1、整理代谢途径总结一、我国工业生物技术发展面临的主要问题我国是生物制造大国 我国不是生物制造强国工业生产菌种的知识产权保护体系尚未建立具体问题：工业生产菌种的技术水平较差 产品浓度低，造成能耗高、废水排放量大具体问题：发酵工艺落后二、代谢途径工程的研究内容1 工业微生物基因组测序与功能基因组分析2 微生物基因组规模代谢网络重构与模型量化分析3 工业微生物基因组的理性设计4 基因组多位点快速进化5 基因组规模的全局扰动6 基因组删减优化(最小基因组)7 人工合成基因组8 大规模生化反应的胞外重构三、代谢途径工程的发展历史代谢工程的最早实例(1974) 1974年，Chakrabarty在假单孢菌P
2、. putide和P. aeruginosa中分别引入几个稳定的重组质粒，增加了两者对樟脑和萘的降解催化活性。这是代谢工程的第一个应用实例，标志着代谢工程作为一门学科的诞生。代谢工程作为一个专门学科的出现(1991)早期代谢工程最为成功的实例(1992) 代谢工程发展-19961996年在美国召开了第一届代谢工程大会，美国Mendes教授和Kel教授在大会上做了题为“代谢工程让细胞为人类工作”的报告，进一步确立了代谢工程的地位与研究方向。反向代谢工程1996先用诱变等手段改变某个表型，再根据导致这个表型变化的基因，进一步强化目标表型。是现代基于系统生物学的代谢途径工程思想的来源。代谢工程发展-
3、1998 代谢工程发展-1999 进化代谢工程2001利用适应性进化(Adaptive Evolution)有效提高微生物发酵生产速率、产率和终浓度的技术。系统代谢工程2005传统代谢工程只是对局部的代谢网络进行分析以及对局部的代谢途径进行改造。由于没有从全局的角度去分析改造细胞, 所以具有很大的局限性。高通量组学分析技术和基因组水平代谢网络模型构建等系统生物学技术能够从系统水平上分析细胞的代谢功能。将这些系统生物学技术和传统代谢工程以及下游发酵工艺优化相互结合, 进一步提出系统代谢工程的概念。合成生物学2008合成生物学是以工程学理论为依据，设计和合成新的生物元件, 或是设计改造已经存在的生
4、物系统。这些设计和合成的核心元件(如酶、基因电路、代谢途径等)具有特定的操作标准；小分子生物元件可以组装成大的整合系统, 从而解决各种特殊问题。四、代谢途径工程技术近期发展趋势传统代谢工程技术日趋成熟 大量传统工业微生物的代谢工程升级：传统工业微生物向少数工业微生物的聚集：非微生物合成的产物改由微生物生产改造的复杂性和设计的精确性：复杂代谢工程已成为重要的技术发展趋势系统生物学飞速发展促进生物体设计改造日渐成熟 合成生物学的发展促进生物模块的标准化 对DNA操作能力的进化：量变-质变1. 系统生物学与工业生物技术组学技术(X-omics)超快基因组测序技术基于基因芯片的转录组学分析基于二维电泳
5、和MALDI-TOF的蛋白质组学技术基于色谱分离和质谱鉴定技术的代谢物组学基于同位素技术的代谢通量组学系统生物学与工业生物技术2. 合成生物学与工业生物技术End代谢途径工程(Metabolic Pathway Engineering)第二章 细胞代谢的生物化学基础本章主要内容一. 工业生物技术中亟待解决的技术问题二. 微生物合成特定产物的生物化学基础三. 微生物的初级代谢四. 微生物的次级代谢(略)五. 非微生物来源天然产物的合成代谢一. 工业生物技术中亟待解决的技术问题1 目标产物产量的进一步提高高产量2 副产物含量的降低/消除高转化率3 尽可能短的时间内完成发酵过程高生产强度4 异源蛋白
6、的高效合成与理性修饰5 合成微生物原来不能合成的物质5 合成微生物原来不来合成的物质6 扩展底物利用范围非常规底物的耐受性问题高分子量底物的分解(蛋白质、多糖、脂类)底物的修饰磷酸化过程吸收过程所需转运蛋白降解所需要的转运蛋白降解中间产物的耐受性问题高效降解所需的额外能量供给非常规底物降解的辅因子/氧化还原平衡问题7 对极端环境的耐受性更酸/更碱对于有机酸而言，更低的最适发酵pH值，意味着更少的中和剂的添加和产物分离过程中更少的强酸的消耗；对于碱性条件下稳定的产物(各种pKa偏碱性的蛋白，生物碱等)而言，更碱的pH值意味着更稳定的发酵产量。8 对极端环境的耐受性更高/更低温度更高的发酵温度意味
7、着更少的冷却水消耗；更低的贮藏温度耐受性，意味着更长的贮藏周期(乳酸菌、芽孢杆菌等活菌制剂)。9 对极端环境的耐受性高浓度有机溶剂高浓度有机溶剂可以破坏细胞膜组分，从而造成细胞的死亡。对高浓度有机溶剂的耐受，可以显著提高微生物积累丙酮、丁醇等有机溶剂的效率和最终产量。二. 微生物合成特定产物的生物化学基础1. 细胞组分细胞生长的表征方法测定总细胞体积测定细胞数(OD)测定细胞干重测定细胞湿重测定细胞有机物干重2. 大分子底物的降解3. 底物/产物的运输过程细胞膜的功能1. 选择性透过作用转运方式 (1) 离子通道介导的被动运输过程(2) 载体介导的氢离子共转运(3) 载体-受体介导的氢离子共转
8、运(4) 基本的主动运输(底物吸收)(5) 基团转位能量耦合系统浓度梯度质子电动势ATP结合盒(ATP Binding Cassette)转运蛋白光吸收驱动底物水平磷酸化细胞膜的功能2. 离子稳定作用细胞膜的功能3. 代谢过程支撑作用细胞膜的功能4. 微生物相互作用过程识别细胞膜的功能5. 信号转导过程的第一环节三. 微生物的初级代谢基本概念微生物在生长发育和繁殖过程中，需要不断地从外界环境中摄取营养物质，在体内经过一系列的生化反应，转变成能量和构成细胞的物质，并排出不需要的产物。这一系列的生化过程称为新陈代谢。微生物的代谢(metabolism)是指发生在微生物细胞中的分解代谢(catabo
9、lism)与合成代谢(anabolism)的总和。 新陈代谢包括分解代谢和合成代谢初级代谢和次级代谢物质代谢和能量代谢（能量代谢包括产能代谢和耗能代谢）基本概念合成代谢（Anabolism)：指细胞（酶）利用简单的小分子物质合成复杂大分子的过程，这个过程要消耗能量。合成代谢所利用的小分子物质，来源于分解代谢过程中产生的中间产物或环境中的小分子营养物质。分解代谢（catabolism）：指细胞（酶）将大分子物质降解成小分子物质，并在这个过程中产生能量。分为三个阶段将蛋白质、多糖及脂类等大分子营养物质降解成氨基酸、单糖及脂肪酸等小分子物质将第一阶段产物劲一步分解成为更简单的乙酰辅酶A、丙酮酸以及能
10、进入三羧酸循环的某些中间产物，产生一些ATP、NADH及FADH2通过三羧酸循环将第二阶段产物完全降解成CO2,并产生ATP、NADH及FADH2第二和第三阶段产生的通过电子传递链被氧化，产生大量的ATP分解代谢和合成代谢关系分解代谢为合成代谢提供能量和原料；合成代谢是分解代谢的基础在代谢过程中，微生物通过分解作用产生化学能，光合微生物还可将光能转化成化学能，这些能量用于：1.合成代谢；2.微生物的运动和运输；3.热和光。无论是分解代谢还是合成代谢，代谢途径都是由一系列连续的酶反应构成的，前一部反应的产物是后续反应的底物。细胞能有效调节相关的酶促反应，使生命活动得以正常进行。某些微生物在代谢过
11、程中，除产生其生命活动所必需的初级代谢产物和能量外，还会产生一些次级代谢产物。这些物质除有利于微生物生存，还与人类生产生活密切相关。基本概念初级代谢：(primary metabolite )一般指具有明确的生理功能，对维持生命活动不可缺少的物质代谢过程。次级代谢 ：(secondary metabolite )指没有明确生理功能，似乎并不是维持生命活动所必需的物质代谢过程。微生物代谢的特点 由于微生物“比表面积”巨大，因而代谢速率极快；由于种类繁多，因而代谢类型（途径）极其多样；代谢的严格的调节和灵活性1. 微生物分类微生物分类按DNA及核糖体RNA原核生物古细菌真核生物按能量来源光能营养型
12、(光合作用)化能营养型(化学反应)微生物分类按利用的碳源自养型微生物异养性微生物按利用氧的能力严格好氧菌兼性好氧菌耐氧厌氧菌严格厌氧菌2. 物质代谢概述代谢代谢(metabolism)是细胞内发生的各种化学反应的总称，它主要由分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabolism)两个过程组成。分解代谢：将大分子物质降解成小分子物质的过程合成代谢：将简单的小分子物质合成复杂大分子的过程分解代谢的作用提供前体化合物提供细胞代谢活动所需的能量生长：细胞结构物质合成产物合成维持：物质运输、运动、亚细胞结构形成、大分子周转等提供还原力NADHNADPH合成代谢由前体化合物合成大分子单体由前体化
13、合物合成产物由单体形成大分子化合物蛋白核酸多糖脂肪分解代谢的三个阶段第一阶段：将蛋白质、多糖及脂类等大分子营养物质降解成为氨基酸、单糖及脂肪酸等小分子物质；第二阶段：将第一阶段产物进一步降解成更为简单的乙酰辅酶A、丙酮酸以及能进入三羧酸循环的某些中间产物，在这个阶段会产生一些ATP、NADH及FADH2；第三阶段：通过三羧酸循环将第二阶段产物完全降解生成CO2，并产生ATP、NADH及FADH2。第二和第三阶段产生的ATP、NADH及FADH2通过电子传递链被氧化，可产生大量的ATP。化能异氧微生物的生物氧化和产能形式：与氧结合，脱氢，失去电子过程：脱氢（电子），递氢，受氢功能：产能(ATP)
14、，产还原力(H)，产小分子中间代谢物类型：发酵，有氧呼吸，无氧呼吸3. 中心代谢途径EMP途径受到严格的调控转录水平的调控(操纵子、转录起始区域的抑制)反馈抑制酶别构抑制胞内辅因子水平(ADP/ATP、NAD/NADH)碳代谢物阻遏效应氮源相关的调控饥饿状态的恢复情况其他限制性底物的供给HMP途径即单磷酸己糖途径(Hexose Monophosphate Pathway)，也称戊糖磷酸途径(Pentose Phosphate Pathway)。分为氧化阶段和非氧化阶段功能：提供还原力(NADPH)提供前体化合物核糖磷酸(包括5-磷酸核糖-1-焦磷酸, PRPP)磷酸赤藓糖HMP途径Glucos
15、e 6-phosphate + 2 NADP+ + H2O ribulose 5-phosphate + 2 NADPH + 2 H+ + CO2ED途径ED途径(Entner-Douderoff pathway )，亦称为KDPG 途径 (2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate pathway)ED 途径是 HMP 途径的 6-P-GA处的分支途径，它有两个特殊的酶， 6-P-GA脱水酶 和 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(KDPG醛缩酶)，因此 ED途径又叫KDPG 途径。在大多数假单胞菌中，ED 途径可能是葡萄糖降解的主要代谢途径。发酵运动单胞菌是目
16、前所知的唯一能在厌氧条件下使用 ED 途径的微生物。PK途径(Phosphoketolase Pathway)PK途径也是从单磷酸己糖6-P-GA开始降解的，经历 HMP 途径氧化部分的反应，生成 Xu-5-P后，被特有的酶裂解为 3C 化合物 ( GA-3-P ) 和 2C化合物(乙酰磷酸，高能磷酸化合物)。 这个特有的酶叫做磷酸酮解酶( phosphoketolase ) , 因为有这个酶而把这条单磷酸己糖途径命名为磷酸酮解酶途径，简称PK途径。 HPK途径(Hexose phosphoketolase)PK途径不同于以上已介绍的可兼用于需氧和厌氧条件下降解的途径，微生物在厌氧条件下借助P
17、K途径不但可以利用葡萄糖，而且可以利用D-核糖，D-木糖和L-阿拉伯糖。这 3 种糖首先各自转化成 Xu-5-P，然后经 PK途径降解成 PYR 和 Ac-P(高能磷酸化合物乙酰磷酸)。葡萄糖经PK途径降解成PYR 时所生成的ATP的量只有经EMP途径的一半。在双歧杆菌和木醋杆菌中发现了另一条磷酸酮解酶途径，在这条途径中磷酸酮解酶以单磷酸己糖 F-6-P为底物，将 F-6-P 裂解为4-磷酸赤藓糖 ( E-4-P)和Ac-P，因此这个磷酸酮解酶实际上是磷酸己糖酮解酶 (hexose phosphoketolase)。 因这个酶而把这条磷酸酮解酶途径命名为磷酸己糖酮解酶途径，简称为HPK途径。
18、HPK途径的意义 如果一种微生物没有二磷酸果糖醛缩酶(EMP途径)，没有6-磷酸葡萄糖脱氢酶(HMP途径、ED途径、PK途径)，那么这种微生物就不能用以上途径来降解葡萄糖；若要在厌氧条件下降解葡萄糖，则需用 HPK 途径。如果这种微生物中还存在 HMP 途径非氧化阶段的转酮-转醛酶系统的话，那么这条途径的中间产物 F-6-P 和 E-4-P 逆向运行可生成各种磷酸戊糖( 包括C5P、C5P和C5”P)。葡萄糖直接氧化途径 以上四种途径(EMP、HMP、ED 、PK / HPK途径)的第一步均是在已糖激酶的催化下首先把葡萄糖激活成 G-6-P ，然后，才开始降解；而有些微生物如假单胞菌属和气杆菌
19、属的某些种的细菌没有已糖激酶，只好用变通的办法：首先把葡萄糖直接氧化成葡萄糖酸，后者在葡萄糖酸激酶的催化下，把葡萄糖激活成生成 6-P-GA，形成葡萄糖直接氧化途径。葡萄糖直接氧化途径在有分子氧存在的情况下运行。葡萄糖直接氧化途径 曲霉和青霉的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的氧化脱氢反应，这个酶是以FAD为辅基的黄素蛋白。葡萄糖脱氢生成葡萄糖酸内酯 ( GL )，同时FAD被还原成FADH2 ，后者直接 ( 不经过电子传递链)被分子氧再生；同时生成 H2O2 ，然后 H2O2 被触酶分解。这样的黄素蛋白水平的呼吸并不能为细胞提供代谢能。5. 能量代谢发酵 VS. 发酵代谢类型：发酵指微生物细胞将有机物
20、氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物。有机物部分氧化，释放出一小部分能量。1. 发酵途径发酵的种类有很多，可发酵的底物有糖类、有机酸、氨基酸等，其中以微生物发酵葡萄糖最为重要。生物体内葡萄糖被降解成丙酮酸的过程称为糖酵解，主要分为四种：EMP途径、HMP途径、ED途径、PK途径。2.发酵类型 在糖酵解过程中生成的丙酮酸可被进一步代谢。在无氧条件下，不同的微生物分解丙酮酸后会积累不同的代谢产物。根据发酵产物不同，发酵的类型主要有乙醇发酵、乳酸发酵、丙酮丁醇发酵、混合酸发酵等。呼吸 呼吸是微生物中最普遍和最重要的生物氧化方式和主要的产能方式。
21、 呼吸是指微生物在降解底物的过程中，将释放出的电子交给NAD(P)、FAD或FMN等电子载体，再经电子传递系统传给外源电子受体，从而生成水或其他还原型产物并释放出较多能量的过程。其中，以分子氧作为最终电子受体的呼吸称为有氧呼吸，以氧以外的其他氧化型化合物作为最终电子受体的呼吸称为无氧呼吸。 呼吸与发酵的根本区别在于：电子载体不是将电子直接传递给底物降解的中间产物，而是交给电子传递系统，逐步释放出能量后再交给最终电子受体。1) 有氧呼吸(Respiration)最普遍、最重要的生物氧化或产能方式除糖酵解过程外，还包括三羧酸循环和电子传递链两部分反应。在发酵过程中，葡萄糖经过糖酵解作用形成的丙酮酸
22、在厌氧条件下转变成不同的发酵产物，而在有氧呼吸过程中，丙酮酸进入三羧酸循环（TCA）被彻底氧化成水和CO2，同时释放出大量能量。产能量多，一分子葡萄糖净产38个ATP。有氧呼吸底物脱下的氢经过完整的呼吸链(电子传递链，Electron Transfer ChainETC)传递,最终被外源分子氧接受，产生水并释放出ATP形式的能量电子传递系统ATP的生成胞内电子载体电子载体的种类黄素蛋白泛醌硫铁蛋白细胞色素NAD(P)(H)线粒体中电子载体的作用方式电子传递系统是一系列氢和电子传递体组成的多酶氧化还原体系电子传递系统的功能电子供体接受电子并将电子传递给电子受体通过合成ATP保存电子传递过程中释放
23、的部分能量真核生物线粒体内膜上的呼吸链四. 微生物的次级代谢(略)五. 非微生物来源天然产物的合成代谢1. 萜类化合物萜类由甲戊二羟酸（mevalonic acid, MVA）衍生、且分子式符合(C5H8)n通式化合物及其衍生物均称为萜类化合物。特点：骨架庞杂、种类繁多、数量巨大、结构千变万化、生物活性广泛。化学结构特点：大多具有异戊二烯结构片断，其骨架以5个碳为基本单位。分类与分布萜类的生物合成首先由乙酰CoA与乙酰乙酰CoA生成甲戊二羟酸单酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA, HMG-CoA)，后者还原生成甲戊二羟酸(MVA)。MVA经数步反应转化成焦磷
24、酸异戊烯酯(3-isopentenyl pyrophosphate, IPP)，IPP经硫氢酶(sulphyhydryl酶)及焦磷酸异戊酯异构酶 (IPP isomerase) 转化为焦磷酸r, r二甲基烯丙酯(r, r-dimethyl烯丙基pyrophosphate，DAPP)。IPP和DAPP称“活性异戊二烯”，是萜类成分在生物体形成的真正前体，在生物合成中起着烷基化的作用。IPP和DAPP两者均可转化为半萜，并在酶的作用下，头尾相接缩合为焦磷酸香叶酯(geranyl pyrophosphate, GPP)，衍生为单萜类化合物，或继续与IPP分子缩合衍生为其它萜类物质。2. 黄酮类化合物
25、黄酮类化合物黄酮是一类重要的天然色素，也是中药中一类重要的有效成分。分布广泛，多分布于高等植物中，集中在被子植物。以唇形科、玄参科、爵麻科、菊科等存在较多。常以游离态或与糖结合成苷的形式存在。在花、叶、果中多为苷；在木质部多为苷元，生理活性多种多样，作用强，毒性不大。以前，黄酮类化合物(flavonoids)主要是指基本母核为2-苯基色原酮(2-phenyl-chromone)类化合物，现在则是泛指两个苯环（A-与B-环）通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物。黄酮类化合物的生物合成途径 生物合成研究表明A环来自于三个丙二酰辅酶A，B环来自于桂皮酰辅酶A。3. 生物碱类化合物化学结构分类一、
26、有机胺类生物碱氮原子不结合在环状结构内，此类生物碱数目不多二、氮杂环类生物碱氮原子结合在环状结构内。其中大多为五元、六元氮杂环衍生物五元氮杂环类生物碱：基本结构为吡咯和四氢吡咯六元氮杂环类生物碱：基本结构为吡啶和六氢吡啶（哌啶）。此类生物碱衍生物数量较多其他结构类型生物碱4. 苯丙素类天然产物End代谢途径工程(Metabolic Pathway Engineering)第三章 代谢途径的调控机制本章主要内容一. 原核生物基因表达的调控策略二. 真核生物基因表达的调控策略三. 酶水平的调控四. 全局调控策略五. 调控过程的优化策略六. 代谢途径调控方法基因工程策略一. 原核生物基因表达调控第一
27、节 转录水平的调控第二节 操纵子的其他调控形式第三节 转录的终止调控第四节 RNA聚合酶转录起始第五节 DNA重排对转录起始的调控第六节 翻译的调控第一节 转录水平的调控RNA聚合酶结合在启动子上一.操纵子模型1. 调节基因和结构基因的基本概念 操作子(operon)：原核细胞中由操纵区同一个和几个结构基因 联合起来协同活动的整体 顺式作用元件(cis-acting element)：位于基因旁侧序列中能影 响基因表达的序列 反式作用因子(trans-acting factor)：能直接或者间接地识别或 结合在顺式作用云间核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋 白质 结构基因(structura
28、l genes)：决定某一种蛋白质或RNA分子结 构的一段DNA 调节基因(regulator genes):调节蛋白质合成的基因 一. 操纵子模型2. 正调控和负调控 正调控：阻遏蛋白从操纵基因上脱离后，激活蛋白与启 动子结合以及和RNA聚合酶的相互作用，帮助结构基因 的转录起始，促进相应蛋白的合成 负调控：阻遏蛋白与操纵基因的结合，阻止了RNA聚合 酶对操纵子结构基因的转录 诱导物：有阻遏作用的代谢产物二. 乳糖操纵子1.调控位点 操作子(operator) CAP或cAMP受体蛋白结合位点 启动子(promoter)二. 乳糖操纵子2. 在乳糖操纵子上阻遏物结合区的RNA聚合酶结合区的重
29、叠3. 诱导物的加入和去除去对Lac mRNA的影响二. 乳糖操纵子4. 诱导物和阻遏物成为调节操纵子的开关(左图)5. 当无诱导物时阻遏物结合在操作基因上(右图)二. 乳糖操纵子6. 阻遏蛋白和诱导物的相互作用 操作基因发生组成性突变，操纵子组成性表达(左图) Lac I 发生突变，操纵子组成性表达(右图)二. 乳糖操纵子Lac I基因组成性隐形诱变剂(左图)非诱导性Lacs诱变子的优势(右图)二. 乳糖操纵子7. 阻遏蛋白和操纵基因的结合与解离阻遏蛋白的单体结构操纵位点的回文序列二. 乳糖操纵子 阻遏作用发生位点CAP结合位点 CAP结合位点的保守序列(左图) CAP蛋白可结合相对于启动子的不同位点(右图)二. 乳糖操纵子CAP作用方式二. 乳糖操纵子1. 诱导物的结合解离模型(左图)2. 诱导物和阻遏蛋白结合的模型(右图)葡萄糖和半乳糖对lac启动子的联合作用第二节 操纵子的其它调控形式第三节 转录的终止调控终止调控概念前导序列(leader sequence)：位于翻译起始密码子AUG之前的一段不参与翻译的mRNA5端的核苷酸片段衰减子(attenuator)：位于细菌操纵子上游的一段核苷酸序列衰减作用(attenuation)：原核生物中通
