1、PLGA载体 Abstract: Objective To investigate the feasibility of PLGA as scaffold material in bone tissue engineering. Methods The purified bone marrow stromal cells which were separated from rabbit were induced into osteoblasts by Dexamethasone, -glycerophophate and Vitamin C and co-cultured with modif
2、ied PLGA in vitro，then implanted them into the defects of rabbits as the experiment group，in the control group A, only PLGA was implanted，in control group B, nothing was implanted. The results were evaluated by radiograph. Results The form of the induced cells by Dexamethasone was converted to like-
3、osteoblasts, the expression of ALP increased noticeably，and the expression of Collagen I was observed. In the experiment group, 12 weeks after the operation, the defect was repaired by newly-formed callus. In the two control groups, after 12 weeks no callus formed and the defects were not repaired.
4、Conclusions Rabbit bone marrow stromal cells can be induced into marrow stromal osteoblasts by suitable contents of dexamethasone. Modified PLGA is a good scaffold material for the bone tissue engineering.Key words: bone marrow stromal cells;osteoblasts induction; Poly （lactic-co-glycolic acid）骨缺损修复
5、一直是骨科临床面临的一大难题，组织工程骨再造被以为是最有前景的骨缺损医治修复方式之一。组织工程化骨构建第一需要适合的种子细胞，在必然诱导条件下，可使BMSCs向成骨细胞分化的数量大大增加1,2，且取材方便，是良好的骨组织工程种子细胞。PLGA作为迄今研究、应用最多的一种生物可降解合成材料，普遍运用于骨、软骨、血管、神经、皮肤等组织，并已取得美国FDA的批准用于临床，显示出良好的应用前景3,4。PLGA具有良好的生物相容性、可降解性和可塑性等优势并可精准地操纵其分子量、降解时刻及孔隙率和孔径等性能。该材料也存在必然的缺点，如疏水性强，与细胞的亲和性差，无益于种子细胞在支架上的黏附等，从而阻碍组织
6、工程化骨组织构建的成功率。若是采取必然的改良修饰，如应用多聚赖氨酸，胶原等，可使其亲和性改善，知足骨组织工程支架的要求。本实验体外培育兔骨髓间充质干细胞，在成骨诱导剂的诱导下，向成骨细胞转化，并将其作为种子细胞，PLGA为支架材料，植入兔桡骨缺损模型，观看对骨缺损的修复情形。1 实验材料和方式 实验材料与试剂 实验材料 96 孔培育板和24 孔培育板,胎牛血清,胰蛋白酶，TritonX-100,地塞米松，维生素C, -甘油磷酸钠，碱性磷酸酶试剂盒，多聚赖氨酸，PLGA载体，I型胶原原位杂交试剂盒。 实验动物 月龄健康新西兰大耳白兔27只（由锦州医学院实验动物中心提供，动物质量许可证号：SYXK
7、（辽）2003-0011），体重2 kg。 实验仪器 倒置相差显微镜 , AT-858自动酶标分析仪，CO2 培育箱，超净工作台，X光机。 实验方式 兔骨髓间质干细胞的分离和培育5 无菌条件下分离培育兔骨髓间质干细胞。 兔骨髓间质干细胞的成骨诱导及鉴定 细胞传至第3代后，进行成骨诱导 ,实验分诱导组和非诱导组，诱导液为10-8mol/L地塞米松,10 mmol/L -甘油磷酸钠和50 mg/L维生素C, 倒置相差显微镜下观看细胞形态转变，别离在适当的时刻测定碱性磷酸酶含量、型胶原的表达情形、Vonkossa染色。碱性磷酸酶含量测量 %胰蛋白酶消化细胞后，细胞计数，以2 000 个/孔的密度接种
8、于5 块96 孔培育板上。实验分2 组：诱导组和非诱导组;每组10 孔，每3 天换液，于第4天、6天、8天、10天、12天别离掏出1 块培育板，经% TritonX-100处置后，4 冰箱留宿，用酶标分析仪测碱性磷酸酶含量。型胶原的表达检测 %胰蛋白酶消化细胞后，细胞计数，以1104个/孔的密度接种于24 孔培育板。培育板内置预先经多聚赖氨酸防脱片处置的盖玻片，每3 天换液。实验分组同前，于第15 天应用原位杂交技术检测各组型胶原的表达情形。钙结节Vonkossa染色 诱导15 d后掏出细胞爬片，PBS清洗3 次，2% AgNO3水溶液浸染，紫外线下处置30 min，蒸馏水洗1 min，5%硫
9、代硫酸钠水溶液处置2 min后自来水洗5 min。 诱导后细胞与PLGA支架材料复合体构建 将PLGA载体环氧乙烷消毒，扫描电镜观看。将载体别离置于24 孔培育板中。前后应用无水酒精处置48 min，三蒸水处置36 min, 12 min换水1 次。使材料充分湿化。每孔别离加入多聚赖氨酸将材料充分浸泡2 min，吸除多余液体，细胞培育箱内干燥，将传了3 代的成骨诱导的BMSCs制成浓度为4106个/ mL细胞悬液,接种到装有载体的24 孔培育板中,移入CO2细胞箱培育4 min后,在支架周围警惕加入培育液,进行培育。培育24小时后掏出载体，植入兔桡骨缺损模型。 兔桡骨骨缺损模型的成立及实验分组
10、 选用新西兰大白兔27只,随机分为3组。按无菌操作技术行左侧桡骨中上段截骨,造成15 mm骨和骨膜缺损。实验组:骨缺损植入成骨诱导的自体骨髓基质干细胞/PLGA复合支架。对照a组: 单纯植入PLGA复合支架。对照b组：骨缺损对照组。创口周密缝合,不做内、外固定，分笼喂养,自由活动，肌肉注射庆大霉素，术后第12 周行术侧尺桡骨的正位X线片检查。 统计学分析 采纳统计软件进行处置分析，实验数据用s表示，组间比较均采纳重复测量的方差分析。2 结 果 兔骨髓间质干细胞成骨诱导后形态观看 诱导后细胞自第3天可见部份细胞由长梭形慢慢变成长方形，并慢慢变成多角形，体积较诱导前增大，多角形细胞比例随着培育时刻
11、的延长而慢慢增高,见图1。 兔骨髓间质干细胞的成骨诱导鉴定 各组碱性磷酸酶活性检测结果 非诱导组碱性磷酸酶有基础表达，但表达量低，随时刻略有增加;地塞米松等诱导组第4天时碱性磷酸酶表达与非诱导组无明显不同,随后碱性磷酸酶表达开始随时刻的延长而慢慢升高，P<,具有显著性不同。表1 成骨诱导组兔骨髓间充质细胞与非诱导组在不同时刻点的ALP比较*成骨诱导组与未诱导组比较，P&,具有显著性不同 各组原位杂交技术检测型胶原结果 成骨诱导组检测型胶原结果发觉胞浆内可见大量棕黄色颗粒，见图2。非诱导组结果为阴性。 钙结节Vonkossa染色结果 成骨诱导组Vonkossa染色可见钙盐沉积区域呈黑色钙结
12、节，见图3。 诱导后细胞与PLGA支架复合修复骨缺损的X片结果 实验组整个缺损区都可见到骨痂生成，成骨现象明显，已明显形成骨缺损区的桥接，而对照组仍仅在缺损两头有骨痂生成，缺损区中央部份无明显骨生成影像，见图4、图5。3 讨 论最近几年来随着分子生物学的飞速进展和普遍应用，MSCs的体外培育、诱导成骨对整形外科、创伤外科的进展起到了重要的推动作用。BMSCs作为骨组织工程学的种子细胞，在实验室和亚临床时期的成骨研究是近几年来的热点研究。向成骨细胞诱导的条件已经超级成熟,在培育基中加入地塞米松、-甘油磷酸钠、维生素C就能够够使之向成骨细胞分化6。本实验中观看到地塞米松等诱导组细胞形态向类成骨细胞
13、转化，自诱导第3天可见部份细胞由长梭形慢慢变成长方形，并慢慢变成多角形，细胞饱满，多角形细胞比例高，部份区域细胞呈现漩涡状散布。第4天时碱性磷酸酶表达与非诱导组无明显不同,随后碱性磷酸酶表达开始随时刻的延长而慢慢升高,与非诱导组相较较有统计学意义。原位杂交检测型胶原结果发觉胞浆内可见大量棕黄色颗粒。Vonkossa染色可见钙盐沉积区域呈黑色，对照组为阴性反映。在组织工程的研究中,支架材料对再造的工程化组织一样具有重要作用。目前骨组织工程支架材料来源可分为无机材料和有机材料两大类。人工有机材料中的聚乳酸及其衍生物由于其良好的生物相容性、降解产物无毒性、易加工、具有必然强度等优势而在骨组织工程中取
14、得愈来愈普遍的应用。PLGA具有良好的生物相容性、可降解性和可塑性等优势并可精准地操纵其分子量、降解时刻及孔隙率和孔径等性能7,8。本实验采纳的PLGA支架孔隙率在40%50%，既使孔隙相贯通，又知足了临床应用对力学性能的要求。另外，材料孔隙大小应知足骨单位和骨细胞生长所需空间。一样情形下，孔尺寸在200400 m时最有利于新骨生长。PLGA也存在必然的缺点，如疏水性强，与细胞的亲和性差，无益于种子细胞在支架上的黏附等，从而阻碍组织工程化骨组织构建的成功率。本实验应用多聚赖氨酸对PLGA进行修饰，使其亲和性改善，大体上知足了骨组织工程支架的要求。Vacanti等将骨膜成骨细胞与PGA复合培育，
15、发觉有新骨形成，证明了人工载体复合成骨细胞后成骨的可行性9。咱们在此基础上进行了修复兔桡骨大节段骨缺损可行性的探讨，结果发觉术后4周X线即可观看到骨样组织填充于缺损区，到术后8周时整个缺损区都可见到骨痂生成，成骨现象明显，已明显形成骨缺损区的桥接;而对照a和b组到术后8周时仍未见到有骨性愈合的表现，除缺损区两头有少量成骨外，全数由纤维结缔组织填充。以后，咱们将在此研究的基础上，把成骨诱导的细胞与PLGA支架复合植入动物骨缺损模型，观看PLGA支架体内降解性能，为生产可用于临床的组织工程化活性骨奠定基础。【参考文献】 1 Kishimoto KN，Watanabe Y，Nakamura H，et
16、 al. Ectopic bone formation by electroporatic of bone morphogenetic protein-4 geneJ. Bone, 2002,312（4）:340-347.2 Gupta MC, Theerajunyaporn T, Maitra S, et al. Efficacy of mesenchymal stem cell enriched grafts in an ovine posterolateral lumbar spine modelJ. Spine,2007,32（7）:720-726.3 Zani BG, Kojima
17、K, Vacanti CA, et al. Tissue-engineered endothelial and epithelial implants differentially and synergistically regulate airway repairJ.Proc Natl Acad Sci U S A,2020 ,105（19）:7046-7051.4 Wang SL, Xie SY, Zhu LY, et al. Effects of poly （lactic-co-glycolic acid） as a co-emulsifier on the preparation an
18、d hypoglycaemic activity of insulin-loaded solid lipid nanoparticlesJ.IET Nanobiotechnol,2020,3（4）:103.5 王岩松，刘丹平，周大利，等.成骨诱导后骨髓间充质干细胞与A-WMGC支架材料联合培育的实验研究J.辽宁医学院学报，2020，30（2）：102-104.6 Jaiswal N, Haynesworth SE, Caplan AI, et al. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchym
19、al stem cells in vitroJ.J Cell Biochem,1997,64（2）:295-312.7 Ceonzo K, Gaynor A, Shaffer L, et al. Polyglycolic acid-induced inflammation: role of hydrolysis and resulting complement activationJ.Tissue Eng,2006 ,12（2）:301-308.8Rao DA, Forrest ML, Alani AW, et PLGA based nanoparticles for sustained regional lymphatic drug deliveryJ.J Pharm Sci,2020,9（2）:1245-1253.9Vacanti CA,Kim W,Upton J,et growth of bone and cartilageJ.Transplant Proc,1993,25:1019-1021.
