1、郑州大学电气工程学院生物医学工程生物信息学实验报告生物信息学实验五、电子克隆技术（PCR引物设计及分析）一、实验目的：1、了解电子克隆技术的概念2、了解电子克隆技术的基本步骤 3、理解PCR引物设计的基本方法2、实验内容：1、使用Primer premier5.0软件进行人瘦素(leptin) mRNA引物的设计。 2、使用oligo6.0对引物进行评价分析。 3、实验步骤：（一）、引物搜索 1、打开Primer premier5.0软件，调入人瘦素(leptin)基因序列：依次点击“file”，“open”，“DNA sequence”；或者直接依次点击“file”，“new”，“DNA s
2、equence”， 弹出一对话框，然后将序列人瘦素(leptin)基因复制在空白框。 2、序列文件显示后，点击“Primer”；3、进一步点击“search” 按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为
3、主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。我们将Product Size设置300350，其他参数使用默认值。然后点击“OK”，随之出现的 Search Progress窗口中显示Search Completed时，再点击“OK”。4、这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，
4、成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标基本都能达标（如下图）。5、按照搜寻结果显示，在主窗口中检查该引物对的二级结构情况，逐条分析，依次筛选。下面进行序列筛选：点击其中一对引物，如第21#引物，在“Peimer Premier”主窗口，该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能
5、时，按钮由“None”变成“Found”，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有“Found”，只有“None”。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。6、对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在5570 度之间，GC应该在4555间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，
6、二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。按照以上要求，最符合要求的引物为第4#引物。（二）、引物分析1、打开oligo软件 2、单击 file 菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CtrlO”可弹出一对话框，然后选择序列人瘦素(leptin)基因。3、点击“window”再点击“Til
7、e”，出现窗口中显示的三个指标分别为Tm、G和Frq，因为分析要涉及多个指标，起动窗口的 cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tile方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标。G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的G值在5端和中间值比较高，而在3端相对低，Tm值曲线以选取72附近为佳，5到3的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3端Frq值相对较低的片段。4、在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮，选好上游引物，此时
8、该按钮变成红色，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。5、当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价。可以用“Analyse”菜单分析你的引物：比如有无引物二聚体、发卡结构等等。首先检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一
9、般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45-55为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的 GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。当我们结束以上三项检测，按Alt+P键弹出PCR窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。4、思考题 1
10、、提交使用Primer premier5.0及oligo6.0软件进行人瘦素 (leptin) mRNA引物的设计结果； 答：设计结果如前面实验步骤中所示。2、总结引物设计应注意的关键事项。 答： 引物设计有几条基本原则：首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应(即错配)。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm值 (melting temperature)，G值(internal stability)，引物二聚体
11、及发夹结构（duplex formation and hairpin），错误引发位点（false priming site），引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo软件分析设计引物为例，总结出以下的要点：1. 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，即Taq酶的最适温度。2. 引物3端的序列要比5端重要。引物3端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR影
12、响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。3. 引物的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。4. 引物所对应模板序列的Tm值最好在72左右。5. G值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9（G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。6. 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。7. 引物二聚体及发夹结构的能量
13、一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3端的连续GGG或CCC会导致错误引发。8. 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。此外，通过本次实验我得出西夏心得：两个评价系统不一样，oligo评价引物好点，primer 出来的引物，一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。3 端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50的
14、退火温度肯定和65对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在4.5kcal/mol以下3 端有A 无A 影响不大，3 端有T 是不是一定不行，不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是112 那么确定。GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3 端来两个G 或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以设计引物的时候，会尽量避免这样的情况出现。3、如何判断一个分离的基因是否完整?答：直接从序列上评价:5端:(1) 有同源全长基因的比较,通过与其它生物已有的对应基因末端进行比较来判断,(2) 无同源基因的新基因, . 判断编码框架是否完整,a. 在开放阅读框架的第一个ATG上游有同框架的终止
15、密码,b. 无终止密码的则考虑有保守的Kozak 序列12 , . 判断是否自转录起始点,有资料表明,在5帽结构后一般都有一段富含嘧啶的区域,另外如果cDNA5序列与基因组序列中经S1 酶切保护的部分相同,则可以确定得到的cDNA5是全长的。另外还要看看有无启动子序列，这对一个未知的基因很重要，可联网http:/knowledge_3端: (1) 有同源全长基因的比较, (2) 编码框架的下游有终止密码, (3) 有一个以上的polyA 加尾信号, (4)无明显加尾信号的则也有polyA 尾。 用实验方法来证实: (1) Northern Blot 证实大小一致, (2) 用引物延伸法确定5和3的长度。
