1、（4）统计菌落时，要求细菌和放线菌每皿的菌落数目范围是多少？霉菌每皿的菌落数目范围是多少？答案若测定细菌和放线菌，要求每皿以30300个菌落为宜，若是霉菌则以每皿10100个菌落为宜。归纳总结要使平板菌落计数法准确，需要掌握的关键步骤有：严格的无菌操作，否则容易被杂菌污染；稀释液要充分混匀，吸量准确，否则结果不准确；多做几个重复实验，减少误差。1.用平板菌落计数法来统计样品中活菌的数目。在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌体数真实值的是（）A.菌落数量最多的平板B.菌落数量最少的平板C.菌落数量适中的平板D.取若干个平板菌落数量的平均值答案D解析用平板菌落计
2、数法对样品中活菌数目进行统计，只是一种估测，根据此方法的实验过程可知，在某一稀释度下涂布的平板菌体数具有一定的偶然性，并不是绝对均匀，所以取若干个平板菌落数量的平均值比较接近样品中菌体数的真实值。2.若某一稀释度下，平板上生长的平均菌落数为80，涂布平板时所用的稀释液体积为0.1 mL，稀释液的稀释倍数为106，则每克样品中的活菌数约为（）A.8108 B.8107C.8105 D.8106答案A解析每克样品中的活菌数（800.1）106。二、土壤中尿素分解菌数量的测定土壤中含有种类繁多的微生物，不同微生物的数量有差别，我们通过实验来测定土壤中尿素分解菌的数量。1.下面是土壤中尿素分解菌培养使
3、用的培养基的配方，请分析：成分用量尿素20 g酵母粉0.1 g磷酸二氢钾9.1 g磷酸氢二钠9.5 g酚红0.01 g琼脂加热溶解后，用1 mol/L NaOH溶液调pH至7.27.4，补加蒸馏水定容至1 000 mL（1）在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是酵母粉，提供氮源的是尿素，琼脂的作用是凝固剂。（2）微生物要利用尿素需要分泌脲酶，不能分泌脲酶的微生物不能利用尿素。因此该培养基对微生物具有选择作用，其选择机制是只有能够分泌脲酶从而以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长。（3）细菌合成的脲酶分解尿素产生了氨，使培养基的碱性增强，pH上升，使酚红变色，菌落周围变红。可用来鉴定选
4、出的菌落是不是尿素分解菌。2.结合下图分析实验过程和注意事项步骤实验操作操作提示制备培养基分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用制备土壤样品稀释液称取土样10 g，放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的锥形瓶中，充分摇匀；吸取上清液1 mL，转移至盛有9 mL的生理盐水的无菌大试管中，按照上图流程进行样品的稀释，依次制成稀释度为101、102、103、104、105、106的稀释液应在火焰旁称取土样；要充分摇匀加样取10套无菌培养皿，取104、105和106不同稀释度分别做3个重复平板，留下一个平板做空白对照
5、。每皿接种稀释菌液各0.2 mL实验时要对所用的平板、试管作好标记。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等倒平板将菌液移入培养皿后立即倒入溶化并冷却至45 左右的尿素培养基（倒入量为15 mL），平置，待凝倒平板时要晃动培养皿，使菌液和培养基混合均匀培养将涂布好的培养皿放在37 温度下培养在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，才说明选择培养基有选择作用计数当菌落数目稳定时，选取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目如果学生选取的是同一种土样，结果相差太
6、远，教师需要引导学生一起分析产生差异的原因1.试写出测定土壤中尿素分解菌数量的实验流程。答案制备尿素固体培养基制备土壤样品稀释液加样倒平板培养统计菌落数计算样品中的菌数。2.甲、乙两位同学用平板菌落计数法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果（1）甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？答案不真实。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布3个平板，统计结果后计算平均值。（2）乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。
7、该同学对实验结果的处理是否合理？答案不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地舍弃后进行计数。（3）某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。平板稀释度平板1平板2平板3103320360356104212234287105212318答案104的稀释度下取0.1 mL涂布的三个平板上的菌落数在30300之间，计算其平均值为（212234287）/3244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为2440.1104102.44108。（4）为什么统计的菌
8、落数比活菌的实际数目低？答案当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。3.微生物数量测定的实验设计（1）如果平板上长出的菌落不是均匀分散的，而是集中在一起，可能的原因有哪些？答案菌体密度太大；倒平板后没有立即摇匀；平板冷凝水太多。（2）同一个稀释度的3个平板上的细菌的数目应该比较接近，如果长出的菌落数差别较大，可能的原因有哪些？答案取样不准确；稀释不均匀；倒平板操作时培养基温度差别较大等。（3）实验中的无菌操作主要有哪些？答案培养基、锥形瓶、试管、铲子、信封等，需要进行灭菌。称取土壤要在火焰旁进行。稀释土壤溶液的每一步操作都要在火焰旁进行。归纳总结分离尿素分解菌操作中的注意事项
9、（1）在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。（2）样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30300个菌落，这个稀释度细菌一般为104、105、106倍稀释液，放线菌一般为103、104、105倍稀释液，真菌一般为102、103、104倍稀释液。（3）为排除非测试因素（培养基）的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。（4）每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为重复实验，求其平均值，若其中有菌落数与其他平板悬殊过大的，需要对该平板重新制作。3.如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析下列叙述正确的是（）A.4号试管中
10、稀释液进行平板培养得到的菌落平均数一定恰为5号的10倍B.5号试管的结果表明每克该土壤中的菌株数目为1.7108个C.在用移液管吸取菌液进行梯度稀释时，可用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与无菌水充分混匀D.某一稀释度下至少涂布3个平板，该实验方法统计得到的结果常会比实际活菌数目高答案C4.自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。（1）实验步骤制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。为了得到更加准确的结果，应选用_法接种样品。适宜温度下培养。（2）结果分
11、析测定大肠杆菌数目时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是_。A.一个平板，统计的菌落数是230B.两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240C.三个平板，统计的菌落数分别是400、212和256，取平均值289D.四个平板，统计的菌落数分别是210、260、240和250，取平均值240一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212，那么每克样品中的活菌数约是（涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL）_。用这种方法测定菌体密度时，实际活菌数量要比测得的数量_（填“多”或“少”），因为_。问题导析（1）因为题中操作的目的是
12、对大肠杆菌进行数量的测定，所以接种的方法是涂布分离法。（2）测定活菌数量时，选择的平板越多误差越小，且选择的平板要能形成30300个菌落。（3）所做的多个平板中，如果其中一个平板中菌落的数目明显多于或少于其他几个平板，则说明该平板不符合要求，应重做或舍弃。答案（1）涂布分离（2）D1.06109个多当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落解析（1）若对大肠杆菌进行计数，则需要用涂布分离法接种样品。（2）应选取多个菌落数相差不大的平板进行计数，取其平均值。2120.21061.06109（个）。因为一个菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。一题
13、多变（1）如果某同学的稀释倍数仅为104，则测定的数值要比题中测定的数值高还是低？答案低。因为稀释倍数太低，则大部分菌落是由多个细菌繁殖而成，所以测定的菌落的数值要偏低。（2）第（2）问第小题C项中菌落数为400的平板不符合要求，试分析该平板中菌落数目多于其他平板的可能的原因。答案培养基被污染，一些菌落是由杂菌繁殖而成的；接种过程中由于操作不当感染了杂菌；取菌液时没有摇晃，导致所取菌液中细菌个体浓度偏大等。方法链接用平板菌落计数法计数微生物的方法（1）涂布分离法操作要求：按照平行重复的原则，每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。（2）计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。（3）选择
14、可用于计数的平板：选择菌落数在30300之间的平板（相同稀释度的平板均符合该特点）进行计数，然后取平均值。1.通常用来作为菌种鉴定的重要依据是（）A.菌落 B.细菌形态C.细菌体积 D.细菌结构解析细菌个体非常小，不易直接观察，不同细菌菌落的形态特征不同，而且可以用肉眼观察，因此常作为鉴定菌种的依据。2.下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是（）A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、葡萄糖、琼脂、水C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、尿素、琼脂、水D.KH2PO4、Na2HPO4、MgS
15、O47H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水3.请选出下列正确的操作步骤（）土壤取样称取10 g土壤，取出放入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中吸取0.1 mL土壤溶液进行平板涂布依次制成101、102、103、104、105、106稀释度的稀释液A. B.C. D.4.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，下列实验操作不正确的是（）A.将土壤用无菌水稀释，制备103106土壤稀释液B.将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上C.用加入刚果红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌D.从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株解析从土壤中分离以尿素为氮源的细菌时，将土壤用无菌水稀释，制备土壤稀释液，将不同浓度
16、的土壤稀释液涂布于不同平板上，用加入酚红指示剂的鉴别培养基可以鉴别分解尿素的细菌；从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株。5.尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌（目的菌）。培养基成分如下表所示，实验步骤如图所示。请分析回答问题：KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO47H2O0.2 g葡萄糖10 g1 g15 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL（1）此培养基能否用于植物组织培养？_，理
17、由是_。（2）培养基中加入尿素的目的是筛选_，这种培养基属于_培养基（依据用途划分）。（3）“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的_和_，实验需要振荡培养，原因是_。（4）简述土壤中可分解尿素的细菌的鉴定方法及原理：_。答案（1）否缺少植物激素（或缺少植物需要的各种营养）（2）目的菌选择（3）尿素葡萄糖为目的菌提供氧气（4）在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，pH增高，使酚红指示剂变红解析配制培养基需要根据培养生物的营养需求情况，确定其成分及比例。植物组织培养需要有满足植物细胞生长所必需的营养和植物激素等条件，题目所给培养基中缺少植物激素，不能用
18、于植物组织培养。培养基中加入尿素是为了能够筛选出能分解尿素的细菌，依据用途划分，此培养基属于选择培养基。尿素提供氮源，葡萄糖提供碳源。在实验中振荡培养可增加培养液中的氧含量，为培养的目的菌提供必需的氧气。课时作业基础过关1.土壤中分解尿素的微生物所需氮源为（）A.硝酸 B.氨C.尿素 D.蛋白胨解析只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素为氮源，缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源，使其生长、发育及繁殖受到抑制。2.土壤中的细菌能分解尿素，是因为它们能合成一种（）A.尿素酶 B.脲酶C.蛋白酶 D.肽酶答案B解析能够分解利用尿素的细菌，其细胞内含有脲酶，可以把尿素分解成氨，然后进一步利
19、用。3.产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是（）A.一个细菌、液体培养基B.许多细菌、液体培养基C.一个细菌、固体培养基D.许多细菌、固体培养基解析在液体培养基中生活的细菌，无论是一个还是许多，肉眼都是看不见的。在固体培养基上的细菌，当数目较少时是看不见的。当固体培养基上有许多细菌并且集中在较小范围内时，肉眼可见。而菌落是一个细菌或几个细菌的子细胞群体，形成于固体培养基上，有一定的形态结构，所以肉眼可见。同种细菌形成的菌落，形态结构是相同的。如果有许多细菌形成的菌落，就不可能有比较标准的形态，因为这许多细菌第一可能不是同一种细菌，第二可能不在培养基的同一个点上。4.在做分离分解尿素的
20、细菌实验时，A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的结果产生的原因不可能是（）A.由于土样不同 B.由于培养基污染C.由于操作失误 D.没有设置对照解析实验结论是否正确与是否设置对照有直接关系，但实验结果与是否设置对照无关。5.下面对“从土壤中分离分解尿素的细菌过程中灭菌”的理解，不正确的是（）A.防止杂菌污染B.消灭全部微生物C.稀释土壤溶液的过程必须在火焰旁操作D.灭菌必须在接种前进行6.用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是（）A.未接种的选择培养基B.未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C.接种了的牛肉膏蛋白胨培养基D.接种了的选
21、择培养基解析将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，应选牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照遵循的是单一变量原则，所以与选择培养基一样接种、培养。7.测定土壤中细菌数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍的稀释液，其原因是（）A.细菌个体小，真菌个体大B.细菌易稀释，真菌不易稀释C.细菌在土壤中数量比真菌多D.随机的，没有原因解析土壤中的微生物大约70%90%是细菌，真菌的数量要比细菌少。样品的稀释度越高，在平板上生成的菌落数目就越少。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进
22、行培养，以保证获得菌落数在30300之间，适于平板计数，所以细菌的稀释倍数要高于真菌的稀释倍数。能力提升8.在“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中，以土壤中的细菌为研究对象，要达到的目的是（）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解氨的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少分解尿素的细菌统计所取土壤样品中究竟含有多少分解尿素的细菌A. B.C. D.解析从土壤中分离分解尿素的细菌并对其计数，统计的是每克土壤样品中含多少分解尿素的细菌，用公式“每克样品中菌株数（C/V）M”进行推测，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表
23、稀释倍数。9.给无氮培养基接种土壤稀泥浆的正确方法是（）A.打开培养皿盖，取一根接种环沾取少许稀泥浆，轻轻地点接在培养基的表面上B.取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后沾取少许稀泥浆，略微打开培养皿盖，在培养基的表面轻点C.打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后沾取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点D.取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌，冷却后沾取少许稀泥浆，略微打开培养皿盖，在培养基的表面轻点解析接种过程中要防止外来杂菌的入侵，右手将接种环在火焰上灭菌，冷却后沾取少许稀泥浆，左手将培养皿打开一条缝隙，在培养基的表面轻点，用未冷却的接种环沾取稀泥浆会杀灭菌种。10.实验测定链霉素对3种细菌的
24、抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂平板上画3条等长的平行线（3条线均与图中的链霉素带接触），将平板置于37 条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析，以下叙述不正确的是（）A.链霉素能阻止结核杆菌的生长B.链霉素对结核杆菌比对霍乱菌更有效C.链霉素对结核杆菌比对伤寒菌更有效D.链霉素可以用于治疗伤寒病人解析从图中可以看出，这是含有链霉素的选择培养基，接种的三种细菌中，霍乱菌和结核杆菌都可以被杀灭，并且链霉素对结核杆菌杀灭的有效程度大于霍乱菌，而伤寒菌照常生长不受影响，所以选项D错。11.通过实验测定土壤中的细菌数量，下列与此操作有关的叙述中，不正确的是（）A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋
25、白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B.取104、105的土壤稀释液0.1 mL，分别涂布于各组平板上C.将培养皿倒置，37 恒温培养2448 hD.选择菌落数在300个以上的培养皿进行计数解析检测土壤中细菌总数，用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板，取104、105、106稀释度的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培养2448 h，在确定对照组无菌后，选择菌落数在30300的平板进行计数。12.以下关于分解尿素的细菌的说法，正确的是（）A.能分解尿素的原因是能合成分泌蛋白酶B.以尿素作为唯一的碳源C.环境中含有大量的尿素诱导该细菌产生了分解尿素的特性D.以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基培养该菌后不会使酚红指示剂变红解析A项：酶有专一性，分解尿素的细菌之所以能分解尿素是因为能合成分泌脲酶。B项：该菌能以葡萄糖作为碳源。C项：环境中含有大量的尿素对分解尿素的性状起了选择作用而非诱导作用。D项：该菌产生脲酶把尿素分解为氨后，使pH升高，进一步使酚红指示剂变红，但添加酸碱缓冲剂后，阻止了pH的升高，因此培养基不再使酚红指示剂变红。13.下表为土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课题使用的培养基，分析培养基配方，回答下面的问题：10.0
