1、纯化与复壮菌种、防止菌种化的目的。诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱微生物突变，提高突变频率，从变异的细胞中筛选出具有所需生产性状的菌株，称为诱变育种。营养缺陷型营养缺陷型菌株指某一菌株丧失了合成某种营养物质的能力，是微生物经诱变剂处理后产生的一种生化突变体。由于基因突变，它失去了合成某种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基的能力，在基本培养基上不能生长，在培养基中若不外加这种营养成分就不能正常生长的变异菌株。在营养缺陷型突变株中，生物合成途径中的某一步发生了酶的缺陷，合成反应不能完成，某段产物不能累积，因此末端产物的反馈调节被解除。缺陷型表为“X”发酵培养基人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或
2、积累代谢产物的营养基质。C/N比生长因子凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入含义后却能提高产量的添加剂。消毒与灭菌消毒（disinfection）：用物理或化学方法杀死物料、容器器具内外病原微生物，而对被消毒的物体基本无害的措施。一般只能杀死营养细胞，例如巴氏消毒法（60，30min）。灭菌（sterilization）：用物理或化学方法杀死或除去物料、空气容器等环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。关系：消毒不一定达到灭菌的要求，而灭菌可以达到消毒的目的。过滤介质除菌采用适当
3、的过滤介质对热敏性的液体或气体进行过滤，去除微生物的方法。致死温度实消分批灭菌也叫间歇灭菌或实罐灭菌、实消。培养基的间歇灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，也称为实罐灭菌，或实消。空消发酵附属设备灭菌，又称空消种子的扩大培养种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过程，这些纯种培养物称为种子。种子扩培的目的：1、接种量的需要2、菌种的活化、驯化3、缩短发酵时间、保证生产水平种子制备的过程大致可分为：1、实验室种子制备阶段2、
4、生产车间种子制备阶段接种量*是指移的种子液体积与接种后培养液总体积的比例。取决于生产菌种在酵罐中生长繁殖的速率和产品生产的工艺要求，通过实验确定。种龄是指种子罐中培养的菌体开始移下一级种子罐或酵罐时的培养时间。菌体比生长速率（specificgrowthrate），是单位质量菌体在单位时间内的增量g/（gh）,即菌体的生长速率除以菌体的浓度，单位为h-1基质比消耗速率单位质量菌体在单位时间内消耗基质的量称为基质的消耗比速率，它表示细胞对营养物质利用的速率或效率。产物比生产速率每克菌体在单位时间（1h）内培养液中产物浓度的变化量，它表示微生物细胞合成产物的速度或效率产物与生长偶联型生长偶联产物生
5、成菌体生长、碳源利用和产物形成几乎在相同时间出现高峰。产物形成直接与碳源利用有关产物与生长非偶联型生长与产物生成部分偶联在生长开始后并无产物生成，在生长继续进行到某一阶段才有产物生成。产物形成间接与碳源利用有关。部分偶联型非生长偶联产物生成在生长停止后才有产物形成与碳源利用无准量关系。分批发酵分批（发酵）培养（batchculture）：指在一个密闭系统内一次性投入有限数量营养物，接入微生物进行培养只完成一个生长周期的方法。Fin=Fout=0（无培养基进出）如在好氧发酵过程中，需要不断通入无菌空气并加入酸碱以调节发酵液的pH值，除此以外，与外界没有其它的物料交换。连续发酵指在一开放系统中，以
6、一定的速度向发酵罐内连续供给新鲜培养基，同时以相同速度将含有微生物和产物的培养液从发酵罐内放出，从而使发酵罐内液体量维持恒定，使培养物在近似恒定状态下生长和进行代谢活动的方法。Fin=Fout0补料分批发酵指在分批发酵中间歇地或连续地补（流）新鲜培养基的方法。Fin0（Fout0，Fout）发酵热发酵热就是发酵过程中所产生的净热量生物热在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化产生能量，一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞代谢产物合成需的能量，另一部分以热的形式散发，这散发出来的热就叫生物热。溶解氧呼吸强度QQ2 mmol O2/g.h，也称氧的比消耗速率氧的消耗速率也
7、称微生物摄氧率r mmol O2/g.h 。（其中，X=X0*eut ，X每ml发酵培养液中的菌体质量浓度 g/L） 临界氧浓度临界氧浓度CCr：各种微生物对发酵液中溶氧浓度的最低要求。对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。KLa以浓度差为推动力溶解氧的传质总系数染菌时间污染时间是指无菌检测方法确定的污染时间，不是杂菌窜入培养的时间。染菌率总染菌率：指一年内发酵染菌的批次与总投料批次数之比的分率：发酵染菌批（次）数/总投料批（次）数*100%简答题或问答题：1、简述自然发酵产特点及其例子2、常见的厌氧和耗氧发酵产物种类厌氧发酵：酒精、乳酸、丙酮与丁醇等好氧发酵：柠檬酸、谷氨酸、抗生素
8、等3、酵母的酒精发酵机制是什么？巴斯德效应及其机理是什么？在酵母体内，葡萄糖经酵解途径生成丙酮酸，在无氧条件下，由丙酮酸脱羧酶催化，丙酮酸脱羧生成乙醛。生成的乙醛作为受氢体，被NADH+H还原为乙醇巴斯德效应及其机理：其机理是因为糖酵解过程（EMP）的受末端产物ATP的反馈控制，即有氧时，由于酵解产生的和丙酮酸进入线粒体而产生大量ATP，控制酵解途径关键酶磷酸果糖激酶的活性，葡萄糖进入途径减少，葡萄糖消耗速率降低。4、简述亚硫酸盐和碱法甘油发酵机制在发酵液中加入3，乙醛与其起加成反应，生成难容的结晶状亚硫酸钠加成物，使乙醛不能作为受氢体。5、了解常见发酵产的工业微生物菌种类型，如高温淀粉酶采用
9、地衣芽孢杆菌，谷氨酸采用棒杆菌或黄色短杆菌糖化酶采用黑曲霉菌株，许多抗生素采用放线菌来生产等等6、简述柠檬酸的发酵机制1、黑曲霉等微生物具有组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。2、丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和丙酮酸固定CO2反应平衡，及柠檬酸合成酶不被调节抑制，增强了合成柠檬酸的能力。3、在控制Fe+含量的情况下，顺乌头酸酶活性低,从而使柠檬酸积累。4、由于锰的缺乏，抑制了蛋白质的合成，而导致细胞内的NH4+浓度升高，促进了途径的畅通。5、柠檬酸积累增加,降低，在低条件下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，从而进一步促进了柠檬酸自身的积累。7、简述谷氨酸发酵过程中改变细胞膜通透性的措
10、施及意义代谢产物的细胞渗透性是氨基酸发酵的重要因素。细胞膜的渗透性好，有利于代谢产物分泌出来，避免了端产物的反馈调节，有利于提高发酵产量。影响谷氨酸产生菌细胞膜通透性的物质：（1）生物素、油酸、表面活性剂。其作用是引起细胞膜的脂肪成分的改变，尤其是改变油酸的含量，从而改变细胞膜通透性（2）青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞膜失去细胞壁的保护，细胞膜受到物理损伤，从而使渗透性增强。8、简述工业发酵对菌种的要求1、发酵工业对优良微生物菌种的要求1） 并能高产和稳产所需的代谢产物；2） 2）能在价原料制成的培养基上迅速生长；3） 3）副产物尽量少，便于提纯，以保证产品纯度。4） 4）菌种不易变异退化
11、，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。5） 5）生产菌株安全，不是病源菌、不产毒素、对环境无害；用作食品添加剂的发酵产品以及进行食品发酵，其生产所用菌种必须符合食品卫生要求。9、什么叫自然选育？自然选育在艺生产中的意义？根据自然变异从自然界或生产中选择符合生产要求的菌种。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变。自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。10、什么是诱变育种？常用的诱变剂有哪些？物理诱变剂：紫外线、X射线、y射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线
12、，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。化学诱变剂：如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等，使用最多、最有效的是烷化剂。优缺点：1、大多数情况下，要比电离辐射更有效。2、化学诱变剂经济、简单。3、大部分诱变剂是致癌剂，必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感。11、简述诱变育种的基本流程（1）出发菌株的选择诱变目的是提高代谢产物或中间产物的产量、质量，或改变原有代谢途径，产生新的代谢产物（代谢控制育种）等，因此出发菌株的选择直接关系到诱变效果。出发菌
13、株应具备一定的生产能力或某种优良特性的菌株，其遗以下传性状应该是纯的，较高产，遗传性状稳定，对诱变剂敏感。以下几类菌株常用作出发菌株：自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易发生正突变；经历生产条件考验的菌株，有一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性；经历多次诱变处理的菌株（2）单细胞或单孢子悬浮液的制备取处于对数生长期的菌体，且尽可能处于同步生长状态的微生物细胞，芽孢细菌采用芽孢制备悬液，放线菌和霉菌采用其孢子。要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出诱变细胞。目的：分散的每个细胞与诱变剂机会均等充分接触；菌悬液用生理盐水或缓冲液稀释：真菌孢子和酵母细胞悬浮液的浓度为106
14、1010 CFU/ml；放线菌或细菌108CFU（3）诱变剂的选择：单一诱变剂两种以上的诱变剂（4）诱变剂处理：预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。一般以致死率70%-80%为最佳诱变剂量。不同诱变剂的剂量有不同的表方法，紫外线和X射线以强度表示12、制备不同种类微生物原生质体的方法细菌和放线菌制备原生质体主要采用溶菌酶：制备酵母菌原生质体，一般采用蜗牛消化酶：制备丝状真菌原生质体时可用蜗牛消化酶、纤维素酶，对丝状真菌一般采用两种或三种酶进行处理才能收到好的效果。13、工业发酵中菌种的退化原因及防止措施有哪些？菌种衰退：指选育出的优良菌种，在传代和保藏的过程中群体中某
15、些生理特征和形态特征逐渐减或完全丧失的现象。定期使菌种复壮是防止菌种衰最有效的方法。菌种的复壮是指使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。（另一种答案：造成菌种退化的原因主要是保藏方法不妥、保藏操作不当、传代不当、培养基不适、回复突变等；从菌种选育方法上考虑：1）进行充分的后培养及分离纯化2）增加突变位点，减少基因回复突变的几率从菌种保藏方式上考虑：1
16、）尽量减少传代次数2）选择适宜的保藏培养基从菌种培养适宜条件上考虑：1）结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物及时淘汰回复突变细胞。2）基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失从菌种管理的措施上考虑（复壮）：1）定期对保藏菌种分离纯化，淘汰已退化细胞；2）定期对发酵液进行分离筛选）14、常见菌种保藏方法的条件和原理是什么？菌种保藏方法的各自优缺点原理：人工创造条件（如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质），使菌种的代谢活动降低低，或处于不活动状态即休眠，以减少变异。生产菌种常用的保藏方法:斜面低温保藏法、石蜡油封保藏法、砂土保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温冻结法15、业发酵培养基的基本要求
17、？发酵培养基的组成成分有哪些？（1）发酵培养基的基本要求（2）不同的培养基有不同的营养需求。（3）必须提合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。（4）有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。（5）尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。（6）原料价格低廉，质量稳定，取材容易。发酵培养基的一般含有：碳源、氮源、无机盐及微量元素、生长因子和水等菌体生长所必需的元素；以及合成产物所需的前体和促进剂16、常用的碳源有哪些？常用的糖类有哪些，各自有何特点？碳源种类：糖类、油脂、有机酸、正烷烃。葡萄糖：所有微生物都能利用葡萄糖，但注意葡萄糖效应（又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用。葡萄糖或某些容易利用的碳
18、源，其分解代谢产物阻遏某些诱导酶体系编码的基因转录的现象。如大肠埃希氏菌培养在含葡萄糖和乳糖的培养基上，在葡萄糖没有被利用完之前，乳糖操纵子就一直被阻遏，乳糖不能被利用，这是因为葡萄糖的分解物引起细胞内含量降低，启动子释放-蛋白，聚合酶不能与乳糖的启动基因结合，以至转录不能发生，直到葡萄糖被利用完后，乳糖操纵子才进行转录，形成利用乳糖的酶，这种现象称葡萄糖效应。附简单解释：只在乳糖与葡萄糖共存的情况下，细菌会优先使用葡萄糖作为代谢原料，而只有当葡萄糖浓度低的情况下，乳糖才被作为能量来源的现象，原因是高葡萄糖浓度下浓度低，无法合成来刺激乳糖操纵子的启动。糖蜜是制糖工业的副产物，主要含蔗糖，总糖可
19、达50%75%。除含糖外，还有很多杂质，使用前要进行预处理。淀粉：微生物必须有能分泌水解淀粉、糊精的酶类。来源广泛、价格底、可以解除葡萄糖效应。难利用、发酵液比较稠，需加入淀粉酶适度水解。糖的种类对微生物代谢产物的合成具有很大影响17、简述双酶法制备淀粉糖的基本步骤及其优缺点反应原理： a-淀粉酶 淀粉葡萄糖苷酶淀粉-糊精、低聚糖-葡萄糖 液化 糖化优点：作用条件温和，对设备要求低；副反应少，产品纯度高（酶的作用专一性），原料利用率高；对原料要求较低，淀粉乳浓度高缺点：所需设备较多反应时间较长（2-3天），夏天容易变质18、常用的无机氮源和有机氮源有哪些？有机氮源在发酵培养基中的作用？无机氮源
20、：类氨盐、硝酸盐和氨水等。特点：微生物对它们的吸收快，所以也称谓速效氮源。有机氮源又称迟效氮源来源花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉。成分：提供氮源外，有些还提供大量的无机盐及生长因子。可溶性蛋白、生长因子生物素）、苯乙酸、乳酸、硫、例如磷、微量元素等。19、什么是生理性酸性物质？什么是生理性碱性物质？举例XX粘来的答案：无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的有积
21、极作用。20、什么是前体？前体添加的方式？是指某些化合物加入到发酵培养基后，能够被微生物直接用于产物的合成，而其自身的化学结构没有明显的变化，但产物的产量却大幅度提高，这类化合物称为前体。如苯乙酸作为青霉素前体使用；氯化物作为金霉素的前体等。前体使用时一般都采用流加的方法添加。21、常用产物促进剂的种类常用促进剂：各种表面活性剂（吐温、植酸等）、大豆油提炼物、甲醇等22、发酵培养基灭菌的基本要求是什么？培养基灭菌的要求：（1）达到要求的无菌程度（2）尽量减少营养成分的破坏。在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和
22、维生素等的分解23、为什么发酵培养基采用高温短时灭菌效果的更佳，依据是什么？从微生物死亡动力学方程可以看出，随着温度的升高，微生物死亡速率加快，而比营养物质分解速度快得多，因此高温短时灭菌可达到相同的灭菌效果，而营养物质破坏大大减少。随温度的升高，灭菌反应速度常数增加的倍数大于营养成分破坏反应速度常数增加的倍数。因此，采用高温快速灭菌方法，即可达到杀死培养基中的全部微生物的目的，又可减少营养成分的破坏。24、简述影响培养基灭菌效果的因素1、灭菌时间2、温度3、培养基PH值：培养基中氢离子浓度接影响灭菌的效果。培养基的PH值越低，所需杀灭微生物的温度越低。6.0-8.0时最难灭菌。培养基成分：油
23、脂、糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物耐热性；大肠杆菌.在水中加热60-65死亡；在10%糖溶液中，需要70加热46，在30%糖溶液中，需要加热30另一些物质，如高浓度的盐类、色素等的存在等可削弱其耐热性4、泡沫：对灭菌极为不利，泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透。在易产生泡沫的培养基中加入消泡剂。5、培养基中微生物数量微生物数量越多，达到要求灭菌效果所需时间也越长。6、培养基的物理状态固体培养基比液体培养基灭菌时间长；颗粒越大，灭菌时蒸汽穿透所需时间越长，灭菌难，对于小于1mm的颗培养基，不必考虑颗对灭菌的影响，但含有少量大颗和粗纤维的培养基的灭菌，则要适当提高温度，在不影响培养基
24、质量的条件下，采用粗过滤的方法预先处理，以防止培养基结块而造成灭菌不彻底。7、其他：微生物细胞的含水量、菌龄等会影响培养基的灭菌效果。25、培养基灭菌过程对营养成份和浓度有何影响？对发酵过程有何影响？26、什么是分批灭菌？什么是连续灭菌？分批灭菌和连续灭菌的优缺点培养基的连续灭菌就是将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。27、无菌空气的标准？无菌空气的制备方法及特点？发酵对空气无菌程度的要求一般按染菌机率为10-3来计算，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许通过12个杂菌。无菌空气的制备方法及特点：加热灭菌（220，20秒）灭菌彻底，能耗大，成本高静
25、电除菌除菌效果差，仅用于初除菌辐射灭菌254-265效果最佳，仅限表面灭菌介质过滤除菌主流的除菌方式28、空气过滤除菌的介质主要材料1绝对（表面）过滤。定义：滤空在表面；依靠直接拦截捕获颗粒。特点：易于控制过滤后的空气质量，节约能量和时间，但孔隙小于0.5，材料较贵，容量有限。2深层介质过滤（1）、污染物被介质内部结构捕获的一种过滤介质，滤孔贯穿于整个介质厚度。（2）、调整流道可以获高容污能力。是以棉花、玻璃纤维、尼龙等纤维或活性炭作为介质填充成一定厚度的过滤层，或将超细玻璃纤维、聚乙烯醇、聚四氟乙烯、金属烧结材料制成过滤层，其介质的空隙大于被滤除的尘埃或微生物。空气流通过这种介质过滤层时，借助惯性碰撞、拦截滞流、静电吸附、扩散等作用，将其尘埃和微生物截留在介质层内，达到过滤除菌目的。设备及操作费用低廉，适用于大量空气的处理。空气过滤设备：以纤维状物或颗粒状物为介质所构成的过滤器纤维状或颗粒介质过滤器过滤层厚度大，体积大，压力降大，操作麻烦，装填介质费时费力。（2）以微孔滤纸、滤板、滤棒构成的过滤器。过滤纸类过滤器除菌效率相当高，对0.3以上颗粒的过滤效率达99.99%以上，阻力小，压力降小，但强度不大，尤其是受潮后强度更差。29、什么是种子的扩大培养？种子扩大培养的目的与要求？种子扩大培养的一般步骤？数量和质量
