1、指构成核酸的四种基本组成单位-脱氧核糖核苷酸（核苷酸）的连接和排列顺序，表示了该DNA分子的化学组成。DNA一级结构基本特点 DNA由2条相互平行的脱氧核苷酸盘绕而成； DNA分子中的脱氧核糖和磷酸连接，排列在外侧，构成基本骨架，碱基排在内侧； 两条链的碱基按照碱基互补配对原则通过氢键结合形成碱基对。DNA的二级结构定义：指两条脱氧多核苷酸链反向平行盘绕所组成的双螺旋结构。两条相同、反向结合、碱基互补配对、氢键分类：根据DNA双螺旋结构螺距和旋转方向不同，可以分为B-DNA,A-DNA,Z-DNA等半保留复制：DNA在复制前氢键断裂，双螺旋解旋并分开，每一条作为合成新链的模板，按碱基配对的规则
2、产生互补的两条链。因此子代DNA双链中一条是原来的链，另一条是新合成的。复制子（replicon）:DNA复制时，并不是整条链全部打开，而是在复制的局部将链打开，形成复制单位。即从起始位点到终止位点的全部DNA。复制叉（replication fork）：DNA分子在复制时，在复制起始位点两条链解开成单链，各自作为模板合成互补链，所以这个复制起点呈现叉子的形式。环状DNA的复制 型 滚环型（rolling cycle） D-环型（D-loop） 原核生物DNA复制的特点：最小复制起始位点：一段245bp的序列，3个13聚体的回文结构4个9聚体的重复序列（复制起始蛋白结合位点）。原核DNA复制的
3、过程：1、DNA双螺旋的解旋解旋酶（helicase）：dnaB编码的DnaB，通过水解ATP获得能量，沿53方向解开DNA双链。（Rep 35）单链DNA结合蛋白（SSB）：能结合并覆盖在单链DNA上，防止解开的DNA单链被酶降解以及重新结合成双链，以保持单链的存在。原核生物SSB具“协同作用”。DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase）：催化DNA断裂和重新连接。2、DNA复制的引发引发酶：引物合成。DNA聚合酶不能引发DNA新生链的合成，先由引发酶催化合成RNA引物，DNA聚合酶再从RNA引物3端开始合成新的DNA链。后随链：引发前体（6种蛋白组成）引发酶组成引发体，发挥功效
4、。3、冈崎片段与半不连续复制半不连续复制（semidiscontinuous replication）： DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。DNA复制时，DNA聚合酶合成方向都是53方向延伸。合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为先导链（领头链） ；合成方向与复制叉移动的方向相反，先按53顺序合成一短DNA（冈崎片段），再连成一条完整的DNA链为滞后链（随从链） 。4、复制的终止复制终止子序列（Ter）：特定终止区域，Ter-tus复合物使DnaB不再解链，阻挡复制叉前移。5、DNA聚合酶以DNA为模板的DNA合成酶以四种dNTP为
5、底物反应需要有模板的指导Mg2+存在反应需要有3-OH存在DNA链的合成方向为5 3 原核生物DNA聚合酶的作用DNA聚合酶（pol）：在修复中起作用DNA聚合酶（pol）：修复DNADNA聚合酶（pol）：DNA的真正复制酶真核生物DNA复制的特点1、真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子2、真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始DNA复制；而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的复制（多复制叉）。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。3、真核生物有多种DNA聚合酶。真核生物DNA聚合酶 ：复制，还具有引物酶活性，后滞链的合成：修复作用，在DNA链上加上
6、一个核苷酸：线粒体DNA复制中起作用：复制主要的酶。先导链合成，行进距离大：后随链合成有关DNA损伤的修复1、 错配修复 2、切除修复 3、 重组修复 4 、DNA的直接修复 5 、SOS反应原核转座子：IS两端有ITR，只编码转座酶复合转座子两端有IS或类IS，编码抗生素TnA转座子两端有ITR，可编码转座酶、解离酶、抗性物质。插入序列（insertion sequence，IS） （1）是一类较小的没有表型效应的转座因子，长度约7501500bp； :IS1（2）由一个转位酶基因和两侧的反向重复序列组成；（3）可双向插入靶位点，在插入后的两侧可形成正向重复序列复合转座子（copmposit
7、e transposon） 是一类较大的可移动成分； 中心区域含有关转座的基因，如转座酶； 带有一个或几个与转座作用无关的但可决定宿主菌遗传性状的基因，如大肠杆菌毒素基因、抗药性基因等。转座子A家族（transposon A, TnA） 不仅编码抗性标记基因，还编码转座酶和解离酶。解离需要一个特异性的内部部位，这是TnA族的重要特征。转座作用机制 复制型转座（replicative transposition）非复制型转座（nonreplicative transposition）保守性转座（conservative transposition）第三章编码链，正义链，模板链，反义链（知道图上的
8、位置）作为模板进行转录的DNA链称为模板链、反义链或负链；而以模板相对的那条链称为编码链、有义链或正链。转录的基本过程 1 模板识别模板识别：指RNA聚合酶与启动子DNA相互识别并结合的过程。启动子（promoter）：基因表达调控的顺式作用元件，为基因转录起始所必需的。真核生物：还需转录调控因子参与2 转录起始 转录起始：不需引物。RNA聚合酶与非特异性结合位点相结合聚合酶与启动子区闭合双链DNA相结合二元闭链复合物二元开链复合物开始转录。原核生物的转录起始1、RNA聚合酶全酶（2 ）与模板结合 2、DNA双链解开,形成转录空泡3、在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应5-pppG -OH
9、+ NTP 5-pppG -OH + NTP起始复合物:RNApol - DNA - pppGpN- OH 3 转录延伸 RNA聚合酶释放因子，核心酶沿模板链移动并使新生RNA链不断延长。1、 亚基脱落，RNA pol 聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；2 、在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。4 转录终止 转录终止：RNA链延伸到转录终止位点，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合链分离，转录泡瓦解，DNA恢复双链状态，RNA聚合酶、RNA链被释放。RNA聚合酶因子：蛋白因子，负责模板链的选择和转录的起始，使全酶专一性 识别模板上的启动子。
10、全酶 核心酶：依靠酸性蛋白和碱性核酸的静电引力与DNA松弛结合。负责转录由全酶识别并形成单链DNA的模板。因子：负责模板链的选择和转录的起始，使酶专一性识别模板上的启动子。 提高聚合酶对DNA的亲和力 降低聚合酶对模板DNA上非特异性位点的结合常数DNA聚合酶对-鹅膏蕈碱的敏感程度在细胞中存在部位合成RNA酶基本不受影响，10-3 mol/L才轻微抑制核仁5.8S、18S、28SrRNA酶最为敏感， 10-8 10-9 mol/L即抑制核质mRNA酶介于上述2个中间tRNA、5SrRNA 、snRNA启动子（promoter， promotor ）：与基因表达启动相关的顺式作用元件，是结构基因
11、的重要成分。它是一段位于结构基因5端上游100-200bp的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。启动子特征：序列特异性。含保守序列框。方向性。是一种有方向性的顺式调控元件位置特异性。位于所启动转录基因的上游或前端种属特异性。不同种、属，不同组织均不同原核生物Pribnow框（-10区）：在原核生物基因的-10（-4-13）序列区存在的一段有助于dsDNA局部双链解开的保守序列5TATAAT3 。Pribnow框是RNA聚合酶的牢固结合位点。Sextama框（-35区）在-35bp前后有一个保守的TTGACA序列，是RNA聚合酶初始结合位点。 RN
12、A聚合酶依靠因子识别该位点，又称为识别位点。-35区在很大程度上还决定启动子强度（结合速度）；-10序列区，通过影响开链式启动子复合物的形成速度而控制转录（解链速度）。真核生物 TATA框：又称Hogness框：中心位置在-25 （-20-30）之间存在的TATA（A/T）A（A/T）区，与DNA双链解开有关，并决定转录起始位点。功能与原核生物的Pribnow框类似。CAAT框：-75附近，GGC/TCAATCT，可能控制转录起始的频率，与Sextama框功能类似，与RNA聚合酶结合有关。正反取向均能发挥作用。GC框：-90， GGGCGG，可能为转录因子的结合序列。影响转录频率。八聚体框（o
13、ctamer box）：ATGCAAAT，影响转录频率。增强子（enhancer）：远距离效应：无方向性，行使功能与所处的位置、取向无关：上、下游 中；双向都能起作用顺式调节：只调节位于同一染色体上的靶基因无物种和基因特异性：不仅与同源基因相连时有调控功能，与异源基因相连时也有功能具组织特异性：增强子效应需特定蛋白因子参与还受外部信号的调控：原核真核的mRNA特征比较原核1、半衰期短 2、多以多顺反子形式存在 3、5端无帽子结构，3端无poly（A）结构，有SD序列真核1、 5端帽子结构； 2、3端poly（A）结构SD序列在原核生物结构基因起译密码子上游10bp（7-12bp）处，有一个富含
14、嘌呤的序列,转录出mRNA上5-AGGAGGU-3 ，与核糖体30S亚基的16SrRNA 3端3-UCCUCCA-5互补，成为30S亚基识别和结合mRNA的位点。转录的终止1、不依赖于因子的终止（强终止子）：发卡结构：GC丰富区域；poly（U）结构：与DNA上poly（A）作用力较弱，新生链易从模板上脱落。2、依赖因子的终止（弱终止子）： 因子是一种NTP酶，由于催化了NTP的水解因而能促使新生链从三元复合物中解离而终止转录。RNA剪接（RNA splicing）：从mRNA前体分子中切除被称为内含子的非编码区，并使基因中被称为外显子的编码区拼接形成成熟mRNARNA编辑（RNA editi
15、ng）：指转录后的RNA在编码区发生碱基的加入、丢失或转换现象，从而改变蛋白的结构信息核酶（ribozyme） 具有催化功能的RNA分子，通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子，从而阻断基因的表达。GUAC法则见书P95第四章起始密码子AUG（同时为甲硫氨酸的密码子）终止密码子UAA（赭石）、UAG（琥珀）、UGA（蛋白石）遗传密码的性质 1、密码的连续性（无标点符号）：无间断也无重叠2、密码的简并性（degeneracy）： 61个密码子代表20个氨基酸。除了甲硫氨酸（AUG）和色氨酸（UGG）外，其它氨基酸都对应一个以上密码子。3、遗传密码的通用性（unive
16、rsality）与特殊性4、密码子与反密码子的相互作用碱基摆动配对（wobble base-pairing）：P115密码子的第三个碱基总是处在一个不稳定的位置上，它与反密码子的第一个碱基配对结合的强度不如前两个碱基。结果是tRNA可以和一个以上的密码子碱基配对。三叶草型的二维结构1、受体臂（acceptor arm）或称氨基酸臂：携带特异氨基酸。2、TC臂：和核糖体上的rRNA 识别结合。3、反密码子臂（anticodon arm）：密码子的识别与配对。4、D环臂（D arm），或双氢尿嘧啶环:与氨基酰tRNA合成酶结合。5、额外环（extra arm）： L型三维结构中连接两个区域（D环-
17、反密码子环和TC-受体臂）。同工tRNA（cognate tRNA ）：携带不同的反密码子，但能识别同一氨基酸多个密码子的tRNA。它们的相对丰度决定了密码子的选择性利用率。tRNA的种类1、起始tRNA和延伸tRNA原核生物：甲酰甲硫氨酸（fMet）甲硫氨酸（Met）2、同工tRNA（cognate tRNA ）3、校正tRNA无义突变（nonsense mutation）在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子，使蛋白质的合成提前终止，合成物功能的或无意义的多肽，这种突变称为无义突变错义突变（missense mutation） 通过反密码子区的改变
18、把正确的氨基酸加到肽链上，合成正常的蛋白质核糖体的结构蛋白质合成的生物学机制（须具体掌握见书）1 氨基酸的活化 2 翻译的起始 3 肽链的延伸 4 肽链的终止5 蛋白质前体的加工 6 蛋白质的折叠 7 蛋白质合成的抑制剂分子伴侣（ molecular chaperone）：能防止新生链错误缠绕、促进肽链正确折叠的蛋白质。是细胞内蛋白质折叠和组装的重要调节者，能与其它构象不稳定的蛋白结合并使之稳定地一类蛋白质。具体功能：封闭暴露出来的疏水区段，保护蛋白质不受其它蛋白的相互作用，利于蛋白质正确折叠；防止新生肽链在折叠前相互聚合；识别错误折叠的变性蛋白，帮助其复性。信号肽与蛋白质转运蛋白质转运必须完
19、整的信号肽序列；仅有信号肽序列蛋白质不一定转运；信号肽切除不一定抑制转运；转运蛋白质不都含有可降解的信号肽。蛋白质的靶向（protein targeting）：细胞中新合成的蛋白质必须被分选和运送到特定的亚细胞结构中定位或分泌至细胞外以发挥它们的特定功能。信号肽序列：决定蛋白质定位的信息，在起始密码子后编码疏水氨基酸的序列。特点： 10-15个疏水氨基酸 N端1或数个带正电荷的氨基酸（碱性氨基酸） C端有数个极性氨基酸，最后的丙氨酸或甘氨酸核定位序列（重要功能见书P150）核蛋白的重复定位第五章DNA的历史回顾（见书）核酸凝胶电泳技术原理和过程糖-磷酸骨架在结构上重复，相同数量的双链DNA几乎
20、具有等量的净负电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。核酸电泳的指示剂：溴酚蓝呈蓝紫色，二甲苯青呈蓝色。核酸电泳的染色剂：溴化乙锭（EB） 过程 1、凝胶准备 用0.5TBE配制1琼脂糖凝胶。 称1g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 0.5TBE 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖；电炉 熔化的琼脂糖自然冷却到60度（可加入EB）2、胶床准备将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙 将胶床放在调整好的水平台上3、铺胶将冷却致60的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度35mm 4、室
21、温下静置半小时左右，凝胶固化。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极 5、向电泳槽中加入0.5TBE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可 6、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。 原梳齿处（样品孔）即被缓冲液充满，如发现有气泡，应设法去除（可在步骤4时进行）7、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀 细菌转化（transformation）：指一种细菌菌株捕获了来自供体菌的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。 原理：将对数生长期的细菌在0下, 用预冷的CaCl2溶液低渗处理，使菌体的细胞壁和细胞膜通透性增加，菌体膨胀成球形，外源DNA可形成复合物而被吸附；经
22、短暂42热休克， DNA易于进入细菌的细胞内而不被降解。转化效率达105-106个转化子/ugDNA。过程（1）感受态细菌的制备 接种一环DH5于2ml LB中 37，振荡过夜 以约1%的接种量接入50ml LB中 振荡培养约90至OD6000.2 冰浴1060min 离心（5K，5） 收集菌体 加入预冷CaCl2（30 ml 100mM） 冰浴20 离心 收集菌体 加入2ml100mM预冷CaCl2 混匀 感受态细胞。（2）转化 冰浴30 42 90s（热休克） 冰浴，2 加37预热LB培养45取100ul/皿涂布抗性平板 37倒置培养过夜 检查细菌生长情况。（3）阳性克隆筛选抗药性筛选 蓝
23、白斑筛选 PCR筛选聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。PCR一般反应过程是：变性：94； 复性（退火）：50-60； 延伸：72，耐热性DNA聚合酶基因组文库:某种生物基因组的全部遗传信息的集合。将某个生物的基因组DNA片段与载体在体外重组，转化宿主细胞所得的菌落或噬菌体的集合。cDNA文库的构建过程（见书）SNP：single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于单个核苷酸突变引起的多态性。第三代遗传标志。第六章荧光原位杂交
24、技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH） 它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体或DNA上特异序列杂交，通过与荧光分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列的位置。酵母单杂交系统：是用于研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。酵母双杂交系统：用于检测细胞内蛋白质相互作用的遗传系统。现不仅局限于检测已知蛋白间的相互作用，也可用于蛋白质的功能域研究及未知蛋白编码基因的分离克隆等。荧光共振能量转移法（FRET）荧光能量转移有三个基本条件：1 给体与受体在合适的距离
25、（110nm）；2 给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠；给体与受体的偶极具有一定的空间取向。small interfering RNA （siRNA）：是一种小RNA分子（21-25核苷酸），与mRNA 的互补区发生碱基配对作用，阻遏其表达。具有这种作用的短小单链RNA称。这种作用称RNA干扰（RNA interference，RNAi）。第七章葡萄糖效应或降解物抑制作用 在葡萄糖存在的情况下，即使在培养基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，不会产生出代谢这些糖的酶。 原因：葡萄糖是最方便的能源，无需开启不常用的基因。应急反应氨基酸饥饿时，会出现
26、大量的空载tRNA，激活焦磷酸转移酶，生成鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp），魔斑核苷酸。乳糖操纵子详见PPT 乳糖操纵子的负调控 缺乏乳糖时，阻遏蛋白以活性状态结合在lcaO上，影响了RNA聚合酶与lacP的结合，并阻碍RNA聚合酶通过lacO，基因无法转录。 乳糖存在时，乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，改变了构象，脱离lacO， RNA聚合酶可与lacP结合，开始转录。 乳糖操纵子的正调节控制 正调控蛋白：代谢物基因激活蛋白，CAP（catabolite activator protein）或CRP（cyclic AMP receptor protein）：crp基因编码的
27、两个相同亚基组成的二聚体。 CAP亚基有2个结构域：氨基末端与cAMP结合，羧基末端和DNA结合。 lacP转录起始需要CAP存在，该蛋白只有在cAMP存在时才有活性。 cAMP与CAP结合后，构象变化，对DNA亲和力增大。CAP正调控因子。色氨酸操纵子（Trp）详见ppt5个结构基因： trpE、trpG：编码邻氨基苯甲酸合成酶 trpF：异构酶 trpD:编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶 trpC：编码吲哚甘油磷酸合成酶 trpB、trpA：编码色氨酸合成酶的亚基前导区： trpL；弱化子： trpa（前导区的123150位）阻遏调节系统 当培养基中缺乏组氨酸时，阻遏蛋白不被激活，不能与trpO结合，RNA聚合酶结合于启动子，操纵子表达； 当培养基中存在色氨酸时，阻遏蛋白与辅阻遏物（色氨酸）结合后与trpO结合，阻止转录的进行。 所以色氨酸操纵子是负调控阻遏系统；不受CAP-cAMP的影响。与lac操纵子区别。调控方式阻遏作用：指激活的trp阻遏蛋白与trpO结合，使转录不能起始。环境中色氨酸水平衰减作用：是使已经起始的转录在RNA聚合酶到达第一个结构基因t
