1、3. 眼科组织镊（直、弯）4. 12.5cm组织镊（无钩、12钩）5. 25cm敷料镊（无钩）6. 止血钳（18cm直纹式、12.5cm直纹式、弯纹式）7. 解剖剪（五） 试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. RPMI16404. 双抗（青霉素、链霉素）5. 1N HCl6. 7.4%NaHCO3四、操作步骤1. 取材：打开胸腔，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到预先配制好的含双抗（500u/ml青、链酶素）的D-Hanks液中漂洗。 2. 组织的冲洗、修剪：取出主动脉，用锋利的剪刀修剪除去周围组织，再用D-Hanks冲洗主动脉3次，除去血块及杂组织等。3. 平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉
2、，撕下主动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无血清RPMI1640漂洗3次。4. 剪切：将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成1mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加12滴培养液，以保持湿润。5. 贴块：将剪切好的组织小块，用眼科镊送入培养瓶内，用弯头吸管将组织块均匀摆置，每小块间距0.5cm左右，组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入适量含10%牛血清培养液，盖好瓶盖。6. 培养：将培养瓶瓶底朝上，37培养箱放置24h，待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。7. 换液：原代培养35d，需换液一次，去除漂浮的组织块和残留的血细胞。组织块培养法也可不用翻转
3、法，即在摆放组织块后，向培养瓶内仅加入少量培养液，以能保持组织块湿润即可，盖好瓶盖，放置37培养箱24h再补加培养液。注意事项1. 取材的组织最好尽快培养。因故不能即时培养，可将组织浸泡于培养液内，放置于冰浴或4冰箱中，如果组织块很大，应切成1cm3以下的小块再低温保存，但时间不能超过24h。2. 从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材，可用含5001000u/ml的青、链霉素BSS液漂洗510min，或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再作培养。3. 组织块不易贴壁，可预先在瓶壁涂薄层血清、胎汁或鼠尾胶等。4. 原代培养的12d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦发现，
4、要及时清除。 审实验二 消化培养法学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养此法采用消化分离法（即结合生化和化学手段把已剪切成小体积的组织进一步分散的方法），将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，可直接进行培养。分散后细胞易于从外界吸收养分和排出代谢产物，容易生长，存活率高，可以很快得到大量活细胞，细胞在短时间内生长成片。由于各种消化试剂的作用机制各不相同，要根据组织类型和培养的具体要求选择消化方法和试剂。本方法适用于培养大量组织，原代细胞产量高，但步骤繁琐，易污染。（本节以乳鼠心肌细胞培养为例）三、材料：2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 摇床（3
5、7）5. 冰箱（4、-20）6. 倒置相差显微镜7. 培养箱2. 吸管（弯头、直头）3. 烧杯（200ml、10ml）4. 玻璃瓶（250ml、100ml）5. 玻璃漏斗4. 15ml离心管5. EP管4. 12.5cm组织镊（无钩）5. 红血球计数板6. 泡沫板7. 大头针8. 尼龙网膜（140目）3. DMEM5. 胰蛋白酶（0.08%）6. 1NHCl7. 7.4%NaHCO3取新生13天的乳鼠，雌雄兼用，75%酒精消毒3次，用大头针将乳鼠固定在泡沫板上，无菌操作下打开胸腔，取出心脏，放入装有DHanks液的培养皿中。2. 组织修剪、漂洗：修剪去除血管等杂组织，DHanks液中漂洗数次，
6、以除去血块等。3. 剪切：将心室肌用锋利的眼科剪反复剪切组织至剪成12mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加12滴培养液，以保持湿润。4. 消化：将组织小块转移至100ml的玻璃瓶中，再加入3050倍组织量并预温37的0.08%胰酶消化液，37摇床消化6min左右。5. 细胞分离：消化完毕，用吸管轻轻吸吹几下，使组织小块散开，静置2min后，吸取上面的混悬液（弃去第1次的混悬液），经140目尼龙网膜过滤至盛有终止液试管中，1000rpm，离心10分钟，弃去上清，加适量的培养液悬混。在装有组织小块的玻璃瓶中再加入3050倍组织量并预温37的0.08%胰酶消化液，重复第4、5步骤，直至大部
7、分组织小块消失。6. 细胞计数：将上述获得的细胞悬液，吸出少许，适当稀释，加台盼蓝溶液染色，用红血球计数板计数活细胞和死细胞，计算细胞密度和存活率。7. 细胞接种：将细胞接种至30ml的培养瓶中，每瓶6105，用含15%小牛血清的DMEM培养液培养。8. 培养：5%CO2、37培养箱培养12h，显微镜下可见细胞贴壁，呈多角形，培养24h，镜下见细胞已连结在一起，部分细胞开始搏动。9. 换液：培养35d，细胞换液。五、注意事项2. 从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材，可用含5001000u/ml的青、链霉素BSS液漂洗510min，或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再作培养。
8、3. 原代培养的12d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦发现，要及时清除。审实验三 细胞传代学习细胞传代方法，扩增细胞，建立细胞系。培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。（一）仪器4. 冰箱（4、-20）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 玻璃瓶（250ml、100ml）3. 培养瓶4. 废液缸（四）其他物品2. 红血球计数板（五）试剂5. 胰蛋白酶（0.08%）或EDTA或两者混合液7. 4%
9、NaHCO3（一） 贴壁细胞的消化法传代：1. 吸除或倒掉瓶内旧培养液。2. D-Hanks液洗23次。3. 向瓶内加入适量消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加适量新的消化液，轻轻摇动再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。也可不采用上述步骤直接加消化液进行消化。4. 消化最好在37或室温25以上环境下进行。消化25min后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化。5. 吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直
10、接加少许含血清的培养液，终止消化。6. 用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。7. 计数，分别接种在新的培养瓶内。（二） 悬浮细胞的传代悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代，或直接传代。离心传代法：1. 将细胞连同培养液一并转移到15ml离心管内；2. 离心8001000rpm，5min；3. 弃去上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液；4. 计数，分别接种在新的培养瓶内。直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1/22/3，然后
11、用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。（三）、部分贴壁细胞的传代部分贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等，不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。对绝大部分贴壁生长的细胞，因直接吹打对细胞损伤较大，细胞常有较大数量的丢失，因而需消化后，才能吹打传代。1. 胰蛋白酶要预温，温度37左右为宜。2. 离心转速要合适，转速过低，不能有效分离细胞，离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。3. 要定时观察细胞，发现污染，应及时处理。实验四 细胞冻存和复苏学习细胞冻存和复苏的方法，掌握长期保存体外培养细胞的技术。细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的
12、耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓
13、慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。4. 冰箱（4、-20、-70）7. 液氮冰箱2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）（三）塑料器皿4. 移液管（10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（12ml）3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪3. 培养液8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（一）细胞冻存1. 配制含10%DMSO或甘油、1020%小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存
14、培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5106/ml1107/ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管11.5 ml；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1-2/ min；当温度达-25以下时，可增至-5-10/ min；到-100时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20冰箱2h ，然后放入-70冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。（二） 细胞复苏1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37温水中，并不时摇动令其尽快融化。2. 从37水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加
15、10倍以上培养液，混匀；3. 离心， 1000rpm，5min；4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液，继续培养。1从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；2将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；3冻存和复苏最好用新配制的培养液。实验五 细胞生长曲线、四唑盐试验（MTT）比色试验一 细胞生长曲线（一）、目的学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。（二）、概述：细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方
16、法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。（三）、材料6. 培养箱（37、5%CO2、饱和湿度）1. 吸管（弯头）3. 24培养板4. 胶塞5. 0.08%胰酶（四）、操作步骤1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液；2. 计数，精确地将细胞分别接种于2130个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。3. 每天或每隔一天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均值。培养
17、35d常要给未计数的细胞换液。4. 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。（五）、注意事项1 细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有2030%的误差，需结合其它指标进行分析。2 现在很多实验室利用培养板采用MTT法进行生长曲线测定，较为简便。3 标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的潜伏适应期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。4 在生长曲线上细胞数量增加1倍时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。二、四唑盐试验（MTT）比色试验学习四唑盐比色试验，检测细
18、胞存活和生长情况。（二）、概述 四唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称MTT。活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。4. 冰箱（4）6. CO2培养箱7. 振荡混合仪8. 酶联免疫检测仪9. 移液枪10. 电磁力搅拌机11. 微孔滤器1. 吸管2. 小烧杯（100ml）3. 废液缸3. 96孔培养板5. 50ml离心管6. 胶塞6. 二甲基亚砜（DMSO）7. MTT溶
19、液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4保存备用，两周内有效。1. 接种细胞：用0.08%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。2. 培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37、5% CO2及饱和湿度条件下培养。（培养时间取决于实验目的和要求）3. 呈色：每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20ul，37孵箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮生长的细胞，需离心（1
20、000rpm，5min），然后弃去孔内培养液。每孔加入150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。4. 比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为终轴绘制细胞生长曲线。1 选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。2 避免血清干扰，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。3 设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。实验六 台盼蓝（trypan blue）排斥实验 学习台盼
21、蓝排斥实验的原理和方法台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色。是最常用的检测细胞活率的方法。细胞活力常用百分比表示，活力的大小对试验结果有很大影响。细胞活力的测定有许多方法，最简便常用的方法是台盼蓝（trypan blue）染色法。1. 显微镜、玻片、盖玻片、滴管2. 试剂：0.4%台盼蓝染液：1） 台盼蓝（Trypan blue） 0.4g 2） 生理盐水 100ml1、将待染色细胞稀释至所需浓度。（方法及浓度范围与细胞计数相同） 2、每0.1ml细胞悬夜约加新
22、鲜配置的染液一小滴，室温下染35min 。3、染色过的细胞材料，取一滴细胞悬液置玻片上，加盖玻片后放在高倍镜下观察。4、死亡的细胞着浅蓝色并膨大，无光泽；活细胞不着色并保持正常形态，有光泽。计数100200个白细胞。统计未染色细胞。可按公式计算出细胞活力。 细胞活力（%）=未染色的细胞数/观察的细胞总数 1001. 染色时间不能太长，否则活细胞也会逐渐积累染料而染成颜色，使检测结果偏低。2. 另可结合细胞计数方法，同时进行细胞计数和活力检测。实验七 外周血细胞瑞氏（Wright）染色及计数掌握细胞瑞氏（Wright）染色及细胞计数方法瑞氏染料中有美蓝和伊红两种成分，前者为碱性，后者为酸性，它们
23、与细胞内的各种物质具有不同的亲和力，使其显现出不同的色调。血细胞核由去氧核糖核酸和强碱性的组蛋白、精蛋白等形成核蛋白。这种强碱性的物质与瑞氏染料中的酸性染料伊红有亲和力，所以染成红色；核蛋白中还有少量的 弱酸性蛋白，它们又与染液中的碱性染料美蓝起作用而染成蓝色，但含量太少，蓝色反应极弱 ，故核染色呈现紫红色。较幼稚的细胞之胞浆和细胞核之核仁中含有酸性物质，它们与染料中的碱性染料美蓝有亲和力，故染成蓝色。三、材料及试剂 （一）、瑞氏染料1、 瑞氏染料（粉） 1g2、 纯甲醇（二级以上） 600ml（二）、缓冲液1. 1%磷酸二氢钾 30ml 2. 1%磷酸氢二钠 20ml3. 蒸馏水 加至100
24、0ml 在没有缓冲液的情况下，可用蒸馏水代替，但着色不如缓冲液满意。1. 制作血涂片滴一小滴血（约5ul）于干净玻片上，推片与玻片应呈约30角，用力均匀而较快，且不可复推。如血滴较小，推得较慢，角度小于30，所制涂片较薄；如血滴较大，推得较快，角度比30大时，则所制涂片较厚。2. 将标本放平（最好置于一个固定架上），用滴管将染液滴于涂片上，可用滴管将染液驱散，使其布满整个涂片。染液布满整个涂片后，稍等片刻或立即加入缓冲液，并使缓冲液与染液混均匀。3. 染液与缓冲液的比例：染液量要充足，否则染液很快蒸发，将染料沉淀于细胞上。染液与缓冲液的比例为1：24左右比较合适，稀释度越大，染色时间越长，细胞
25、着色较好，反之则越差。4. 染色时间：视具体情况而定，一般约需1030分钟。5. 冲洗：用自来水冲洗涂片上之染料。6. 显微镜检查：待自然干燥后用光学显微镜检查.五、正常血细胞形态1. 成熟红细胞：正常红细胞为两面微 凹而呈盘状，染色后则呈中心浅染之桔红色细胞，平均直径7.6um。2. 成熟中性粒细胞：PB中有两种，杆状核和分叶核。杆状核粒细胞形态：圆形或椭圆形，直径1013um。胞核如杆状、带状，胞核之凹超过假设核圆径的3/4，而且两端的内外有相当一段的平行。染色质凝固成块状，着色不均匀，其间可有空白区。胞浆内已不含有嗜碱性物质，而满布中性颗粒。中性分叶核粒细胞：圆形，直径1013um。核呈分叶状，少者分两叶，多者六、七叶以上，叶与叶之间有细丝相连或完全断开， 或互相重叠。染色质成细块状。胞浆内布满中性颗粒。3成熟淋巴细胞：圆形，直径518um。核圆形或拟蚕豆状，染色质致密成团块状。胞浆量少，蓝色，可有少许圆形、周边整齐的嗜天青颗粒。大淋巴细胞胞浆量多，呈淡蓝色
