1、选用10-15株人癌细胞株,根据试验目的选择相应细胞系及适量的细胞接种浓度,按常规细胞培养法进行培养;推荐使用四氮唑盐MTT还原法、XTT 还原法、磺酰罗丹明B(SR染色法、或51Cr释放试验、集落形成法等测定药物的抗癌作用。药物与细胞共培养时间一般为48-72 小时,贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。试验应设阳性及阴性对照组,阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药,阴性对照为溶媒对照。3. 评价标准以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线,然后采用Logit法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值)。体外试验至少重复一次。附注:评价药物抗癌活性的方法:1.MTT还原法1.1 基
2、本原理:四氮唑MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲月替 (formazan),而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽(DMSO)溶解甲月替后,在一定波长下用酶标仪测定光密度值,即可定量测出细胞的存活率。1.2 操作步骤:1.2.1选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞,用胰酶消化后,用含10小牛血清的RPMI l640培养基配成5000个ml的细胞悬液,接种在96孔培养板中,每孔接种200l,37,5CO2
3、 培养24 h。1.2.2 实验组换新的含不同浓度被测样品的培养基,对照组则换含等体积溶剂的培养基,每组设35平行孔,37,5CO2 培养45 d。1.2.3 弃去上清液,每孔加入200 l新鲜配制的含0.2 mgml MTT的无血清培养基37继续培养4 h。小心弃上清,并加入200 l DMSO,用微型超声振荡器混匀后,在酶标仪上以试验波长为570 nm,参比波长为450 nm测定光密度值。1.3 结果评定:按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率:肿瘤细胞生长抑制率(1- OD实验/OD对照) 100以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线,从中求出样品的半数杀伤浓度IC
4、50。合成化合物或植物提取纯品的IC5010 g例稀释后接种于动物腹腔,接种细胞数量一般为(1-5)106。3.1.3 原位接种模型原位接种是指将来源于某脏器的肿瘤接种在动物的某脏器,如将人肝癌接种在裸小鼠的肝脏。原位接种不是常规的方法,但有其优越性,是鼓励使用的方法。主要有肺、肝、胃、肠、乳腺、颅内等原位接种方法。3.2 动物分组3.2.1 试验设阴性对照组、阳性对照组、治疗组。3.2.2 治疗组设高、中、低三个剂量组。小鼠肿瘤和腹水瘤接种后次日将动物随机分组,裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径,待肿瘤生长至100300mm3后将动物随机分组。3.2.3动物数普通小鼠每组10只,裸鼠6只。
5、阴性对照组动物数为治疗组动物数实验组数1/23.3 剂量设置3.3.1 治疗组设高、中、低剂量治疗组,一般按4:2:1设置,高剂量使用最大耐受量或LD10的剂量。3.3.2阴性对照组给予相应的溶剂;3.3.3阳性对照药选用对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物,3.3.4如受试物为一抗癌药物的衍生物或类似物时,必须选用该抗癌药物作为阳性对照药。3.4 阳性对照药选择原则疗效确切;与被试物质化学结构类似;与被试物质有类似的作用机理。3.5 药物配制溶于水的药物,用生理盐水或蒸馏水配制;如用酸、碱溶解者,可先用小量酸(0.1-0.5N HCl)或碱(NaHCO3、Na2CO3、NaOH)溶解,调节p
6、H在4.5-9.0的范围内。用乙醇、丙二醇、吐温80、DMSO助溶的药物,或用吐温60、吐温80、2-3%淀粉、0.5%羧甲基纤维素制成混悬液的药物,可腹腔注射或口服,但必须设相同浓度的溶剂对照组。用注射用花生油配制的溶液或乳剂可口服、皮下或肌肉注射。3.6 给药方案和给药途径分组当日开始给药,根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定给药方案。给药途径应与推荐临床用药的途径相同。 给药次数较多,或被试物质溶解性较差,静脉给药有困难时,可考虑使用腹腔给药,但在评价药效时要注意这两种给药途径是有差别的。 可采取瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药途径。腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径。4 评价标准 4.
7、1 腹水瘤模型接种给药后,观察和记录动物死亡时间,计算生存天数。如阴性对照组20%动物存活时间超过4周,表明腹水瘤生长不良,实验作废。采用中位生存时间(即median survival time,MST)来评价每组的生存时间 ,其计算公式为:每组鼠数的中间数-中间生存天数前死亡的鼠数MST=(中间生存天数-0.5)+中间生存天数死亡的鼠数治疗组与对照组的比较,采用T/C(%)来表示,计算公式为: T MSTT/C % = 100% C MSTT MST:治疗组MST ;C MST:阴性对照组MST。评价标准以125%为界,当T/C%125% 时。视为有效,反之则无效。4.2 裸鼠移植瘤模型推荐
8、使用测量瘤径的方法,动态观察受试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数根据移植瘤的生长情况而定,一般为每周2-3次,每次测量同时还需称鼠重。肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为:V = 1/2ab2 或/6bc其中a、b、c分别表示长宽高。两公式的相关性极好,可采用任一公式。根据测量结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume,RTV), RTV = Vt / V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积,Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(%) TRTV CRTVTRTV:治疗组RTV ;CRTV:阴性对照组RT
9、V。疗效评价标准:T/C % 60 %为无效;T/C % 60%,并经统计学处理P0.05为有效。4.3 小鼠肿瘤模型生长较慢小鼠肿瘤采用与裸鼠移植瘤同样的测量瘤径的评价方法。生长较快小鼠肿瘤可采用称瘤重的方法评价。试验结束后处死动物,称体重,解剖剥离瘤块,称瘤重。阴性对照组肿瘤平均瘤重小于1克,或20%肿瘤重量小于400毫克,表示肿瘤生长不良,试验作废。疗效评价公式: 给药组平均瘤重-阴性对照组平均瘤重肿瘤生长抑制率 = 阴性对照组平均瘤重 评价标准:肿瘤生长抑制率40% 为无效;肿瘤生长抑制率40%,并经统计学处理P50%(2)细胞形态学观察:可在光学显微镜与电镜下观察候选化合物作用后细胞
10、的形态学变化,对照组的早幼粒细胞应90%-95%,候选化合物组细胞分化,成熟粒细胞占比例越高,说明该化合物的分化效果越好。5.1.2实体瘤细胞的分化诱导 常用细胞株:人肝癌HepG2、SMMC7721试验方法及评价标准 :主要测定细胞的甲胎蛋白(AFP)、白蛋白含量,-谷氨酸转移酶(-GT)、酪氨酸转氨酶 ( TAT ) 活性及观察细胞形态。分化细胞AFP含量、TAT和-GT活性明显降低,白蛋白含量增加,细胞胞质增加、核缩小。5.2 体内试验 常用人癌细胞小鼠肾囊膜下移植试验、小鼠髓单核细胞白血病试验和人癌细胞裸小鼠移植瘤模型等。可选两种模型,根据肿瘤鼠生存时间、肿瘤的体积及形态变化,观察分化诱导效果。重复试验一次。6. 肿瘤治疗增敏剂增敏剂主要是指放射治疗增敏剂,能增加临床上恶性肿瘤放射治疗或其它治疗的疗效及降低治疗后的复发率。6.1 体外试验 分别选择对放射、化疗药物具有中、低度敏感的人肿瘤细胞株,采用MTT、SRB或细胞集落形成方法进行化合物的细胞毒性试验,以IC50值作为评价指标。6.2 体内试验 选用对射线及化疗药物敏感性较小的三种实体瘤模型进行试验,其中至少有一种人癌裸鼠移植瘤模型。由强致癌物或病毒等因素诱发的肿瘤,或者不是在同一品系动物身上移植传代的肿瘤往往会出现免疫反应,因此都不能用于肿瘤治疗增敏剂研究。疗效评价可参照体内抗肿瘤试验 。