1、8、生物安全柜和超净工作台的区别超净工作台：保护样品，不保护操作者和环境 生物安全柜：保护操作者、环境以及实验材料正压、简单 负压、复杂不能以净化工作台代替生物安全柜，反之则可以。9.标准的细菌等微生物操作要求实验室负责人.工作人员洗手、工作区域不允许吃/喝/抽 .戴护目镜或面罩、食物储存禁止口吸吸管、减少飞溅物/气溶胶、工作台表面的去污/灭活、废物去污后处理10、注：高压蒸汽灭菌：负责消毒者不准离开消毒室。制备培养基. 无菌操作.、使用酒精灯、灭菌吸管.10倍递增稀释.无菌操作；三三制：稀释三级，每一稀释度用三个平行平板；取供试液加注于平皿时，供试液须充分混匀。培养基倾注于平皿：451、整个
2、操作过程应在lh内完成、无菌检验.第二章、细菌学检验基本技术临床样本的采集与送检样本采样时间 采样方法 注意事项 血骨髓 发病早期、急性期或症状典型时 成人10ml，儿童35ml；骨髓12ml。样本切勿冰箱存放；无菌操作；废弃物高压灭菌。尿液 晨起 中段尿 防杂菌污染，无菌操作。尽快送检，不得加防腐剂或消毒剂。粪便 急性期 脓血、黏液的粪便；絮状物；直肠拭子 无菌采样；新鲜；立即送检 。痰上呼吸道样本 晨间 无限制 自然咳痰、支气管镜、胃内采痰法等；鼻咽拭子 漱口；立即送检或4保存。1、食品样本采集原则根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案。随机采样代表性无菌操
3、作，防污染。（外源性污染、样本变质和细菌生长）食物中毒时，采集可疑食物样本。2、食品样本采集种类大样、中样、小样。大样：一整批样本。中样：从样本各部分所取得的混合样本，一般为200g。小样：分析用，检样，25g。注：检验结果报告后，剩余样品或同批样品不进行微生物项目的复检3、细菌的形态结构检查法借助显微镜，对细菌形态、大小、排列、结构进行直接观察。在细菌检验中极其重要，是细菌分类和鉴定不可缺少的组成部分。样本中有无细菌及其大致的数量。细菌的形态、大小、排列、结构和染色反应性。培养物是否为纯种。普通光学显微镜 （0.2m 10000.2mm）细菌染色样本；弱光下用于不染色样本活菌的运动情况 暗视
4、野显微镜 （0.04m：50倍 ）不染色样本活菌的形态 相差显微镜 ：活体细胞的外形和运动方式；细胞内部某些细微结构及这些结构的数量4、不染色检查：主要用于观察细菌的动力有鞭毛的细菌为真正运动无鞭毛的细菌则为布朗运动（即分子运动）染色检查细菌染色显微镜观察。常用的细菌染料：人工合成带苯环的染料，色基+助色基单纯染料：苏丹染料 酸性染料：伊红、酸性品红、刚果红等碱性染料：美蓝、孔雀绿、甲紫和碱性复红等 复合染料：姬姆萨染料、瑞氏染料等5、单染色法：用一种染料染色，使各种细菌均染成同一颜色。操作简单，易于使用。只能显示细菌的形态及大小。如用美蓝或稀释石炭酸复红等6、复染色法：用两种以上染料染色细菌
5、，显示细菌形态大小，鉴别细菌种类鉴别染色法:革兰染色法 、抗酸染色法 Grams染色操作步骤 ：初染、媒染、脱色、复染抗酸染色法：抗酸菌：分枝杆菌/分枝菌酸 。一般不易着色，一旦染上色后又不易被盐酸酒精脱色。经过加热和延长染色时间来促使抗酸菌着色。 步骤：初染、脱色、复染7、负染色法：背景着色而细菌本身不着色。细菌荚膜常用墨汁负染色法配合单染色法（如美蓝），背景呈黑色，菌体染成蓝色，荚膜不着色，包绕在菌体周围成为一层透明的空圈。该法具有快速、经济、简便易行、高度反差、分辨率高的特点。8、培养基的种类按物理性状分液体培养基：增菌、作生化试验等半固体培养基：观察细菌的动力、分类鉴定、保存菌种及噬菌
6、体效价滴定等。琼脂用量为0.5%1%固体培养基：主要用于分离培养；平板、斜面、高层及高层斜面；琼脂用量为1.5%2%9、培养基的种类按用途分 基础培养基（basic medium）营养培养基（nutrient medium） 增菌培养基（enrichment medium）选择性培养基（selective medium） 鉴别培养基（differential medium）专用培养基（dedicated medium）10、增菌培养基：多为液体。 目的菌，杂菌。营养成分抑制物质 选择性增菌培养基；非选择性增菌培养基7.5%NaCl肉汤：金葡増菌11、鉴别培养基：几种细菌由于对培养基中某一成分的
7、分解能力不同，其菌落的生长特征（颜色、形状等）不同而被区分开。某些特定的化学物质鉴别和区分不同细菌12、制备培养基的一般程序调配溶化；矫正pH；过滤澄清；分装；灭菌；检定 13、平板划线接种法 平板划线接种法是常用的细菌分离培养方法。使样本或培养物中混杂的多种细菌分开成长为单个菌落，并根据菌落的形态和特征，挑选所需的单个菌落，经移种获得纯种细菌。不同的细菌在平板上所形成的菌落有其固有的形态特征，可以作为细菌鉴定的依据之一。14、平板划线方法分区划线接种法；曲线/连续划线接种法；棋盘格划线接种法；放射法；四格法；平板涂布接种法 15、分区划线接种法 ：多用于含菌数量较多样本的细菌分离 16、半固
8、体培养基：可用于观察细菌动力和保存菌种。17、菌落：细菌经一定时间培养后，在固体培养基表面所形成的，肉眼可见的物体（群落） 。18、菌落特征菌落形状；大小：mm；表面性状；边缘情况；颜色；透明度；质地；粘度；乳化性.等19、细菌在鉴定培养基上的特征 溶血特征；卵黄；蛋白；色素；气味在血平板上的溶血特征溶血：狭窄的草绿色的半透明区域溶血：完全透明清楚的宽带溶血：看不到溶血带的溶血卵黄琼脂中的反应：检查细菌是否产生卵磷脂酶和脂酶卵磷脂酶：降解卵黄，菌落周围出现沉淀环脂酶：出现“珍珠包膜”蛋白水解作用：在菌落周围出现清晰的环。色素水溶性色素溶在培养基中，使培养基着色。 绿脓色素、荧光色素等；脂溶性色
9、素则使细菌菌落着色。 金黄色葡萄球菌的金黄色菌落。气味 假单胞菌属细菌葡萄汁气味；变形杆菌巧克力烧焦的臭味；链球菌地窖里的霉臭；梭菌粪臭、腐败味；产黑色素类杆菌属细菌辛辣味 20、细菌的生化反应试验不同的细菌不同的酶系统不同的新陈代谢产物产物不同的生化特性鉴别细菌的类别21、糖发酵试验结果判断反应现象结果描述酸性变色、有气泡分解糖产酸、产气酸性变色、无气泡糖产酸、不产气培养基不变色不分解糖22、甲基红（MR）试验 ：检查细菌发酵葡萄糖产生并保持稳定的酸性终末产物和克服体系缓冲作用的能力。分解葡萄糖丙酮酸乳酸、乙酸、甲酸等培养基的pH4.5甲基红指示剂红色：阳性；分解葡萄糖产酸少培养基pH较高甲
10、基红指示剂黄色：阴性。23、-半乳糖苷酶试验 ：预测细菌发酵乳糖的能力。-半乳糖苷酶：一种能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶。发酵乳糖的大肠菌类能产生-半乳糖苷酶-渗透酶（P）和-半乳糖苷酶（G）24、靛基质（吲哚）试验 分解：蛋白胨中的色氨酸吲哚吲哚二甲氨基苯甲醛玫瑰吲哚（红色） 25、硫化氢试验 含硫氨基酸H2SH2S铅或铁离子黑色硫化物。26、触酶试验 过氧化氢酶又称触酶，可使细菌代谢过程中的过氧化氢分解为水和氧。27、血浆凝固酶试验 金黄色葡萄球菌可产生凝固酶,使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白,附着于细菌表面,产生凝固。玻片法：与细胞壁结合的凝固酶试管法：菌体生成后释放于培养基中的游离
11、凝固酶 28、血清学鉴定serological identity：确定致病菌的种或型未知纯种细菌已知特异性抗体常用方法：玻片凝集试验 、免疫荧光、协同凝集、对流免疫电泳、酶免疫、间接血凝、乳胶凝集29、血清学诊断辅助诊断：抗原性较强的病原菌和病程较长的传染病。抗体有无及其抗体效价变化已知的细菌/特异性抗原特异抗体 试管凝集试验。直接凝集试验、显微镜凝集试验、沉淀试验、乳胶凝集试验、ELISA、免疫荧光试验等。急性期和恢复期双份血清样本，恢复期的抗体效价比急性期升高4倍或4倍以上。30、细菌毒素的检测方法外毒素 细菌外毒素的免疫血清（抗体）被检细菌培养物滤液（抗原）细菌外毒素（抗原） 被检患者血
12、清动物试验 内毒素 家兔热原试验,鲎试验,免疫学方法、生物学方法、化学发光法、流式细胞术、高效液相色谱31、鲎试验（limulus test，LT） ：定量及半定量检测细菌内毒素；血液中含有一种独特的有核变形红细胞，红细胞裂解物内毒素凝胶 外毒素与内毒素的主要区别32、细菌数量的测定：物理计数法 ；生物计数法 物理计数法细菌总数计数法：利用工具和仪器对样本中的细菌进行计数，其结果表示样本中的所有细菌（活菌死菌）。Breed计数法：Direct microscopic count 比浊管计数法：细菌悬液的浊度与菌数成正比分光光度计测定法：吸光度同细菌总数成正比生物计数法活菌计数法：利用各种培养方
13、法检测样本中细菌的数目,计数培养基上生长的菌落数样本中活菌数。半定量计数法；倾注平板法；旋管计数法；滴液计数法；琼脂表面计数法；膜滤过计数法；微菌落快速计数法；最可能数（MPN）的估计33、L-型细菌检查 L forms bacterium：一种细菌通过变异而产生的细胞壁缺陷型。必须在高渗溶液中方能存活，并失去原有形态而变成圆球形或多形性。致病?第四章、细菌的分型及其检验技术1、细菌分型“传统方法” 仅进行病原的菌种鉴定是不够的，需要进一步的分型诊断。血清学分型；生物化学分型；噬菌体分型；细菌素分型；耐药谱分型；质粒图谱分型;PCR技术；染色体酶切物脉冲场凝胶电泳分型2、噬菌体的作用具有高度特
14、异性（种、型） 一种噬菌体只能裂解一种或与该种相近的细菌，故可用于细菌的分类鉴定。用己知型噬菌体鉴定细菌，可对细菌进行分型。3、毒性噬菌体：Virulent Phage：能在宿主菌细胞内复制、增殖，产生许多子代噬菌体，最终裂解细菌。4、温和噬菌体 ：Temperate Phage：与宿主菌的染色体整合，随细菌DNA的复制而复制，随细菌的分裂而传代，不产生子代噬菌体。5、噬菌斑（plaque） 在液体培养基中，噬菌体可使浑浊的菌液变为澄清；在固体培养基上，噬菌体对宿主菌细胞的裂解作用可使菌落溶解，导致在带菌琼脂平板上产生空斑，易于观察，称噬菌斑（plaque）。6、噬菌体的效价测定噬斑形成单位（
15、pfu）的测定 ： 若将噬菌体按一定倍数稀释，通过噬斑计数，可测定一定体积内的噬斑形成单位（plaque forming units, pfu）数目，即噬菌体的数目。7、 细菌素分型技术细菌素（bactericin）：某些细菌产生的蛋白质类抗菌物质，这种物质只对产生菌亲缘关系近的细菌有抗菌作用，而对产生菌本身不敏感。细菌素是蛋白质，质粒控制，多处于抑制状态。细菌素的应用主要是细菌的分型和流行病学调查，是血清学分型的补充。8、药敏试验（drug susceptibility test）在体外测定抗菌药物抑制或杀死细菌能力的试验。抗菌药物：具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。9、药敏试验方法
16、 纸片法：测定抑菌环大小，其结果以敏感、中度敏感、中介度、耐药表示。 稀释法：找出能抑制细菌生长的最小抑菌浓度（MIC）或最小杀菌浓度（MBC）表示。E试验（E-test）：最小抑菌浓度 MIC：在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度。最小杀菌浓度 MBC：杀死99.9%（降低3个数量级）的供试微生物所需的最低药物浓度10、纸片扩散法 是国际上推荐使用的标准实验方法 ；细菌耐药谱分析中最常用的方法。原理：将含定量抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，培养后，形成一个透明抑菌环。抑菌环的大小反映待测菌对该药物的敏感程度，与MIC成反比。0.5麦氏比浊度=11
17、08cfu/ml结果判断：针对抑菌环直径测量值报告敏感、中介或耐药。敏感（S）：被测细菌所引起的感染可以用常用剂量的该抗菌药物治愈。中介（I）耐药（R）：被测细菌不能被常用剂量抗菌药物抑制,或具有特定耐药机理，临床治疗效果不佳。11、肉汤稀释法 将药物按一定规律用M-H肉汤稀释成一系列浓度后，与一定量的细菌作用，经培养后定量测定其MIC，反映细菌的药物敏感性。校正0.5麦氏比浊标准，1200稀释（110120）。（5105 cfu/ml）结果判定：无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该待测菌MIC。12、琼脂稀释法 将待测菌接种于含不同浓度药物的琼脂平板上，经培养后观察菌落的生长情况，以能抑制
18、细胞生长的最低药物浓度为该菌的MIC。第五章、细菌的分类与命名P911、细菌分类等级 种是细菌分类的基本单位，将生物学性基本相同的细菌群体归成一个菌种；性状相近、关系密切的若干菌种组成一个菌属；2、细菌DNA中GC mol/%测定细菌DNA中GC mol%含量不同是细菌的一个重要遗传特征。单一菌种中许多不同菌株的GC mol%平均值极为接近或者是一致的。3、细菌命名细菌的科学名称（学名）为生物双名式。属名种名（人名、地名）。斜体 属名在前，名词，首字母大写 种名在后，形容词，小写 属名可用第一个字母代表M. tuberculosis（结核分枝杆菌）、S. typhi（伤寒沙门菌）常见的细菌也可
19、用习惯通用俗名tuberculosis（结核杆菌）、typhoid bacillus（伤寒杆菌）泛指某一属细菌：属名sp （菌种species）Mycobacterium sp，Salmonella sp 亚种的名称：属名种名亚种Klesbsiella penumoniae subspecies pneumoniae 中文译名则种名在前，属名在后。4、细菌分类系统 ：伯杰氏鉴定细菌学手册第七章、消毒学试验技术1、消毒学试验将试验微生物暴露于消毒因子（物理、化学、生物学），作用预定的时间之后，检查试验的微生物是否被杀灭或抑制。主要目的：检查一种消毒剂或消毒方法是否能达到杀灭或消除病原微生物的要求
20、。2、消毒 disinfection ：杀灭或清除传播媒介上病原微生物，使其达到无害化的处理。灭菌：杀灭或清除传播媒介上一切微生物（包括病原体和非病原体的繁殖体和芽胞）的处理。3、微生物学检验：中和试验、定性/量杀菌试验、病毒灭活试验、能量试验、现场试验等4、消毒药械鉴定测试的项目消毒剂消毒器械 理化性能检验有效成分含量；pH；金属腐蚀性杀菌因子强度或浓度；微生物学检验微生物杀灭模拟现场试验与现场试验 实验室杀灭微生物模拟现场和现场试验 其他稳定性试验安全性试验（电器、毒理 ） 5、菌片：用于测定各种消毒剂、消毒器械与方法对不同物品上微生物的杀灭作用。6、残留消毒剂的去除方法：化学中和法（称中
21、和剂法）、过滤冲洗法、稀释法等中和剂法：在消毒剂与微生物作用到达规定时间的终点时，取样加于适宜种类和浓度的中和剂中，将残留消毒剂迅速中和，使其不再持续抑制或杀灭微生物的方法。中和剂 ：能及时中止消毒剂的杀微生物作用本身及其与消毒剂的反应产物对微生物无抑制或杀灭作用，对培养基无不良影响。7、中和试验 操作方法用PBS将指示菌制成51055106cfu/ml悬液。将消毒剂用灭菌蒸馏水配制成3种不同浓度，在不加中和剂的情况下，测知该消毒剂10min抑杀指示菌99.9以上的最低有效浓度。 取消毒剂10min抑杀指示菌的最低有效浓度与待选择中和剂进行试验，选出中和剂种类并依据等当量中和原则，调整中和剂浓
22、度，选出试验浓度的消毒剂使用中和剂的浓度。中和剂选择试验时，先将消毒剂1.0mL与中和剂溶液9.0mL混合，制成中和产物溶液，再分组进行。试验分组消菌：消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制能力。（消菌）中： 残留消毒剂被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否能恢复生长。中菌：中和剂是否抑菌。（消毒剂中和剂）菌液：中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。稀菌： 菌数对照。稀中培养： 阴性对照。8、消毒剂定性消毒试验：测定受消毒因子作用后的样本有无细菌生长的试验方法。试验方法5106cfu/mL的菌悬液。灭菌试管10，标号。每管：灭菌蒸馏水2.5mL，202水浴。 消毒液2.5mL，
23、倍比稀释，至第9管。第10管中不加消毒液作对照。加菌悬液2.5mL于各管中，混匀并记录各管加菌时间，使菌药混合液中含菌量均为105106cfu/mL。各管分别于加菌后4个不同间隔时间，取0.5mL 4.5mL中和剂内，中和10min后，取出0.5mL加入4.5mL营养肉汤管内。将接种细菌的肉汤管放37培养48h，观察初步结果，无菌生长管继续培养至第7天。试验重复5次。结果判定若肉汤管混浊，则表示有菌生长，记为阳性，以（+）表示。若培养至第7天，肉汤管澄清，则表示无菌生长，记为阴性，以（）表示。对难以判定的肉汤管，取01mL接种于营养琼脂平板，用灭菌L棒涂匀，放37培养48h，观察菌落形态；并做
24、涂片染色镜检，判断是否有指示菌生长。有指示菌生长记为阳性。5次试验，均无指示菌生长表示达到灭菌。9、消毒剂定量消毒试验：测定受消毒因子作用后，样本残存微生物数量的试验方法，以杀灭率表示结果。用于对消毒剂杀灭效果的评价。将一定量的细菌悬液或菌片（载体），暴露于设计浓度的消毒液中，作用至规定时间后，取细菌与消毒液的混合物或取出载体，与中和剂反应，终止消毒剂的继续作用，并接种于营养琼脂平板，培养之后，计数菌落。以存活的菌落数与最初加入的菌数比较，计算出杀灭率，或杀灭效果（germicidal effect，GE）。10、悬液定量杀菌试验 -活菌培养计数 消毒液：浓度为待测浓度的1.25倍实验用菌悬液
25、：（11085108）cfu/ml 菌0.5ml干扰0.5ml ，混匀，201水浴5min，消毒液4.0ml，迅速混匀并立即计时。待菌药相互作用至预定时间，分别吸取0.5ml菌药混合液加于4.5ml经灭菌的中和剂中，振荡混匀。11、定量杀菌试验的评价规定 在产品说明书指定的最低浓度与最低作用时间，重复试验3次。在悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值均5.00，可判定为消毒合格。12、破坏效果判定以S/N2.1作为HBsAg抗原性破坏合格标准。S是消毒因子作用后被检样品或阳性对照样品平均每分钟脉冲数（cpm）值或光密度（OD）值。N是试验中阴性对照样品平均cpm值或OD值。细菌学检验各论一般性思考题：1、 菌的培养特征如何？（增菌、选择性平板）2、菌的形态与染色有何特点。3、菌的生化特性有哪些？其中最有特点的是哪个项目，如何利用这个项目，诊断某细菌是否是菌。4、菌的分型特点是什么？致病菌检测的一般思路？2副溶血性弧菌是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。进食
