1、这一阶段以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。在此期间的主要进展包括：遗传信息传递中心法则的建立对蛋白质结构与功能的进一步认识DNA双螺旋发现的意义：确立了核酸作为信息分子的结构基础；提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式；从而最后确定了核酸是遗传的物质基础，为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了最重要的基础。Crick于1954年所提出的中心法则（Central Dogma ）：初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段（20世纪70年代后至今） 基因工程技术的出现作为标
2、志。其间的重大成就包括：重组DNA技术的建立和发展基因组研究的发展单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展基因表达调控机理细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域第三节 分子生物学的主要研究内容 一DNA重组技术（recombinant DNA technology）定义：又称为基因工程，根据分子生物学和遗传学的原理，将一种生物的遗传物质DNA转移到另一生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达出所需要的产物。DNA重组技术的应用：利用微生物基因工程生产重组基因工程药物、转基因植物和动物体细胞克隆、基因表达与调控的基础研究。二生物大分子的结构功能研究三基因组、功能基因组与生物信息学的研究基因组、蛋白质组与
3、生物信息学基因组（Genome）：细胞或生物体一条完整单体的全部染色体遗传物质的总和。人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）： 测定出人基因组全部DNA3109硷基对的序列、确定人类约5-10万个基因的一级结构 。蛋白组计划（Proteome project）:又称为后基因组计划或功能基因组计划，用于揭示并阐明细胞、组织乃至整个生物个体全部蛋白质及其功能。生物信息学（Bioinformatics）:是在生命科学的研究中，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。四基因表达调控研究第二章 染色体与DNA 本章内容1. 染色体2. DNA的结构3. DNA的
4、复制4. 原核生物和真核生物DNA复制特点5. DNA的修复6. DNA的转座第一节 染色体（chromosome）概念：染色体（chromosome）：原指真核生物细胞分裂中期具有一定形态特征的染色质。现在这一概念已扩大为包括原核生物及细胞器在内的基因载体的总称。染色质（chromatin）：由DNA和蛋白质构成，在分裂间期染色体结构疏松，称为染色质。其实染色质与染色体只是同一物质在不同细胞周期的表现。常染色质（euchromatin）：是进行活跃转录的部位，呈疏松的环状，电镜下表现为浅染，易被核酸酶在一些敏感的位点（hypersensitive sites）降解。异染色质（heteroch
5、romatin）：在间期核中处于凝缩状态，无转录活性，也叫非活动染色质（inactive chromatin），是遗传惰性区。在细胞周期中表现为晚复制，早凝缩，即异固缩现象（heteropycnosis）。原核细胞与真核细胞特征分析染色体特性：分子结构相对稳定能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性能够指导蛋白质的合成，从而控制整个生命过程能够产生可遗传的变异真核细胞染色体的组成 DNA 30%-40% 组蛋白（histone） 30%-40% 非组蛋白（NHP） 变化很大 少量RNA染色体中的蛋白质组蛋白（histone）：一类小的带有丰富正电荷（富含Lys、Arg）的核蛋白，与DNA有高亲和
6、力。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体。 组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3及H4。 非组蛋白（non-histone protein）：是染色体上与特异DNA序列结合的蛋白质，所以又称为序列特异性DNA结合蛋白。组蛋白具有如下特性：1、进化上的极端保守性。2、 无组织特异性。3、肽链上氨基酸分布的不对称性。4、组蛋白的修饰作用。5、富含赖氨酸的组蛋白H5。非组蛋白：非组蛋白大约占组蛋白总量的6070%，种类很多。（1）HMG蛋白（high mobility group protein） ，能与DNA结合（不牢固），也能与H1作用,或与DNA超螺旋结构有关。（2）DNA结合蛋白
7、：可能是一些与DNA的复制或转录有关的酶或调节物质。（3）A24非组蛋白 ：与H2A差不多，位于核小体内，功能不祥。非组蛋白的一般特性： 1.非组蛋白的多样性；非组蛋白的量大约是组蛋白的60%70%，但它的种类却很多，约在20-100种之间，其中常见的有15-20种。 2.非组蛋白的组织专一性和种属专一性。DNAC值：通常指一种生物单倍体基因组DNA的总量。C值反常现象：真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开，这就是著名的“C值反常现象”。染色体中的DNA根据DNA的动力学研究，真核细胞DNA可分为：高度重复序列：几百几万 co
8、py。如：卫星DNA和微卫星DNA。中度重复序列：10 几百 copy。各种rDNA、tDNA及组蛋白基因。低度重复序列：2 10 copy。血红蛋白。单拷贝序列：大多数编码蛋白质的结构基因和基因间间隔序列。只有一个拷贝。蛋清蛋白。染色体折叠核小体螺线管圆筒超螺旋（1）核小体 染色质纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。核小体（nucleosome）：DNA绕在组蛋白八聚体（H2A、H2B、H3、H4各一对）核心外1.8周（146bp），形成核小体核心颗粒。（2）螺线管10nm的染色质细丝盘绕成螺旋管状的30nm纤维粗丝，通称螺线管（solenoid）。螺线管的每一螺旋包含6个核小体，其压缩比
9、为6。这种螺线管是分裂间期染色质和分裂中期染色体的基本组分。（3）上述螺线管可进一步压缩形成超螺旋。由30nm螺线管缠绕而成一细长、中空的圆筒，直径为4 000nm，压缩比是40。（4）超螺旋进一步压缩1/5便成为染色体单体，总压缩比是76405，将近一万倍。原核生物基因组 特点：1、结构简练2、存在转录单元 多顺反子mRNA3、有重叠基因 Sanger1977在Nature上发表了X174 DNA的全部核苷酸序列，正式发现了重叠基因。第二节 DNA的结构一、DNA的一级结构 所谓DNA的一级结构，就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。基本特点DNA分子是由两条互相
10、平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧。两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。这就是嘌呤与嘧啶配对，而且腺嘌呤（A）只能与胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）只能与胞嘧啶（C）配对。2、DNA的二级结构DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。通常情况下，DNA的二级结构分两大类：一类是右手螺旋，如A-DNA和B-DNA；另一类是左手螺旋，即Z-DNA。3、DNA的高级结构 DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。超螺旋结构是DNA高级结构的主要形式，
11、可分为正超螺旋与负超螺旋两大类。DNA分子的超螺旋化可以用一个数学公式来表示：L=T+W其中L为连接数（linking number），是指环形DNA分子两条链间交叉的次数。只要不发生链的断裂，L是个常量。T为双螺旋的盘绕数（twisting number），W为超螺旋数（writhing number），它们是变量。23DNA的复制2.3.1 DNA的半保留复制机理2.3.2 复制的起点、方向和速度2.3.3 复制的几种主要方式一、DNA的复制1、DNA的半保留复制 每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，所以这种复制方式被称为DNA的半保留复制（semiconservat
12、ive replication）。DNA的这种半保留复制保证了DNA在代谢上的稳定性。2、复制的起点与方向 一般把生物体的复制单位称为复制子（replicon）。一个复制子只含一个复制起点。多复制子：DNA复制时，原核生物一般只有一个起始位点，而真核生物则有多个起始位点，因而在复制时呈现多复制泡，也称为多复制子。 DNA的复制主要是从固定的起始点以双向等速复制方式进行的（图2-18）。复制叉以DNA分子上某一特定顺序为起点，向两个方向等速生长前进。拓扑异构酶I：拓扑异构酶I解开负超螺旋，并与解链酶共同作用，在复制起点处解开双链。参与解链的除一组解链酶外，还有Dna蛋白等。DNA解链酶（DNA
13、helicase）：DNA解链酶能通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。单链结合蛋白（SSB蛋白）：SSB蛋白的作用是保证被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，它以四聚体形式存在于复制叉处，待单链复制后才掉下，重新循环。所以，SSB蛋白只保持单链的存在，并不能起解链的作用。3、DNA的半不连续复制 与冈崎片段DNA复制时，短时间内合成的约1000个核苷酸左右的小片段，称之为冈崎片段（Okazaki fragment）DNA复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段，然后再由连接酶连成大分子DNA。现在已知一般原核生物的冈崎片段要长些，真核生物中的要短些。进一步研究还证明，这种前导链的连
14、续复制和滞后链的不连续复制在生物界是有普遍性的，因而称之为双螺旋的半不连续复制。DNA链的延伸：DNA复制体（replisome）：在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶全酶分子、引发体和解链酶构成的类似核糖体大小的复合体，称为DNA复制体。4、滞后链的引发 DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA引物3 端开始合成新的DNA链。滞后链的引发过程往往由引发体（primosome）来完成。引发体由6种蛋白质n、n、n、Dna B、C和I共同组成，只有当引发前体（preprimosome）把这6种蛋白质合在一起并与引发酶（primase）进一步组
15、装后形成引发体，才能发挥其功效。5、链的终止 当复制叉前移，遇到20bp重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。6、复制的几种方式（1）环状DNA双链的复制：环状双链DNA的复制可分为型、滚环型和D-环型几种类型。（a） 型 复制的起始点涉及到DNA双链的解旋和松开，形成两个方向相反的复制叉 。前导链DNA开始复制前，复制原点的核酸序列被转录生成短RNA链，作为起始DNA复制的引物。（b） 滚环型（rolling circle） 这是单向复制的特殊方式。如X174的双链环状D
16、NA复制型（RF）就是以这种方式复制的。DNA的合成由对正链原点的专一性切割开始，所形成的自由5 端被从双链环中置换出来并为单链DNA结合蛋白所覆盖，使其3OH端在DNA聚合酶的作用下不断延伸。在这个过程中，单链尾巴的延伸与双链DNA的绕轴旋转同步 。（c） D-环型（D-loop） 这也是一种单向复制的特殊方式。这种方式首先在动物线粒体DNA的复制中被发现。双链环在固定点解开进行复制。但两条链的合成是高度不对称的，一条链上迅速合成出互补链，另一条链则成为游离的单链环（即D-环）。（2）线性DNA双链的复制 线性DNA复制中RNA引物被切除后，留下5端部分单链DNA，不能为DNA聚合酶所作用，
17、使子链短于母链。T4和T7噬菌体DNA通过其末端的简并性使不同链的3端因互补而结合，其缺口被聚合酶作用填满，再经DNA连接酶作用生成二联体。这个过程可重复进行直到生成原长20多倍的多联体，并由噬菌体DNA编码的核酸酶特异切割形成单位长度的DNA分子。二、原核和真核生物DNA的复制特点1、原核生物DNA的复制特点大肠杆菌DNA聚合酶I、II和III的性质比较原核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶：有35外切酶活性和53外切酶活性。保证DNA复制的准确性。DNA聚合酶 ：活性低，其35核酸外切酶活性可起校正作用。主要起修复DNA的作用。DNA聚合酶：7种亚单位9个亚基。只具35外切酶活性，主导聚合酶。
18、Klenow fragment：用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶，获得两个片段，大片段分子量76000U，称为Klenow 片段。它保留着聚合酶和35外切酶的活性，广泛使用于DNA序列分析中。三、真核生物DNA的复制特点真核生物DNA复制的起始需要起始原点识别复合物（ORC）参与。真核生物DNA复制叉的移动速度大约只有50bp秒，还不到大肠杆菌的120。真核生物的染色体在全部完成复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始。真核生物DNA聚合酶的特性比较2.4.3 DNA复制的调控原核细胞DNA的复制调控：复制叉的多少决定了复制频率的高低。真核细胞DNA的复制调控： 1.细胞生活周期水
19、平调控 2.染色体水平调控 3.复制子水平调控真核和原核生物DNA复制的比较相同： 1.半保留复制 2.都有引发、延长、终止三个阶段 3.都必须有相应功能的蛋白质和DNA聚合酶参与区别：1.真：多个复制起始点；原：一个复制起始点2.真：所有复制受一种调控；一个复制子上有多个复制叉2.5 DNA的修复DNA修复系统 功能错配修复 恢复错配碱基切除修复 切除突变的碱基核苷酸切除修复 修复被破坏的DNADNA直接修复 修复嘧啶二体或甲基化DNA2.6 DNA的转座2.6.1 转座子的分类和结构特征2.6.2 转座作用的机制2.6.3 转座作用的遗传学效应2.6.4 真核生物中的转座子移动基因（Mov
20、able gene）：又称为转位因子（Transposable elements），是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。由于它可以从染色体基因组上的一个位置转移到另一位置，甚至在不同染色体之间跃迁，因此有时也称为跳跃基因（Jumping gene）。原核生物的转座因子可分为：插入序列（insertion sequence，IS）：最简单的不含有任何宿主基因的转位因子。片段长度7002500bp。复合转座子（transposon，Tn）：是一类携带某些与转座无关的抗性基因（或其它宿主基因）的转座子。分子量2000bp。转座噬菌体（Mu，D108）：具有转座功能的一类可引起突变的溶源
21、性噬菌体。插入序列的结构特点：1.在IS两端含有长度为1040bp反向重叠序列2.含有一个编码转座酶的长编码区。3.插入时在DNA位点产生一个短的（39bp）正向重复序列。复合转座子的结构特点： 1.两翼为两个相同或相似的IS序列。 2.中部为某种抗性基因。 3.IS序列一般不能单独移动。Conclusiona） 转座过程是由Donor 提供Tn copy到 target site， 涉及酶切、复制、重组的遗传学过程。b） 转座完成后，在Tn的两端出现target site序列的正向重复，其长度取决于staggered cutting的长度。c） 转座因子的 IR 序列是转座酶的重要识别位点，
22、与转座，切除有关d） Cointegrater 是转座过程的中间体 （具有两个 Tn 和两个 replicon）, 其稳定性依 Tn不同而异，或 resolution 完成转座过程.e） Cointegrater 可能导致 Tn 和抗性的积累。 转座作用的遗传学效应1. 诱变效应 （提高重组频率、形成易变基因）2. 切除效应 （倒位、缺失、重复、footprinting）3. 双转座效应（外显子改组 exon shuffling ）4. 位置效应（启动表达、增强表达）5. 转座爆炸（激活表达、基因内重排突变基因形成）转位作用的机制：靶序列的复制。转位作用的遗传学效应：引起插入突变；产生新基因；
23、产生染色体畸变；引起生物进化。转座因子的应用：利用转座子分离、克隆基因；利用Tn进行基因定位；作为基因转移载体。真核生物中的转座子1、玉米中的控制因子自主性因子：具有自主剪接和转座的功能；非自主性因子：单独存在时是稳定的，不能转座，当基因组中存在与非自主性因子同家族的自主性因子时，它才具备转座功能，成为与自主性因子相同的转座子。AcDs体系、Spm, En转座子。2、果蝇中的转座子 Copia类、P转座子等。本章重点 染色体及DNA结构 DNA复制习题1.DNA以半保留方式进行复制,若一完全被标记的DNA分子,置于无放射标记的溶液中复制两代,所产生的4个DNA分子中放射性状况如何A.两个分子有
24、放射性,两个分子无放射性 B.均有放射性C.两条链中的半条具有放射性 D.两条链中的一条具有放射性 E.均无放射性2.DNA复制时哪种酶不需要A.DNA指导的DNA聚合酶 B.DNA指导的RNA聚合酶 C.连接酶 D.RNA指导的DNA聚合酶 E.拓扑异构酶3.原核生物的DNA聚合酶A.DNA聚合酶有7种、9个亚单位 B.DNA聚合酶有最强的外切核酸酶的活性 C.DNA聚合酶是真正的起复制作用的酶D.催化过程产生的焦磷酸是主要底物 E.用4种脱氧核苷作底物 生物信息的传递（上）从DNA到RNA基因表达：是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。转录（transcription）：
25、以DNA为模板，按照碱基互补原则合成一条单链RNA，从而将DNA中的遗传信息转移到RNA中去的过程称为转录。编码链（coding strand）=有意义链模板链（template strand）=反义链不对称转录（asymmetric transcription）：转录仅发生在DNA的一条链上。启动子（promoter）：是DNA转录起始信号的一段序列，它能指导全酶与模板正确的结合，并活化酶使之具有起始特异性转录形式。终止子（terminator）：转录终止的信号，其作用是在DNA模板特异位置处终止RNA的合成。转录单位：DNA链上从启动子直到终止子为止的长度称为一个转录单位。3.1 RNA的
26、转录转录的基本过程都包括：模板识别、转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止。1、模板识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。转录起始前，启动子附近的DNA双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。2、转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。3、转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段，通过启动子的时间越短，该基因转录起始的频率越高。4、RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的延伸。5、当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，这就是转录的终止。3.1.1 转录的基本过程RNA合成的基本特点：1.底物是：ATP、GTP、CTP、UTP2.在聚合酶作用下形成磷酸酯键3.RNA的碱基顺序由DNA的顺序决定4.仅以一条DNA链作为模板5.合成方向为536.合成中不需要引物3.1.2 转录机器的主要成分亚基基因 相对分子量亚基数组分功能rpoA3.6510 42核心酶 核心酶组装，启动子识别rpoB 1.5110 51和共同形成RNA合成的活性中心rpoC 1.55
