1、 学生：曾静平 长江大学农学院 指导老师：袁有禄 中国农业科学院棉花研究所摘要：棉花是重要的纺织工业原料，对国民经济的发展具有极其重要的作用。因此，培育出高产，优质，抗病的棉花是棉花工作者的努力方向，海岛棉具有纤维品质好，高抗黄萎病等优点，将海岛棉中的优异基因有效的转移到高产的陆地棉栽培品种中，获得优势显著的，集高产，优质，抗病虫等目标性状于一身的新品系，是当前棉花育种的重要研究方向。本研究以高产的陆地棉品种中棉所45为轮回亲本，以品质优异的海岛棉海1为供体亲本，经过杂交以及高代回交，并结合分子标记辅助选择，建立一套具有陆地棉背景并渐渗有海岛棉基因的染色体片段代换系群体。通过对BC4F3单株、
2、BC4F3:4株行和BC4F3:5株系的产量和纤维品质性状的评价和332个BC4F3:5株系的海岛棉染色体渐渗片段的分子检测，进行产量和纤维品质性状的QTL定位，为QTL精细定位和育种工作的分子标记辅助选择奠定基础。关键词：高代回交，海岛棉，染色体片段代换系，分子标记， QTLAbstract：Cotton is an important raw material for the textile industry which has an postive efffect on development of national economy. So the worker for cotton r
3、eseach work so hard to culture cotton with high quality , good quality and desease resistant traits.Sea island cotton has an advantage that has better fiber quality and verticillium wilt resistance, which makes it to be an important direction for cotton breeding work to obatain a significant advanta
4、ge strain with high quatity, good quality and worm resistance. In this study, upland cotton CCRI45 （Chinese Cotton Research Institute 45） was used as the recipient parent and Gossypium barbadense L.hai1 as the donor parent. By cross and high generation backcross, we use molecular marker assisted sel
5、ection to construct a population with upland cotton backround and segment exchange of sea island cotton chromosome. By evaluation fiber quality and quatity of BC4F3 individuals, BC4F3:4 lines and BC4F3:5 strains and molecular identification of donor chromosome fragments in 332 BC4F3:5 strains , QTLs
6、 of fiber yield and quality traits were detected in BC4F3:5 strains, which offer a foundation for further QTL fine mapping and molecular-assisted breeding.Key word: Advanced backcross , G. barbadense L.，CSSLs，molecular marker，QTL 1 前言 作为世界上最重要的天然纤维作物，棉花在我国国民经济中占据着重要的地位。据国家统计局统计，2011年，我国棉花种植面积为485万公顷
7、，总产量达597万吨；纺织纱线、织物及制品出口总额为771亿美元。我国是棉纺织品出口大国，但我国自育品种中缺乏纺60支纱以上的特优质棉（项时康等，1999），其主要原因是上世纪80年代前我国棉花生产主要集中在纤维产量提高上，忽略了纤维品质的改良，并且由于长时期的种内杂交，造成了我国陆地棉遗传背景狭窄的局面，直到近20年来，育种工作者才把培育优质棉作为重要课题。作为棉花四倍体栽培品种之一，海岛棉的纤维品质好，但产量比较低，如果将陆地棉的高产基因与海岛棉的优异纤维品质基因有效地聚合，对于拓宽陆地棉栽培品种的遗传基础，同步改良棉花产量和纤维品质意义重大。棉花产量及纤维品质性状均为数量性状（quant
8、itative trait），相对于质量性状，是受多个微效基因控制，表现为数量上或程度上的连续性变异的一类性状，遗传机理比较复杂。分子标记技术的出现和发展为QTL研究提供了新的有效工具。通常定位QTL的群体多为常规分离群体，遗传背景复杂，无法进行多年多点的试验，因此，利用这些群体定位的QTL重复性差，无法进行稳定性验证。而利用杂交、回交和分子标记辅助选择（maker-assisted selection， MAS）培育的染色体片段代换系基因组只含有一个或者少数几个来自供体亲本的染色体片段，其余部分与轮回亲本相同，在相似或相近的遗传背景下进行QTL检测，能有效地减少了遗传背景的干扰，鉴定出更多的
9、QTL，提高QTL检测的准确性和灵敏度，是QTL定位研究的理想材料。本研究以中45和海1组配种间杂交获得的具有陆地棉背景并导入了海岛棉片断的染色体片段代换系为材料，通过对该染色体片段代换系产量和品质方面的评价，再进行相关性状QTL定位，筛选出一批优质新材料，为陆地棉的高产基因和海岛棉的优异纤维品质基因有效聚合奠定基础，对于同步改良我国棉花产量和品质具有重要的意义。2 材料与方法2.1 试验材料及实验路线本实验所选材料为陆海染色体片段代换系中BC4F3，BC4F3:4，BC4F3:5。亲本组配为中棉所45海1，以陆地棉中棉所45（国审棉2003002）为受体亲本，以海岛棉海1为供体亲本。受体亲本
10、为种植广泛的栽培品种，产量高，纤维品质性状表现一般；供体亲本为无腺体海岛棉材料，产量较低，但纤维品质性状表现优异，实验材料是通过组配陆海种间杂交组合，然后以中棉所45为轮回亲本进行高代回交得到（表2.1， 图2.1）。 表2.1亲本材料纤维产量及品质表现材料铃重 （g）衣分 （%）上半部平均长度 （mm）马克隆值断裂比强度 （cN/tex）中棉所455.5530.3429.154.0629.24 海12.6730.9033.534.2137.70 图2.1 染色体片段代换系（CSSLs）的培育2.2 DNA提取及SSR标记技术2.2.1 DNA提取方法2011年8月在棉花所老所部试验田按株行摘
11、取幼嫩叶片提取332个BC4F3:5株系及中棉所45DNA，样品分为两份，一份样品立即用于DNA的提取，一份置于-70超低温冰箱备用。采用CTAB法（Paterson et al.,1993）进行DNA的提取，提取方法如下；（1） 用液氮给研钵预冷， 将叶片放入研钵中加液氮进行研磨直到叶片变成粉末状，迅速将叶片粉末加入7 mL已灭菌的离心管中，大约占离心管体积的1/4左右，往离心管中加入约3 mL左右的提取缓冲液（1 M Tris母液,0.1 M,100 ml;0.5 M EDTA母液,0.005 M,10 ml;PVP 40,2%（w/v）,20 g;Glucose,0.35M,63.1 g
12、;DIECA,0.1%（w/v）,1 g;Vit C,0.1%,1 g;-巯基乙醇,0.2%,2 ml），将叶片粉末与缓冲液混匀。为防止叶片被氧化，此过程操作应迅速。（2） 在离心机对称放置离心管，2700 g，4，离心15 min。（3） 从离心机中小心取出离心管，倒掉上清，加入65预热裂解缓冲液3 mL，缓慢摇匀后置于65水浴锅中水浴40 min，每10 min摇匀一次。（4） 裂解完全后取出离心管，加入相等体积的氯仿:异戊醇（241）抽提液，摇动至乳浊状。对称放置于离心机内离心15 min， 25 ，2700 g。（5） 离心完成后取出，将上清液转入到新的7 mL已灭菌的离心管中，加入相
13、等体积的氯仿1）抽提液，抽提方法同步骤4。（6） 小心取出离心管，将上清液转入新的7 mL已灭菌的离心管中，往其中加入0.6倍体积左右的冰冻异丙醇，轻轻摇动至有沉淀析出。然后-20 下放置30 min以上。（7） 挑出沉淀至已灭菌的离心管中，对提取的DNA用70的酒精反复清洗，直至 DNA呈白色。接着使用无水乙醇再进行一遍清洗，将无水乙醇倒出后，将DNA置于干燥器内干燥，当DNA沉淀有些潮湿时，取出，加入TE溶解。（8） 对DNA纯化完成之后，用琼脂糖凝胶电泳技术检测DNA的质量，质量不好的DNA使用备份样品重新提取，采用Thermo Biomate 5紫外可见光分光光度计测定提取的BC4F3
14、:5株系及中棉所45DNA原液的浓度，根据DNA原液浓度将原液稀释成工作液。2.2.2 SSR标记的PCR扩增 本实验室利用陆地棉中棉所36和海岛棉海1的种间杂交后代BC1F1为作图群体，构建了一张覆盖26个连锁群，包括2280个SSR标记位点的分子遗传图谱，总遗传图距5088.28cM，完全覆盖棉花全基因组。本研究在该图谱的基础上，在每条染色体上以510 cM选择一个SSR标记，共选择了459个标记，利用选择标记对332个BC4F3:5株系DNA进行基因检测。PCR扩增采用10l反应体系（见表2.2），采用的TaqDNA聚合酶由上海申能博彩和楚和霞光提供，附带含PCR缓冲液Buffer（10
15、0 mM Tris-HCl， 80 mM （NH4）2SO4， 20 mM MgSO4， 100 mM KCl， PH 9.0， 0.5% NP-40）。dNTP为Genview的分装产品。PCR扩增所用的PCR仪主要是由Bio-RAD、TECHNE生产的C1000TM和TC-512。反应程序如表2.1所示。 表2.2 SSR标记扩增反应体系（10 1）试剂终浓度用量10PCR Buffer11.00 110 mM dNTP 0.5 mM0.50 1正向引物 （10 M）0.30 M0.30 1反向引物 （10 M）Taq DNA聚合酶 （5 U/1）0.05 U/10.10 1模板DNA （
16、30 ng/1）3.0 ng/l超纯水-6.80 12.2.3 聚丙烯酰胺凝胶银染SSR扩增是在大小为1801201 mm的小板胶上对DNA扩增片段进行分离，胶体为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（表2.3），电泳缓冲液为1TBE，每孔1.7lDNA点样量。表2.3 8 %聚丙烯酰胺凝胶配方每板用量10.3 ml5TBE4 ml聚丙烯酰胺胶母液*5.4 mlTEMED14.1 l10%过硫酸铵360 总计20 ml电泳结束后，银染，观片灯下记录和分析带型，采用0、1法记录带型，在分析位点将有条带的记为1，没有条带的记为0，依条带分子量从小到大进行带型记录。对于含有多个多态性位点的同一标记，则将多个位点
17、带型全部记录下来，并在标记后附缀英文字母以示区分。2.3 数据分析2.3.1 表型性状分析对CSSL群体纤维产量性状，（包括籽指、单株铃数、铃重、衣分、株高、果枝数等表型性状）及纤维品质性状（上半部平均长度、纤维伸长率、马克隆值、纤维整齐度和断裂比强度等表型性状）进行描述性统计分析。统计分析内容包括平均数、最小值、最大值、超亲比例（其中马克隆值的超亲比例为大于3.7小于中棉所36的个体所占的比例）、极差、偏度、峰度和变异系数等。分析采用EXCEL 2007办公软件。用SPSS 17.0对不同群体间及同一群体内部产量及品质性状进行相关性分析。2.3.2染色体片段代换系基因型分析及导入片段检测利用
18、GGT32（graphical genotyping）软件对332个BC4F3:5株系SSR分子标记检测结果作图示基因型，并分析CSSL导入海岛棉片段长度及片段数和遗传背景恢复率等。2.3.3 QTL检测QTL检测：利用QTL IciMapping V3.2软件（王健康，2009）对CSSLs群体纤维品质和产量性状进行QTL定位。QTL命名：q+性状名称的英文缩写+连锁群序号+紧密连锁在该性状QTL上的标记在连锁群的序号。如qFS-3-13表示在第3连锁群上的第13个标记附近有个控制纤维比强度的QTL。3 结果和分析3.1表型性状统计分析3.1.1 纤维品质性状基本统计分析 从表3.1中可以看
19、出：轮回亲本中棉所45在2009年、2010年、2011年三个世代品质性状表现相对稳定。其中中棉所45各性状在2010年的平均表现与2009年相比，纤维品质性状上半部平均长度、整齐度指数、马克隆值、伸长率、断裂比强度等品质性状表现较好，纤维上半部平均长度达到29.60mm，比2009年长2.02mm，纤维断裂比强度达到28.46cN/tex，增加2.27 cN/tex。2011年安阳和库尔勒两试点相比，安阳试点品质性状总体表现较好，上半部平均长度达到29.13mm，比库尔勒试点长0.15mm，断裂比强度达到29.27 cN/tex，比库尔勒试点增加了1.22 cN/tex。这可能是不同地域环境
20、造成的差异。332个BC4F3单株、BC4F3:4株行和安阳（AY）、库尔勒（KORLA）试点的BC4F3:5株系群体的品质性状描述性统计分析如下表。从表3.2中可看出，4个群体纤维品质性状的平均表现与对照（中棉所45）相近。年份上半部平均长度/mm整齐度 /%伸长率 /%断裂比强度/（cN/tex）200927.580.1182.150.174.270.076.400.0226.190.15201029.6083.740.214.740.0628.460.202011（AY）29.130.1383.074.080.046.1929.270.192011（KORLA）28.980.1683.6
21、50.144.586.0528.05 表3.1 中棉所45纤维品质性状表现 表3.2个不同群体的纤维品质性状的描述性统计分析性状群体样本数平均值最小值最大值极差超亲比例/%变异系数/%偏度峰度铃重（g）BC4F3单株3324.702.597.314.7244.5818.430.360.25BC4F3:4 株行5.683.517.323.8122.5911.14-0.155株系a20115.143.276.573.2953.619.49-0.120.475株系k5.473.743.5742.1710.540.01衣分（%）31.2916.9541.1724.2249.7011.37-0.351.
22、1828.1021.4339.5618.1336.4510.150.1029.9021.7038.1916.4848.8010.36-0.0131.6822.0040.3918.3936.1410.52-0.26上半部平均长度（mm）29.3223.9533.899.9487.955.02-0.050.6427.8635.637.7793.074.200.390.7630.2425.0435.029.9880.724.47-0.291.1630.2926.9734.427.4585.844.260.480.623.822.066.5326.2017.030.050.284.463.336.433.1024.400.943.992.885.352.4740.9610.170.090.264.413.205.492.2933.739.17-0.19伸长率（%）6.545.707.201.5066.573.67-0.310.03-6.065.506.601.1031.333.735.935.206.651.4528.014.
