1、（二）透明质酸的主要用途 透明质酸在有机体内具有多种重要的生理功能，如润滑关节，调节蛋白质、水、电解质的扩散和运转，促进创伤愈合等，因此其在临床医学上有着巨大用途，例如透明质酸已成为现代眼科“粘性手术”的必备药物；利用透明质酸独特的流体力学特性可治疗骨关节疾病；促进伤口的愈合；作为易于检测的观察指标辅助诊断某些疾病等。透明质酸目前及潜在的医学医药应用见表6-1-1。表6-1-1 透明质酸在医学医药上的应用应用领域主要功能和作用眼科玻璃体的替代品，舒适的滴眼药，眼科手术中的优良粘合剂。矫型外科增强骨骼关节间的滑动，用于矫型手术。外科手术用于耳鼻喉科手术，用作腹部、手部的抗粘连接剂。骨关节术有希望
2、将动物关节术中的成功经验用于人类。伤口愈合促进组织再生、重塑和愈合，其银盐可缓慢向伤口释放银离子而促进伤口愈合。临床诊断用作肝、肿瘤的诊断指标。此外，透明质酸具有特殊的保水作用。高分子量的透明质酸最多可以持水6 L/g，因而是一种理想的天然保湿因子（Natural Moisturing Factor，简称NMF）。它可以改善皮肤的营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老。含有透明质酸的化妆品目前被国际上公认为“仿生化妆品”、“第四代化妆品”，许多国家在竞相研究开发。表6-1-2列出透明质酸结构、性能对皮肤的影响。表6-1-2 透明质酸结构、性能对皮肤的影响二、透明质酸的生物合成（一
3、）透明质酸的生物合成途径 1937年，Kendall等发现溶血性链球菌Streptococcus haemolyticus可以合成透明质酸后，陆续报道了许多可产生透明质酸的微生物菌株。虽然到目前为止生物合成透明质酸的详细机制还不是很清楚，但根据现有的工作以及关于透明质酸两种UDP前体的研究，可以确定透明质酸的合成途径如图6-1-2所示。透明质酸是UDP-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA）和UDP-N-乙酰葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）在透明质酸合成酶作用下合成的。UDP-GlcA是糖醛酸途径的中间产物，与UDP-GlcNAc一样，它们的形成都不需破坏葡萄糖骨架。Oregan通过同位素标记实验证实
4、，只有57%的葡萄糖能转化成透明质酸，其原因有可能是磷酸葡萄糖变位酶受UDP-GlcNAc反馈抑制。因此，要增加透明质酸的合成，必须克服这种反馈调节机制。图6-1-2 透明质酸代谢示意图 位于原生质体膜上的透明质酸合成酶（hyaluronan synthase）是透明质酸合成途径中的关键酶，但并不是说在透明质酸合成酶的作用下UDP-GlcA和UDP-GlcNAc就能够合成透明质酸。在真核和原核微生物中都会形成一个与原生质膜相关的蛋白复合物来催化透明质酸的合成和运输。转座子突变实验证实原核细胞的透明质酸合成酶为42 kDa的膜蛋白。Stoolmiller和Dorfman等对A群链球菌的酶制备液进
5、行研究，发现透明质酸分子链的延长是从内源透明质酸的非还原端进行的，在Mg2+存在的条件下，仅以UDP-GlcA和UDP-GlcNAc 为底物即可合成透明质酸。合成时将UDP-GlcA和UDP-GlcNAc交替连接在透明质酸链上，反应进行非常快，每分钟约100个糖单位。Van de Rijn发现链球菌的透明质酸合成酶也与细胞膜有关，在对数生长期可以很高的速率（大约为430954 nmol/（hg蛋白）合成透明质酸；但在静止期，其膜上的酶会失去利用前体形成聚合物的能力。Van de Rijn推测这可能是由于膜形态的改变，造成合成机制的改变，或是有关合成的酶被稀释和降解造成的。 Sugahara等用
6、无细胞体系进行研究，发现合成的透明质酸可以分成两部分，即可溶于三氯乙酸的部分和不溶于三氯乙酸的部分。脉冲追踪技术表明，不溶部分是可溶部分的前体，但这两部分在分子大小上没有明显的区别。同时还发现透明质酸分子链的起始不需要酶系统参加。虽然有学者对透明质酸链延长的步骤进行了推测，但详细机制还不很清楚。 细菌在合成透明质酸的同时也伴随着透明质酸的降解。链球菌在胞内合成透明质酸后，在细胞膜上的透明质酸酶的作用下，将胞内透明质酸降解到一定程度后，分泌到胞外。产生透明质酸酶的微生物有很多，不同菌种所产生酶的活力及产生时间是不一样的。Van de Rijn发现C族链球菌D181的胞内透明质酸分子量为10106
7、 Da，而胞外的仅2106 Da，约为胞内的20%。细胞在静止期大量合成胞外降解酶，可以将透明质酸彻底降解。（二）透明质酸合成的分子生物学机制 Dougherty 和Van de Rijn对A群链球菌研究发现，从透明质酸前体的合成到透明质酸的合成所需的酶都与细胞膜有关。有关透明质酸合成的操纵子是包含一个称为hasA的基因，编码着A群Streptococci的透明质酸合成酶。所合成的蛋白显示出膜蛋白的特性，氨基酸序列同系现象表明该蛋白与多糖产生和细胞分化有关。Dougherty等同时确定了其DNA序列和hasA转录起始点。用Tn916作为插入子插入hasA基因中，除透明质酸合成酶失去活性外，UD
8、P-葡萄糖醛酸脱氢酶活力也丧失。这些结果表明，编码透明质酸合成酶基因和UDP-葡萄糖醛酸脱氢酶基因存在于同一个操纵子上。 Crater和Van de Rijn对has操纵子进行了进一步的研究，发现has操纵子上有三个基因hasA、hasB、hasC，分别编码着透明质酸合成酶、UDP-葡萄糖脱氢酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。has操纵子的表达是Streptococci （A群）合成透明质酸荚膜所必须的。Streptococci （A群）荚膜细菌和非荚膜细菌，以及Streptococci （C型）荚膜菌都具有has操纵子。荚膜表型可以说明膜上是否缺少透明质酸合成酶活性或胞外透明质酸酶。RNA分析也
9、表明失去荚膜的Streptococci （A群）菌会失去has操纵子所转录的mRNA，微生物生理状态的变化规律与所获得的has操纵子的启动子所表现的一致，这些都说明A群链球菌透明质酸荚膜的合成是受转录机制所控制的。三、透明质酸的生产（一）动物组织提取法生产透明质酸 最初生产透明质酸的途径主要是从动物组织中提取，原料涉及前述的大部分含透明质酸的动物组织，表6-1-3为各种组织中透明质酸的含量。由于来源和成本的原因，鸡冠、牛眼是最常用的提取原料。表6-1-3 各种组织（液）中透明质酸的含量原料浓度 /mgL-1（mgkg-1）浓度 /mgL-1（/mgkg-1）公鸡冠7500人玻璃体140380牛
10、鼻软骨1200人表皮200兔脑65人淋巴液8.518兔肌肉27人尿0.10.5人脐带4100人血清0.010.1人关节滑液12403600 从人和动物体内所得到的透明质酸的分子量一般都大于60万，粘度较高，保湿性能也较好，占据世界眼科主要市场的透明质酸制剂Healon，目前仍然采用这种方法所制得。从动物组织中提取的一般方法如下：先将组织打成匀浆，再用水和稀的盐溶液提取。提取液用季铵盐（如氯化十六烷基吡啶）沉淀。将所得沉淀溶于氯化钠溶液，用三倍乙醇沉淀即得粗品。纯化时，可用乙醇和季铵盐反复沉淀进行处理，也可通过凝胶和/或离子交换色谱的方法精制。1 kg新鲜公鸡冠一般可制得4 g纯透明质酸。（二）
11、发酵法生产透明质酸 动物组织提取法有着许多不可克服的缺点。首先是原料来源缺乏，无论是鸡冠、还是牛眼都非常稀少，并且各种原料中的透明质酸产量相对比较低（表6-1-3）；其次由于动物组织中透明质酸通常与其它蛋白多糖相结合，使得透明质酸提取和精制的成本很高；再者动物来源的透明质酸可能受到不同程度的污染，因此其使用受到许多严格规定的限制；更为重要的原因是提取法生产的产品难以满足透明质酸市场需求量不断增加的需要。在这种情况下，研究人员积极探索透明质酸生产新途径。 1983年日本资生堂首次报道用链球菌生产透明质酸，随后英美等国相继报道采用微生物发酵生产透明质酸的方法，大大拓宽了透明质酸来源，推动了透明质酸
12、的研究和应用。微生物发酵方法生产透明质酸的实现是透明质酸生产领域在近年来取得的最重大的进展，不仅可以降低透明质酸生产成本，而且透明质酸的质量提高，品质稳定。发酵法生产透明质酸和提取法生产透明质酸的比较如表6-1-4。同其它产物的发酵一样，透明质酸的发酵生产同样也追求高产率和高转化率，同时还要保证透明质酸产品的高分子量，因为其分子量的高低直接影响其质量的高低。此外，透明质酸作为一种医药产品，其安全性也是需要考虑的一个重要问题。表6-1-4 发酵法生产透明质酸与动物组织提取法生产透明质酸的比较提取法发酵法来源有限原料很广提取工艺透明质酸在原料中与蛋白质和其它多糖形成复合体，分离纯化工艺复杂透明质酸
13、在发酵液中游离存在，分离纯化容易分子量180万性质不同来源差异较大分子量高、粘度大、保湿力强质量与产量质量不稳定，取决于动物组织来源，产量较小，产品成本高产品质量稳定，产量大，产品成本明显低于提取法1环境条件对透明质酸产量的影响 迄今为止，实验室研究和工业化生产都发现最适合发酵生产透明质酸的微生物是链球菌。影响链球菌合成透明质酸的最主要环境因素是氧。厌氧条件下发酵法生产透明质酸的产量为0.31.0 g/L，而在通风搅拌的情况下，可以达到46 g/L。Johns等研究了搅拌转速对透明质酸生产的影响，发现在厌氧培养时，较高的搅拌转速下透明质酸产量更高，而菌体的生长速率和转化率不受影响；降低转速会使
14、透明质酸产量降低，同时副产物增加。这是因为透明质酸溶液是一种假塑性流体，高的搅拌（剪切）速率可以降低溶液粘度，增加营养的供给，消除细胞周围富集的副产物对细胞的毒害，同时高的搅拌速率可以将细菌的透明质酸荚膜释放到培养基中。 不同研究关于氧对链球菌生产透明质酸的影响并不一致。Clery和larkin 认为透明质酸可作为一种抵抗O2渗透的屏障，防止分子氧对细胞的毒害，因此通风可以促进透明质酸的产生；Swann等也发现在对数生长期控制相对较高的溶氧浓度，可以获得更高的透明质酸转化率。然而Bracke等发现培养基中丰富的CO2可以促进透明质酸的合成。Johns等发现，与厌氧培养相比，通风培养可以获得更高
15、的透明质酸浓度和转化率。另外，厌氧培养的产物单一，而通风培养时大大增加了其它副产物及CO2的产生。 营养源的浓度对透明质酸产量的影响也很大。宫田俊范发现培养基中葡萄糖浓度过高或过低时都不能得到好的发酵结果，当初始葡萄糖浓度为15 g/L，发酵过程中控制培养液中葡萄糖含量低于15 g/L 可获得最高的透明质酸产量。此外，发酵方式也影响透明质酸的生产。高山健一郎采用半连续和连续培养的方法控制粘度在200 cps以下可使得透明质酸产率、转化率大大提高。也有将培养基中氧化还原电位控制在-100-400 mV使透明质酸产量提高的报道。2环境条件对透明质酸分子量的影响 氧不仅对透明质酸发酵生产的产量有很大
16、影响，而且还影响透明质酸的分子量。厌氧条件下透明质酸的重均分子量为0.7106 Da或更低，有氧条件下分子量则高于2106 Da。在一定的条件下，胞外透明质酸酶缺失的链球菌可产生高分子量的透明质酸。控制pH对透明质酸的分子量影响很大。日本资生堂首次报道的用链球菌发酵得到4.0 g/L透明质酸的实验是在通气搅拌、pH 7的情况下进行的。当pH在8.08.9的范围内，透明质酸分子量可以达到2.5特殊的添加剂也能提高产物的分子量。如在培养基中添加苯酚等化合物，透明质酸的分子量可以达2.5106 Da左右；森田裕等通过添加表面活性剂，获得了高纯度高分子量的透明质酸。 产品分子量不仅受发酵条件的影响，也
17、受提取工艺的影响。不恰当的提取方法不仅会使提取得率降低，而且会使透明质酸分子量降低。若存在对聚合链剪切的操作，透明质酸分子可能会发生断裂。目前世界上有4个研究小组对有机溶剂法提取透明质酸进行了研究，发现控制合适的pH、温度，分别将蛋白质、核酸等杂质去除，既能获得高纯度透明质酸产品，又不会在提取过程中降低透明质酸分子量。3环境条件对透明质酸安全性的影响 透明质酸生产的安全性包括生产过程的安全性和产品的安全性。不产任何毒素的生产菌株，既可防止生产过程中偶然的泄漏造成对健康的伤害，也可大大降低后提取过程的成本。一般的做法是先采用诱变的方法将菌种产生毒素的性能去除，然后再进行培养研究。Ellwood、
18、高山健一郎等采用连续培养的方法，既可降低提取成本又可减少毒素的产生。菌体生长进入静止期后，细胞开始产生不同的毒素，同时各种降解酶开始作用使菌体发生自溶，各种细胞成分释放到培养基中，使得提取困难。在成分稳定的培养基中进行连续培养，可以大大减少这些酶的表达。连续培养的另一个优点是细胞壁更新率较低，而细胞壁成分与透明质酸分离困难，因此这是一个优点。四、透明质酸生产中需要解决的问题 透明质酸在医学、医药和化妆品领域具有的广阔应用前景。作为一种商品，透明质酸的质量和成本正成为制约透明质酸广泛应用的一个重要因素。发酵法生产透明质酸的成功是近年来透明质酸生产研究取得的最重大的进展，但由于发酵法生产透明质酸的
19、发展历史较短，尚存在如下不足和需要解决的问题： 1原料。原料成本是生产成本的重要部分，开发可以利用价格低廉和较粗放原料（包括各级放大的种子所用的原料）的菌种是一个重要的应用研究方向。 2发酵过程的动力学。动力学是应用现代发酵技术的基础，对其进行研究，可以了解发酵过程的规律，对生产过程进行优化和控制，以获得高底物转化率和高生产强度。但到目前为止，关于透明质酸的发酵过程动力学，还没有相关的研究报道。 3发酵过程的优化与控制。透明质酸溶液具有极强的粘弹性，其发酵体系有着与一般体系不同的流变学特性。已有的一些关于发酵法生产透明质酸的研究报道，主要集中于研究一些简单的发酵条件，对透明质酸发酵过程中的特殊
20、现象没有进行深入的考察。如，搅拌、溶氧浓度如何影响透明质酸发酵的过程和结果，氧在发酵过程中所起的作用等。 4工业化生产模式。透明质酸发酵生产的周期较短，仅采用单一的分批操作模式不一定能得到最佳的工艺效果。而现有的研究多集中于分批发酵，虽然已有报道阐述连续培养生产透明质酸的优点，但其能否应用于实际生产还有待于进一步研究。 5发酵机理的探讨。已有研究表明仅10%左右的底物可以转化为透明质酸，但其原因何在?是否可以采用一定的手段和方法来提高透明质酸生物合成的转化率?虽然有关透明质酸生物合成机制的研究已进行到分子水平，但还没有关于提高透明质酸合成能力的理论和方法的报道。五、本章主要内容 本章以兽疫链球
21、菌（Streptococcus zooepidemicus）H23为生产菌株，采用摇瓶和小型发酵罐对该菌株的发酵条件进行研究，并根据该菌株细胞生长和产物合成的动力学特性提出其发酵过程的动力学模型；通过对模拟发酵体系的流变学行为和混合、传质性能进行研究，深入探讨搅拌和溶氧在发酵过程中的作用，提出搅拌溶氧控制策略并实验验证；对多种发酵模式进行研究，采用奇异控制理论对补料发酵过程进行优化，并将多种发酵模式进行组合操作，提高透明质酸生产效率，为工业化生产打下基础；最后对S. zooepidemicus的代谢网络进行了分析，根据理论计算结果，采用营养增强型培养基，实现透明质酸的高效生产。具体内容如下 1
22、以兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus） H23为生产菌株，采用无血清、无BHI（心脑浸液）的种子培养基及较为简单的发酵培养基，进行菌体生长和透明质酸合成的摇瓶发酵条件研究。在此基础上，采用小型发酵罐进行S. zooepidemicus H23培养的研究，并对过程进行优化。通过对透明质酸发酵过程动力学进行分析，扩展功能单元理论，提出透明质酸分批发酵过程动力学数学模型，为补料培养及其优化控制提供理论基础。 2采用模拟体系，对透明质酸发酵过程的流变学行为进行研究，建立发酵过程流变学模型。在一定环境条件下，考察透明质酸浓度、控制条件对混合和传质的影响，从流变学角度探讨发
23、酵机制，为反应器设计选型提供依据。以流变学研究为基础，对溶氧和搅拌在透明质酸发酵生产中的作用进行细致的研究和分析，探讨氧的代谢途径及其影响透明质酸合成的作用机理，提出透明质酸发酵生产的搅拌溶氧控制策略。 3根据分批发酵动力学模型，对简单分批补料培养过程进行分析。采用奇异优化理论，以透明质酸最大产量为目标，对补料分批培养过程进行优化。采用不同的发酵模式对发酵生产透明质酸进行研究，并以最大生产强度为目标研究多种模式的组合操作的可行性，优化操作过程，为工业化生产打下了基础。 4采用代谢网络分析方法对S. zooepidemicus代谢网络通量进行研究，建立不同发酵条件下的代谢网络模型，确定代谢模型中
24、有关透明质酸合成的关键代谢节点的刚性，并对能量和还原力在代谢过程中的作用进行探讨。以代谢网络分析为基础，通过实验确定S. zooepidemicus H23合成透明质酸的关键因子，并采用营养增强型培养基培养S. zooepidemicus H23，减轻透明质酸合成途径的抑制，提高透明质酸产量和对底物的转化率。第二节 透明质酸摇瓶发酵条件的研究一、引言 荚膜是微生物在一定生长阶段合成的胞外覆盖物，以多糖为主要成分。1937年，Kendall等发现溶血性链球菌Streptococcus haemolyticus可以合成透明质酸并分泌到胞外形成荚膜，其后，又陆续有报道发现能合成透明质酸的微生物菌种。
25、许多链球菌都可以合成以透明质酸多糖为唯一成分的荚膜，使得链球菌（特别是对人体危害较小的C型）成为研究得最多的透明质酸生产菌，已报道的有多种溶血性链球菌（A型）、兽疫链球菌（C型）、马链球菌（C型）、粪马链球菌（C型）、缺乳链球菌（C型）以及鸡霍乱杆菌（C型）等。其中A型为人体致病菌，C型则只能感染畜类。许多年来虽然有不少学者研究发酵法生产透明质酸，并且在1983年，日本资生堂率先成功开发出工业化规模发酵生产透明质酸的方法，但由于其具有巨大的商业价值，除专利外，关于发酵法生产透明质酸的报道并不多。 微生物的培养条件，对其生长代谢有着重要的影响。适宜的环境条件不仅有利于菌体的生长，而且可以提高微生
26、物对底物的利用能力，使代谢朝向有利于产物合成的方向进行。由于Streptococcus zooepidemicus对营养要求极为苛刻，已有的报道都表明，对其进行培养需要以血清或BHI（Brain Heart Infusion）为培养基主要成分，特别是在种子培养阶段。为此，本节以一株能产透明质酸的Streptococcus zooepidemicus H23为研究菌株，首先对种子培养基组成进行了考察研究，得到了无血清种子培养基；以此为基础采用摇瓶发酵的方式，对培养条件（培养温度、供氧状况和培养基组成）进行了研究，得到了较好的透明质酸摇瓶发酵条件。二、种子培养基组成及培养条件对透明质酸发酵的影响
27、种子是进行发酵的基础，其品质的好坏对发酵生产起着关键的作用。生产中培养出的种子应是：（1）生长活力强，移至发酵罐后能迅速生长，延滞期短；（2）生理状态稳定；（3）生物量浓度能满足大容量发酵罐的要求。（一）种子培养基中氮源种类及浓度对透明质酸发酵的影响1氮源种类的确定 种子培养基中不同氮源对种子液中细胞生长及摇瓶发酵情况的影响见表6-2-1。种子液中细胞生长良好的，发酵培养时不一定能得到好的结果，表明细胞量多、但如果细胞合成透明质酸的能力并未处于较佳的状态，最终不会得到较高的透明质酸产量。采用无机氮源（NH4）2SO4作为种子培养基氮源，接入发酵培养基后透明质酸产量最低，可能是NH4+对菌体有着
28、一定的毒害作用，或者是培养基中缺少一定的生长因子，致使种子生长不好。采用复合有机氮源，接入发酵培养基后其透明质酸产量好于单一的有机氮源，可能是因为不同有机氮源提供的不同生长因子能够进行互补，利于细胞生长。在复合有机氮源中，牛肉膏和酵母粉各占氮源总量50%的种子培养基，接入发酵培养基后透明质酸产量最高；牛肉膏和蛋白胨各占氮源50%的其次；而蛋白胨和酵母粉各占氮源50%的，接入发酵培养基后其发酵结果与采用单一有机氮源的发酵结果几乎相同。表6-2-1 种子培养基中的不同氮源组成对透明质酸发酵结果的影响（1）氮源（种子）BE（20gL-1）PepYEBE（10gL-1）Pep（10gL-1）YE（10gL-1）（NH4）2SO4种子生物量 / gL-10.850.871.100.861.121.060.82发酵1.501.001.380.
