此混合试剂分装，置-20C保存，可稳定数月。【操作方法】 1取末梢血或抗凝血510l，加入含100l反应试剂的小试管中。亦可取血滴于滤纸上,干后取直径约为1cm的血迹剪碎,置含反应试剂的小试管中洗脱。2放37C孵育10min。3取约10l溶血液滴于新华滤纸上，晾干后立即用冷风吹干，在长波紫外线下观察结果。【结果观察】 G6PD正常者可见明亮荧光，严重缺乏者无荧光，杂合子介于两者之间（弱荧光）。【质量控制】1本法是直接测定NADPH的量，特异性较好。2每次或每批要有（G6PD）正常和缺陷者的标本作对照。3取血量以510l为宜，正常者宜偏少，贫血者可偏多。4干血滤纸片存在其酶活性可
23、损失，宜同时作正常对照血样品。5加入GSSG是为了提高敏感性，因有残余G6PD活性的标本（如杂合子），可产生少量NADPH，若有足量的GSSG存在，则通过谷胱甘肽还原酶的作用，再将其氧化为NADP。这样患者和正常红细胞即可显示明显差别。不使用GSSG亦可，效果稍差，可将G6P-Na2和NADP浓度减半，血样本用生理盐水稀释至1/4，孵育时间缩至3min，可减弱残余酶活性的影响。【临床意义】 正常人有很强的荧光。G6PD缺乏者荧光很弱或无荧光；杂合子型或某些G6PD变异体者可有轻度或中度荧光，本试验适用于大批量筛选，但不利于杂合子型的检出。实验十二、硝基四氮唑蓝试验硝基四氮唑蓝试验（nitrob
24、lue-tetrazoliumtest）有定性试验和G6PD活性定量测定两种。一、定性纸片法【实验原理】 NADPH通过吩嗪二甲酯硫酸盐（M-PMS）的递氢作用，使淡黄色的硝基四氮唑蓝（NBT），还原成紫色的甲 。G6PD缺乏时由于NADPH生成不足，不显紫色。【试剂】10.25mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.4） 称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）7.6g，溶于蒸馏水约100ml中，先加入1mol/HCl 60ml，然后用pH计调整pH至7.4，再加蒸馏水200ml。在4C可保存数月。20.6g/L M-PMS M-PMS 6mg加蒸馏水10ml溶解，加入0.01mol/L HCl
25、1小滴调整pH至3.8左右。于棕色瓶内，暗处存放，可保存2周以上。如试剂由黄变绿，应重新配制。33g/L NBT NBT 15mg加蒸馏水5ml，在水浴中加热至80C左右溶解,过滤。用棕色瓶盛装，可保存2周以上。46.25mmol/L G6P-Na2 称取G6P-Na210mg，用Tris-HCl缓冲液4ml溶解。放0C可保存1个月以上。56.25mmol/L NADP 称取NADP 10mg(如用含70%的制品则称14mg)，加Tris-HCl缓冲液2ml溶解。放0C可保存数月。60.12mol/L MgCl2 称取分析纯MgCl26H2O 2.10g溶于蒸馏水至100ml。Mg2+为G6PD的激活剂。7反应试剂 M-PMS 0.1ml，NBT 0.5ml，G6P-Na2 0.4ml，NADP 0.1ml，MgCl2 0.1ml，混合，当天配制。8对照试剂 用等量Tris-HCl代替G6P-Na2和NADP，余同反应试剂。【操作方法】1取末梢血1滴，滴于干净滤纸上，血迹直径1.0cm左右，自然晾干（密封后4C保存，酶活性可维持57天）2用打孔机打出一小圆血迹红片（直径约5mm），置于反应板的小
