1、键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的地位，是应用最广的色谱法。 按照固定相和流动相极性的不同，分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类。 1.正相色谱法（normal phase chromatography） 固定相极性大于流动相极性的分配色谱法称为正相分配色谱法，简称为正相色谱法。氰基键合硅胶、氨基键合硅胶等极性的化学键合固定相是正相色谱常用的固定相，正相色谱的流动相一般为极性较小的有机溶剂。在正相色谱中，极性小的组分由于K值较小先流出，极性较大的组分后流出。正相色谱法用于溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质的分离。 2.反相色谱法（reversed phase chromato
2、graphy） 流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法，简称为反相色谱法。反相色谱法使用非极性固定相，最常用的非极性固定相是十八烷基硅烷键合硅胶，还有辛烷基硅烷键合硅胶等。流动相常用水与甲醇、乙腈或四氢呋喃的混合溶剂。在反相色谱中极大的组分因K值较小先流出色谱柱，极性较小的组分后流出。流动相中有机溶剂的比例增加，流动相极性减小，洗脱力增强。反相色谱法是目前应用最广的高效液相色谱法。 （三）离子交换色谱法（ion exchange chromatography） 离子对交换色谱法是以离子交换剂为固定相的色谱方法，组分因和离子交换剂亲和力的不同而被分离。柱填料含有极性可离子化的基团
3、，如羧酸、磺酸或季铵离子，在合适的PH值下，这些基团将解离，吸引相反电荷的物质。由于离子型物质能与柱填料反应，所以可被分离。 样品中不同的组分因离子交换平衡常数的不同而分离。离子交换色谱的流动相一般为一定PH值的缓冲溶液，有时也加入少量的有机溶剂，如乙醇、四氢呋喃、乙腈等，以增大组分在流动相中的溶解度。流动相的PH值影响离子交换剂的交换容量。对弱酸或弱碱性的被分离组分，流动相的PH值还会影响其电离状况，流动相的PH值必须使待分离组分处于离解状态，才能被分离。 离子交换色谱法用于分离在测定条件下呈离解状态的组分，如具有酸性或碱性的化合物，反相离子对色谱法在药物分析中的应用非常广泛，例如生物碱、磺
4、胺类药物、某些抗生素及维生素等的分析均可采用此方法。 （四）空间排斥色谱法（steric exclusion chromatography） 空间排斥色谱也称为凝胶色谱。其固定相是具有一定孔径范围的多孔性物质，即凝胶。被分离组分因分子空间尺寸大小的不同而被分离。当组分被流动相携带进入色谱柱时，体积大的分子不能进入固定相表面的孔穴中，而随流动相直接通过色谱柱，保留时间最短。体积较小的分子可以进入孔穴内，在色谱柱中所走的途径较长，保留时间也较长。分子的尺寸越小，可进入的孔穴越多，所走的路径越长，保留时间也越长。因此，凝胶色谱中，在一定范围内，体积不同的分子保留时间不同，从而达到分离的目的。凝胶色谱
5、法主要用来分离高分子化合物，如蛋白质、多糖等。由于分子量和分子体积有关，凝胶色谱还可以用来测定组分的分子量。 （五）亲和色谱法（ligh performance affinity chromatography） 亲和色谱法是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从生物样品中分离和分析一些特殊物质的色谱方法。生物分子之间的专一作用包括抗原与抗体，酶与抑制剂，激素和药物与细胞受体，维生素与结合蛋白，基因与核酸之间的特异亲和作用等。 亲和色谱的固定相是将配基连接于适宜的载体上而制成的，利用样品中各种物质与配基亲和力的不同而达到分离。当样品溶液通过色谱柱时，待分离物质X与配基L形成X-L复合物，而被结合
6、在固定相上，其他物质由于与配基无亲和力而直接流出色谱柱，用适宜的流动相将结合的待分离物质洗脱，如采用一定浓度的醋酸或氨溶液为流动相，减小待分离物质与配基的亲和力，使复合物离解，从而将被纯化的物质洗脱下来。 HPAC可用于生物活性物质的分离、纯化和测定，还可以用来研究生物体内分子间的相互作用及其机理等。 （六）手性色谱法（chiral chromatography） 不少有机药物的结构中有不对称碳原子，又称手性碳原子，有手性碳原子的药物具有旋 光性。立体构型不同的一对对映体，其药效、毒副作用往往不相同。例如抗高血压药物-甲基多巴是S-（-）体；又如氯霉素（含有二个手性碳原子），只有D-（-）异构
7、体有效而L-（+）异构体完全无效。沙利度胺（反应停）的两个对映体对小鼠镇静作用的效价相近，但只有左旋异构体才有胚胎毒及致畸作用。因此，对映体的分离，在药物的制备和质量控制方面，都具有重要的意义。对映体在普通条件下的理化性质是相同的，因此分离对映体需要在手性条件下进行。分离对映体的色谱方法称为手性色谱法。手性色谱法分为间接法和直接法两种。间接法是将对映体与一定的手性衍生化试剂反应，使其由对映体转变为非对映体，再利用他们理化性质的差异，用一般的色谱条件进行分离。直接法不需作衍生化反应，直接利用手性色谱柱或手性流动相进行分离，应用较多，以下主要介绍直接法。 1.手性固定相（chiral statio
8、nary Phase，CSP） 手性药物拆分前的对映体通常以镜象存在，即以外消旋体形式存在。用常规分析和制备方法不能将其拆分，需引入不对称（即手性）环境，使欲拆分的对映体（样品）、手性作用物（比如固定相）和手性源形成一个非对映异构分子的络合物。为了形成这样一种分子络合物，分子之间要有一种同时相互存在的作用力，以保持分子的空间定位。Dalgliesh认为至少要有三个作用力，其中一个要有立体选择性，可以是吸引的，也可以是排斥的。这就是“三点相互作用”理论。如果对映体中某一种对映体正好与此三个作用点配对，相互作用较强，保留时间就长。而另一种对映体因空间构型不同，不能完全配对，作用相对较弱，保留时间就
9、短，从而可以得到分离。固定相的作用可以是氢键、偶极一偶极作用、-作用、静电作用、疏水作用或空间作用等。 l 常用的手性固定相有以下几种。 （1） Pirkle型手性固定相 Pickle型手性固定相是由美国学者Pirkle主持研制的，主要有-碱性（斥电子基）手性固定相和-酸性（吸电子基）手性固定相。在分离的过程中，化合物与固定相之间发生-电荷转移相互作用，此类固定相为电荷转移型手性固定相。如DNBPG-CSP是把（R）-N-3，5-二硝基苯甲酰苯基甘氨酸（dinitrobenzyl phenylglycin）键合到氨丙基硅胶上 （2） 蛋白质类手性因定相 蛋白质是由手性亚基团氨基酸组成的大分子物
10、质，蛋白质类手性固定相是将蛋白质通过氨基酸键合到硅胶上而制成的。常用的蛋白质类手性固定相有牛血清蛋白（RSA）和人血a1-酸性糖蛋白（AGP）的手性固定相，商品有Chiral AGP，Resolvosil， Enantio Pac等。蛋白质类手性固定相应用范围较广，效果良好，但该类固定相的谱柱容量较小。常用洗脱系统是磷酸盐缓冲溶液（PH47），离子强度为0500mmol，有机改性剂不得超过5%。用蛋白质类手性固定相拆分酸性和碱性倾倒物对映体时，流动相内可分别加少量离子对试剂，如N，N-二甲基辛胺，叔丁胺氢溴酸盐和辛酸，以获得理想的分离结果。 （3） 多糖类手性固定相 多糖类手性固定相中应用最多
11、的是环糊精。环糊精（cyclodextrin, CD）是一类环形寡聚糖，为手性高分子物质，。根据分子中葡萄糖单元的个数不同，环糊精可分为、三类，他们分别由6、7、8个D-吡喃葡萄糖组成，将CD分别通过硅烷链连接在硅胶表面就构成环糊精手性固定相。环糊精分子成锥桶状，内腔的直径由组成环糊精的葡萄糖个数决定，如常用的-环糊精由7个葡萄糖分子组成，内腔直径为0.8nm。用环糊精手性固定相进行分离时，首先要求被拆分的组分进人洞穴，形成包合物，保留时间以组分能否进人洞穴及其紧密的程度而定，环糊精环上还有多个手性中心，能选择性地 与对映体作用，从而导致对映异构体的保留不同而被分离。如用-环糊精手性固定相已经
12、成功地分离了二茂铁等金属有机络合物、氨基酸以及生物碱等。除环糊精外，多糖类的手性固定相还可以用纤维素、直链淀粉作成，如纤维素三醋酸醋手性固定相、纤维素三苯甲酸醋手性固定相和纤维素氨基甲酸酯手性固定相等。 （4）冠醚（Grown ether）类手性固定相 冠醚与环糊精类似，是本身具有手性的低聚糖，是含醚键的环状化合物，呈王冠状结构，外层是亲脂性的乙撑基，环的内层是富电子的杂原子，如氧、氮、硫等。通常使用的是18-冠-6的衍生物，健合在聚苯乙炜骨架或硅胶上，形成冠醚手性固定相。用冠醚手性固定相分离对映体时，不同对映异构体因与冠醚环腔形成的主客体络合物的稳定性不同而被分离。在冠醚上引人双萘基，双萘基
13、可以形成“手性墙”，增加固定相的立体选择性。能质子化的氨基化合物，特别是氨基酸对映体在冠醚手性固定相上可以得到很好的分离。 2.手性流动相（chiral mobile phase ，CMP）拆分法 手性流动相拆分法是将手性试剂添加到流动相中，利用手性试剂与对映异构体结合的稳定常数不同或结合物在固定相上分配的差异进行分离。近年来，手性流动相拆分法已广泛应用于药物对映体的拆分。此法的最大优势在于：可采用普通的非手性固定相，不需对样品进行衍生化，手性添加物本身可流出，也可更换，同时添加物的可变范围较宽，稳定性好，且价格便宜。 （1） 配体交换型手性添加剂 配体交换型手性添加剂由手性配基和含二价金属离
14、子的盐组成。手性配基多为具有光学活性的氨基酸及其衍生物，他们和二价金属离子螯合，分布于流动相中，遇到待分离的对映异构体时，即形成配合物，再在流动相和固定相之间分配而实现分离。分离的机理一般认为是配基和金属离子形成的螯合物被吸附在固定相上，形成动态的手性固定相而发挥作用。也可以看成是手性配基、金属离子和对映异构体形成的配合物稳定常数不同而产生分离。采用5&m粒径的C18 固定相，阿司帕坦作为CMPA，与硫酸铜络合，测定高血溶素患者尿中D-和L-2-哌啶酸的浓度。 （2）环糊精添加剂 环糊精在水中有一定的溶解度，用环糊精作为手性添加剂，加入流动相中，其分离机理与环糊精手性固定相相同，但保留行为正好
15、相反。对映异构体与环糊精形成的包合物稳定性越强，随流动相出柱越快，保留时间越短。 （3） 手性离于对添加剂 解离的有机化合物能与含互补电荷的试剂相互作用，生成电中性离子对。分离带电荷的对映异构体时，可以在流动相中添加手性的离子对试剂，对映异构体和离子对试剂形成电中性的离子对，离子对在固定相和流动相间分配系数不同而得到分离。常用的手性离子对试剂有（）10-樟脑磺酸、奎宁等。 二、高效液相色谱仪 高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱系统、检测系统、数据记录处理系统等组成。仪器组成的方块图如图所示： （一）输液泵 高效液相色谱的流动相采用高压泵输送，有不同类型的输液泵，按输液性质可分为恒压
16、泵和恒流泵。目前使用较多的是柱塞式往复泵，柱塞式往复泵为恒流泵，可按设定的流速输送流动相，流量不受柱阻力的影响，可保持恒定，并容易清洗和更换。由于柱塞式往复泵是通过柱塞的往复运动来关液的，所以输液的脉动性较大。目前多采用双泵补偿的方法减小脉动性。双泵补偿是同时使用两个泵进行工作，两个泵可以按串联或并联方式连拉，交替送液，相互补偿，达到减小脉动的目的。 （二）进样器 进样器是将试样送入色谱柱的装置。一般要求进样装置的密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。有进样阀和自动进样装置两种。除使用自动进样装置外，用手工进样均使用六通进样阀。在工作状态下，仪器系统内
17、处于高压的状态，借助于六通进样阀，实现了常压下不停流进样。六通进样阀可分为定子和转子两部分，共有6个口，故称为六通进样阀。转子通过扳手调节，可以分别处于“装样”和“进样”两个位置。图中a为进样阀处于“装样”位置的情况，此时流动相直接进入色谱柱，样品注入口与样品环连接，用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品注入口注入，装于样品管内。当将扳手扳至“进样”位时，进样阀的流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。六通进样阀具有使用方便，进样量准确等优点。样品环有10&l、20&l、50&l等不同容积，可以选配。样品环不仅可以用来贮液，也可用来测量样品溶液的体积。将样品环装满后，
18、进样，进样量即为样品环的容积，此种进样方式称为“满环进样”或“定量环进样”。用定量环进样精密度好，在使用外标法时，应使用此种操作方式。 （三）色谱柱 色谱柱是色谱分离的核心。为了保证色谱柱的柱效高，使用寿命长，一般使用由专业化工厂生产的商品柱。色谱柱管多由不锈钢制成，内装一定的固定相。色谱往长一般1030cm，内径25mm。 化学键合相是广泛使用的固定相，其中又以十八烷基硅烷键合硅胶（octadecylsilyl silicagel，ODS）的应用最为广泛，ODS为非极性化学健合相，此外还有辛烷基硅烷键合硅胶等，非极性化学健合相用于反相色谱法。中等极性的化学键合相有苯基化学键合相等，氰基化学键
19、合相和氨基化学键合相是常用的极性化学键合相，极性的化学键合相一般用于正相色谱法。吸附色谱的固定相中使用最多的是硅胶。无论自己填装的色谱柱还是购买的商品柱，使用能指标包括在一定实验条件下的柱压、理论塔板高度和理论塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性等。 （四）检测器 样品经色谱柱分离后进入检侧器进行检测。按其适用范围检测器可分为通用型和专属型两大类，专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，紫外检测器（UVD），荧光检测器（ED）属于这一类，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应；通用型检测器检测的是一般物质均具有的性质，示差折光检测器（RID），蒸发光散射检测器（ELSD）等。液相色
20、谱-质谱联用（LC-MS）则是用质谱作为高效液相色谱的检测器。 1.紫外检测器 （1）普通紫外检测器 紫外检测器是高效液相色谱中应用最广的一种检测器。用一定波长的单色光照射流通 池，流动相携带被分离的组分进入流通池时，流动相在测定波长处不吸收光或吸收很弱，测 定组分在该波长处有很强的吸收，记录不同时间对光的吸收度，就得到一张色谱图。组分对 光的吸收符合Iambert-beer定律，因此色谱峰的面积和组分的量成正比关系。紫外检测器 的特点是灵敏度高，线性范围宽，对温度和流动相的波动不敏感，可用于梯度洗脱。但紫外 检测器只能检测具有紫外吸收的组分，像糖类、脂肪酸类等在测定范围内无紫外吸收的组分 不
21、能检侧。用普通紫外检侧器也不便测定流出组分的紫外吸收光谱，有的紫外检测器虽可测 定紫外吸收光谱，但在组分到达检测器时需停流，再扫描。 （2）光二极管阵列检浏器（photodiode array detector，PDAD） 光二极管阵列检测器是20世纪80年代出现的一种光学多通道检测器，它可以在瞬间完成对组分的紫外扫描。 由光源发射的光照射流通池，被组分选择性地吸收，透过光通过光栅分光，形成组分的紫外吸收光谱，照射在成矩阵排列的光二极管上，光二极管将光信号转换为电信号，输出的电信号与光的强度成正比，电信号经过累加、处理，就可以得到组分的紫外吸收光谱。因此，使用PDAD，可以在瞬间获得组分的紫外
22、吸收光谱，而不需停流进行紫外扫描。光二极管的个数越多，图谱的分辨率越高，若有512个光二极管，在190800nm范围内扫描，则平均每1.2nm对应一个光二极管。用PDAD按设定的时间间隔采集数据，可以得到一张三维的光谱-色谱图。吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量。 应用三维图谱还可以对峰的纯度进行检查。若一个色谱峰包含有两个组分，则不同位置的紫外吸收光谱会有差异通过比较色谱峰不同位置紫外光谱图的一致性，可以进行色谱峰的纯度检查。2荧光检测器 荧光检测器是利用组分发出的荧光进行检测的方法。荧光检测器的灵敏度比紫外检测器高，检测限可以达到110-10g/ml，但组分必须有荧光。许多药物和生
23、物活性物质具有天然荧光，能直接检测，如生物胺、维生素和甾体化合物抢救无效；通过荧光衍生化可以使本来没有荧光的化合物转变成荧光衍生物，从而扩大了荧光检测器的应用范围，例如氨基酸。由于荧光检测器的高灵敏度和选择性，它是体内药物分析常用的检测器之一。 3蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector，ELSD） 蒸发光散射检测器是在90年代出现的一种新型的通用型检测器，主要适用于无紫外吸收，不能用紫外检测的组分，如糖类、脂肪酸、甘油三酯及甾体等。 ELSD的检测可分为三个步骤。 （1）雾化 在雾化器中，洗脱液通过1个针孔与氮气（也可以用空气）混合，形成均
24、匀的雾状液滴。 （2）流动相蒸发 液滴通过加热的漂移管时，流动相被蒸发，样品组分形成气溶胶，进人检测室。 （3）检测 在检测室内，用激光来照射气溶胶，产生散射，测定散射光强，记录散射光强度随时间的变化关系，就得到了色谱图。 气溶胶受固定光强的激光照射后，待测组分的质量（m）和散射光强度（I）有以下的关系： I=Kmb lgI=blgm+lgK 式中K和b为与蒸发室温度和流动相性质有关的常数。上式说明散射光的对数响应值与组分的质量的对数成线性关系。 ELSD用来测定那些不能用紫外检侧器检侧的组分，对HM的检测器是很重要的补充。但ELSD对有紫外吸收的组分检测灵敏度相对较低此外，它只适合流动相能完
25、全挥发的色谱条件，若流动相含有难以挥发的缓冲剂时，就不能用ELSD进行检测。 4.液相色谱一质谱联用（LC-MS） 液相色谱-质谱联用技术（LC- MS）是用质谱作为HPLC的检测器，它将HPLC的高分离效能和质谱的高灵敏度、高专属性、通用性及较强的结构解析能力相结合，成为药品质量控制、体内药物分析和药物代谢研究的最重要的手段。由于质谱的工作系统是处于真空状态的，若将液相色谱的流出液直接引人质谱仪，流出液挥发产生的大量气体，会使质谱仪无法正常工作。因此，LC-MS的关键是接口，目前应用较多的接口有以下几种。 （1）粒子束（PB）接口 使用粒子束接口时，来自HPLC的洗脱液经雾化器雾化，变成气溶
26、胶微粒，雾化的工作气体是氦气。溶剂在脱溶剂室被蒸发，再进入动量分离器，在动量分离器内由于溶剂和测定组分的质量有很大差别，二者之间会出现动量差，动量较小的溶剂和喷射气体（氦气）被抽气泵抽走，测定组分则沿传输管进入质谱仪的离子源。使用粒子束接口时，可使用EI（电子轰击离子源）或CI（化学离子源），因而可以得到经典的质谱图，并可以使用图谱库检索，对未知样品的分析非常有用，但不适用于对热不稳定的化合物的分析。 （2）热喷雾接口（TSP） 热喷雾接口是在液态下将样品分子离子化的方法。流动相在经过喷雾探针时被加热，体积膨胀后以超声速喷出探针，形成雾滴。液滴在离开喷嘴时由于统计涨落分别带上多余的正电荷或负电
27、荷，当它在运动中不断失去溶剂，液滴的半径足够小时，表面电荷形成很强的电场，导致组分离解。也可以采用热灯丝发射电子束轰击溶剂和测定组引发化学电离。TSP适用于含水比例较高、流速较高（1ml/min 2ml/min）以及极性较大的测定组分的分析。 （3）大气压离子化（API）接口 大气压离子化接口是指离子化在常压下进行的接口，API是目前LS-MS中应用最广的接口。API有电喷雾（ESP）、离子喷雾（ISP）和大气压化学电离（APCI）三种操作模式。 （五）数据记录处理和计算机控制系统 现代HPLC的的特征是用微机控制仪器。HPLC仪器的中心计算机控制系统，即能做数据采集和分析工作，又能程序控制仪
28、器的各个部件，还能在分析一个试样之后自动改变条件而进行下一个试样的分析，许多色谱仪的软件系统具有方法认证功能，使分析工作更加规范化。 三、在药物分析中的应用 高效液相色谱法分离效能高，应用范围广，灵敏度高，仪器已较成熟、普及，在新药的研究开发，药品检验，生物样品的分析中应用十分广泛。 （一）色谱系统适用性试验 由于色谱分离的效果受色谱柱的状况，流动相组成等因素的影响很大，为保证测定结果的准确，中国药典规定，在进行色谱分析前需检查色谱系统是否正常，是否符合要求，即需要作色谱系统适用性试验，色谱系统适用性试验的内容有： 1.色谱柱的理论板数 在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标
29、物质溶液记录色谱图，量出测定组分或内标物质峰的保留时间tR和半高峰宽（Wh/2），按下式计算色谱往的理论板数： n=5.54（tR/Wh/2）2 如果测得理论板数低于各品种项下的规定，应更换色谱柱或其他条件使理论板数达到要求。 色谱柱的理论板数主要取决于半高峰宽Wh/2，在一定的条件下，wh/2越窄，理论板数越高，相邻峰的分离越好。 2分离度（R） 分离度用来表示相邻两峰分离的程度。分离度（R）的计算公式为： 2（tR2tR1） R= W1+W2 除另外有规定外，分离度应大于1.5。当分离度大于1.5时，相邻两峰达到了完全分离。 3.重复性 取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，峰面积的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成三种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。 4.拖尾因子（T） 拖尾因子用来表示峰的对称性。为保证测定结果的准确，特别当采用峰高法定量时，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定，拖尾因子计算公式为 W0.05h T=
