1、申报国家自然科学基金项目申请书样板各位申请人： 院科教部从我院申报国家自然科学基金项目中挑选了一份严格按照报告正文撰写提纲要求撰写，并在撰写的整体布局、写作方法上比较适宜的申请书作为样板申请书，提供给其他申请人在撰写申请书时参考。注：考虑到本项目也将申请国家自然科学基金，从技术保密方面考虑，涉及核心技术和关键问题之处将以“XXXXXXX”代替。报告正文（一）立项依据与研究内容1立项依据肝纤维化是严重威胁人类健康的重要疾病之一，迄今没有满意的治疗方法。目前国内外绝大多数学者认为，肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）激活是肝纤维化的关键，抑制HSC的激活对肝纤维化的防治
2、有重要价值1。粉防己碱（tetrandrine，又名汉防己甲素）是中药粉防己（Stephania tetrandra S Moore）的主要有效生物碱成分，具有广泛的药理作用。抗肝纤维化是Tet的重要应用领域之一。我们研究室在过去的十几年中，对Tet抗肝纤维化作用及机制进行了系统研究，证实Tet是抗肝纤维化有效药物。然而，由于Tet的剂量安全范围较小，以往研究发现的抗肝纤维化有效剂量与中毒剂量比较接近，故成为限制其临床应用的重要因素。近年国内Tet抗肝纤维化研究也由此逐渐走向低谷。为减少毒副反应，拓展该药物的临床应用，我们近四年从降低Tet的单药剂量、联合用药及改造药物毒性基团等方面进行实验性
3、探索。新近，我们在国内外首次发现，低浓度Tet能上调转化生长因子（transforming growth factor factor ，TGF-）抑制性信号分子Smad 7表达，调控TGF-Smad信号通路，抑制体外培养静止期HSC活化，阻断TGF-1促静止期HSC活化效应，Tet还诱导活化HSC活化逆转。部分最新研究成果已经整理成文发表在本领域有一定影响力的SCI索引源期刊上，并被SCI收录(收录号 IDS Number: 963XN )2（相关文章参详见申请人简历及附件二、三）。这些全新研究成果进一步增强了我们开发这一传统中药的信心。TGF-1是目前认识的最重要的促肝纤维化因子。抑制TGF
4、-1对HSC的作用一直以来均是抗肝纤维化重要着眼点3。Smad 7是HSC TGF-信号通路的最主要负反馈调节信号分子，上调Smad 7是抑制TGF-对HSC不良生物效应的有措施之一4。在肝纤维化过程中，TGF-信号通路还与整合素信号通路存在密切联系。这表现在三个方面：XXXXXX。XXXXXX。XXXXXXXXX。综上所述，XXXXXXX，如能XXXXXX，可进一步实现XXXXX治疗。基于以上研究结果，我们研究室在国家自然科学基金资助下，过去三年中应用化学方法合成了RGD和M6P，并将RGD与M6P结合成一新型复合分子RGD-M6P，研究比较了它们对HSC靶向性及在抑制其功能中的作用（项目名
5、称：RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究，编号：30170412）。我们的研究发现，RGD和RGD-M6P均可抑制HSC活化。RGD在抑制TGF-激活同时，还可阻止HSC与ECM结合，阻断整合素信号转导。研究还发现，M6P能提高RGD作用于HSC的靶向性，增加其局部浓度，使RGD-M6P显示出较RGD更强的抑制作用14。我们首次证实，新型复合分子RGD-M6P用于抗肝纤维化治疗，无论在对HSC靶向的特异性，还是多位点联合作用方面，都优于单一的含RGD序列的肽段或M6P（参见基金结题摘要，相关文章参见申请人简历及附件四）。RGD-M6P新型复合分子的研制成功及其对HSC靶向与抑制功
6、能的发现，有助于我们去研究更多的HSC靶向选择性高、局部作用强、系统毒性小的新型药物和(或)制剂，从而提高药物的疗效、减轻毒性反应。结合我们对Tet药理作用的分子机制的研究结果，不难发现，XXXXXXXX。基于以上系列研究基础与设想，紧跟国内外在制剂学方面的进展，我们拟设计XXXXXXXXXXX。当前，受体调节药物靶向（receptor-mediated drug targeting）作为一种新型的给药系统受到人们的重视16。XXXXXXXXXXXXXXXXX。迄今为止，尚未见到XXXXXXXXXXX。结合国内外同行的研究报道与我们的研究基础，不难推断，XXXXXXXXXXXXXXXXX。综上
7、所述，我们拟在XXXXXXXXXX。本研究将为XXXXXXXX等提供理论与实践基础。XXXXXXXXXX可以设想，如能取得预期效果，经过良好设计的基础研究后，这一XXXXXX应用于临床的时间不会太久，前景广阔。参考文献1 Friedman SL. Mechanisms of disease: Mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic implications. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2004;1(2):98-105.2 Chen YW, Li DG, Wu JX, et al. Tetran
8、drine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factor-beta in vitro via up-regulation of Smad 7. J Ethnopharmacol 2005;100(3):299-305.3 Breitkopf K, Haas S, Wiercinska E, et al. Anti-TGF-beta strategies for the treatment of chronic liver disease. Alcohol Cl
9、in Exp Res 2005;29(11 Suppl):121S-131S.4 Dooley S, Hamzavi J, Breitkopf K, et al. Smad7 prevents activation of hepatic stellate cells and liver fibrosis in rats. Gastroenterology 2003;125(1):178-91.5 Ludbrook SB, Barry ST, Delves CJ, et al. The integrin alphavbeta3 is a receptor for the latency-asso
10、ciated peptides of transforming growth factors beta1 and beta3. Biochem J 2003;369(Pt 2):311-8.6 Annes JP, Chen Y, Munger JS, et al. Integrin alphaVbeta6-mediated activation of latent TGF-beta requires the latent TGF-beta binding protein-1. J Cell Biol 2004;165(5):723-34.7 XXXXXXXXXXXXXXXXX.2 项目的研究内
11、容、研究目标，以及拟解决的关键问题2.1研究内容：2.2.1 XXXXX化学合成与鉴定，二硬脂酸磷酯酰胺XXXXXXXXXX 合成与鉴定。 2.2.2 不同类型脂质体的制备、技术参数优化、物理性质鉴定和脂质体药物包封率、载药量、配体结合率鉴定与提高。2.2.3 大鼠HSC分离培养，XXXXXXX 修饰脂质体与肝星状细胞体外结合活性研究。2.2.4 XXXXX 修饰XXXXXXXXX 对肝星状细胞活化、增殖、XXXXXXX 信号通路影响。2.2.5 XXXXXXXXX 的药代动力学特征、组织分布特征和XXXXXXX 研究。2.2.6 XXXXXXXX 对胆总管结扎和CCl4大鼠肝纤维化防治作用。
12、2.2研究目标：2.2.1 研究构建XXXXXXXX，为抗肝纤维化药物新剂型开发提供新型靶向载体。2.2.2 研究XXXXXX 对HSC生物活性影响及机制，为中西药结合肝纤维化双靶向、多靶点、协同治疗提供理论基础。2.2.3 研究XXXXXXXX 体内HSC靶向性及防治实验性肝纤维化的有效性，为开发中药新剂型、提高药物在靶组织浓度、降低有效剂量、减轻副作用和提高疗效提供实践基础。2.3 拟解决的关键问题：2.3.1 高药物包封率、高配体修饰率的稳定XXXXXXXX 制备。2.3.2 放射性计数法测定XXXXXX 与HSC结合活性，有效抑制HSC活化的剂量、时间参数等。2.3.3 XXXXXX
13、体内HSC靶向性、抗肝纤维化效果比较与评价。3 拟采取的研究方案及可行性分析3.1 研究方案：第一部分XXXXX 及XXXXX 合成(1) XXXXXX 合成及鉴定采用我们研究室建立的方法，化学合成XXXXXX。应用XXXXXXXXXX。合成反应图示如下。高效液相（HPLC）、质谱等方法鉴定合成产物纯度及分子量。反应图（略）(2) XXXXXXXXXXX采用一步法合成。XXXXXXXXXXXX。合成反应图示如下。高效液相（HPLC）和质谱分析法进物产物纯化与鉴定。反应图（略）第二部分长循环脂质体制备、鉴定与技术条件优化 (1) 脂质体制备采用经我们改良的逆相蒸发法制备。具体方法如下：XXXXX
14、XXXXX。(2) 性质鉴定 XXXXXXXXXXXXXXXX。(3) 均匀设计优化处方 根据实验结果及文献，确定影响包封率的主要因素。以包封率为评价指标，采用二项逐步回归计算回归方程，并进行方差分析，优化条件。第三部分 XXXXX修饰长循环脂质体与HSC体外结合活性采用两步胶原酶灌注和密度梯度离心法分离大鼠HSC，选择静止态和激活态的HSC，接种于6孔板上(细胞密度为5.0105/mL)。待贴壁后，1%胎牛血清DMEM培养过夜，细胞同步化。(1)配体结合的浓度-效应关系XXXXXXXXXXX。(2) 配体结合的时间-效应关系 XXXXXXXXXXXX。(3) 竞争抑制XXXXXXXXXX。(
15、4) 细胞荧光定位、配体表面结合率与内吞率测定XXXXXXXXXX。(5) 平衡解离常数(Kd )和细胞最大结合位点数(Bmax)XXXXXXXXXXX。第四部分 XXXXXXX对HSC生物学特性影响与机制采用酶法分离大鼠HSC。新鲜分离的HSC，体外培养48 h后，作为静止期HSC用于下游实验，或培养1 w后消化传代，继续培养24 h后，作为活化的HSC用于下游实验。(1) XXXXXXX对HSC活化状态影响XXXXXXXXX。(2)XXXXXX对TGF-1效应影响XXXXXXXXXXXX。(3)XXXXXXXX 大鼠HSC TGF-受体XXXXXXX 信号通路影响XXXXXXXXXXXXX
16、X。第五部分 XXXXXXXXXXXX(1) XXXXXXXX 在肝纤维化大鼠体内的器官分布XXXXXXXXXX。(2) XXXXXXX 大鼠体内药代动力学采用XXXXXXXX。(3)XXXXXXX 在肝纤维化大鼠肝脏内分布采用XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX。第六部分 XXXXXXX防治大鼠肝纤维化(1)造模采用胆总管结扎和CCl4肝纤维化两种动物模型。(2)分组及处理XXXXXXXXXXXXXX。(3)治疗效果检测主要比较以下指标：XXXXXXXXXXXXXXX。3.2技术路线技术路线图（略）。3.3可行性分析3.3.1 立项依据有坚实的理论与实践基础。本研究是参阅大量文献并结合
17、自身以往深厚的肝纤维化防治研究基础，特别是结合近四年国家自然科学基金资助研究成果，在XXXX 化学合成及功能研究、低剂量XXX抗肝纤维化作用和机制的前期工作基础上，提出的多途径、互补协同与靶向治疗肝纤维化的新探索。掌握了国内外在受体调节药物靶向、低毒性高效中药新剂型开发和以HSC的靶标的肝纤维化靶向治疗中的最新研究动态，借鉴“双靶向”干预的最新研究成果，并与自身实践相结合，在理论上、实践上均有可靠基础。3.3.2 相关实验技术成熟，实验结果可信。本研究使用的实验方法、动物模型和生物分子化学合成等多为国内外应用多年的经典方法，并有自身实践基础。本课题组由掌握以上技术的成员组成，相关技术已应用于科
18、研工作。3.3.3 人员配备合理，具有扎实的相关工作基础和完善的实验设备及技术支持。申请人长期从事肝纤维化防治研究，先后承担包括国家自然基金在内的各类科研项目15项，指导或协助指导博士后、博士生及硕士生70余名。近四年主持了国家自然科学基金项目“RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究(编号30170412）”和“人卵泡抑素防治肝纤维化的实验研究(编号30170411)”的研究工作，项目组主要成员参与并完成以上研究工作。实验设计指导者、熟练技术人员及辅助人员等各司其职，可保障研究有条不紊的进行。新华医院消化内科系上海交通大学医学院（原上海第二医科大学）国家级重点学科和“211”工程重
19、点建设学科的组成单位之一，长期从事肝纤维化防治研究，先后承担包括国家自然科学基金在内的各级各类科研项目20余项。2005年7月，原上海第二医科大学与原上海交通大学合并，组建新的上海交通大学。作为上海交通大学的附属单位，将在科研究设备和技术上更方便的得到比以往更广泛的支持。4 本项目的特色与创新之处4.1 本课题首次尝试利用XXXXXXX构建HSC特异性受体调节药物靶向载体。将新型配体人工化学合成、受体调节药物靶向技术与新型脂质体载药技术三者结合应用于肝纤维化防治，有很强的原始创新性。4.2 本课题首次研究XXXXX生物小分子通过XXXXX与中药粉防己碱相联合，多途径、互补与协同防治肝纤维化。本
20、课题是利用分子机制指导中西药联合应用、构建中药靶向制剂提高疗效降低副作用和多途径协同作用抗肝纤维化的全新尝试，是在总结自身工作基础上进行的大胆设想与创新。5 年度研究计划及预期研究结果5.1 年度研究计划：略2007.01-2007.052007.06-2008.122008.01-2008.052008.06-2009.102008.11-2009.032009.04-2009.105.2 预期研究成果5.2.1 获得快速、有效和大量合成XXXXXXX和高药物包封率、高配体修饰率的稳定XXXXXXXX的技参数，并合成足量研究相关产物。5.2.2 体外研究证实XXXXXXXX。5.2.3 在体
21、内XXXXXXXXX，有效降低有效剂量、提高疗效和降低副作用。5.2.4 研究证实XXXXXXX可成为抗肝纤维化药物新剂型开发的有效载体。（二）研究基础与工作条件1 研究基础1.1既往肝纤维化防治理论和技术。自1981年以来，我们研究室长期从事肝纤维化防治研究，先后对钙拮抗剂、钙调蛋白拮抗剂、大黄素、激活素、肾素-血管紧张素系统及卵泡抑素等在肝纤维化发生发展中的作用进行了系列的研究，积累了较丰富的理论，掌握了相关研究技术。承担了包括国家自然科学基金在内的各类科研项目20多项，先后获省部级以上科技进步奖10项。1.2粉防己碱抗肝纤维化研究工作积累。项目负责人率先在我国开展钙拮抗剂尤其是中药粉防己
22、碱对肝纤维化防治研究，取得丰富的粉防己碱抗肝纤维化基础和临床研究成果，在国内外期刊发表相关论文50余篇，获省部级以上科技进步奖5项。近两年，我们在上海市教委基金项目“粉防己碱影响肝星状细胞活化信号分子研究（编号02BK14）”资助下完成了小剂量粉防己碱抗肝纤维化效果与机制的研究，在国内外首次报道小剂量粉防己碱可通过影响TGF-Smads信号通路抑制HSC活化，相关研究论文被SCI收录(收录号 IDS Number: 963XN)。该研究为指导粉防己碱在肝纤维化防治中应用有重要价值。（参见申请人简历及附件二、三）1.3生物小分子化学合成及脂质体构建相关工作基础。近四年来，申请人承担并完成了国家自
23、然科学基金项目“RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究（编号 30170412）”，化学合成了RGD-M6P，分子克隆构建pCI-RGD-Smad7并成功通过脂质体进行基因转染，通过体内外实验观察了RGD-M6P和pCI-RGD-Smad7的生物学效应。细胞及动物学实验均证实pCI-RGD-Smad7和RGD-M6P可减轻ECM沉积，并影响TGF-1和整合素表达强度和分布。主要研究工作由本项目组成员参与并完成。目前我们正在利用基金很少量结余款项进行合成RGD-M6P修饰SSL的工作。得益于此，他（她）们分别熟练掌握了生物小分子的化学合成相关技术（多肽合成、固相化反应、纳米技术、高效
24、分离技术等）、免疫组织与细胞化学技术、RT-PCR和定量PCR、蛋白印迹、高效液相分析、质谱分析、肝纤维化动物模型及生物信息学方法等与本课题相关的关键技术与方法（相关论文参见申请人简历）。由于以上的工作基础，我们拥有丰富的生物分子合成经验，成熟的生物分子构建技术和良好的人员与设备支持。已经构建成功的RGD-M6P及相关技术要领，可直接用于本课题。构思本课题的重要原因之一是探讨解决简单单一药物治疗中发现的诸多问题而开展的，密切相关的细胞学、动物学实验基础也是本实验成功的重要保证。2 工作条件2.1 新华医院消化内科设有校属的上海交通大学医学院消化系疾病第三研究室。实验室拥有本项目研究相关的大部分
25、生化、细胞生物学及分子生物学等方面的各种仪器设备，如倒置显微镜摄影设备、计数仪、CO2培养箱、酶联免疫测定仪、电转膜仪、低温冰箱、低温超速离心机及其它分子生物学设备等。2.2 上海交通大学医学院（原上海第二医科大学）附属新华医院科研中心与设立在新华医院的“211”工程重点建设单位上海市儿科医学研究所为本项目开展提供了仪器、技术支持和信息服务平台。我们可免费使用相关设备如层流无菌室、质谱仪、高效液相色谱仪、定量PCR仪、NICOMP Particle Sizer Model 3700分析系统、流式细胞仪和Flous-S MultiImage图像分析仪等，新华医院和学院均有SPF级的动物饲养条件。
26、3 申请人简历李定国，男，1946年9月出生。主任医师、研究员、教授和博士生导师。1981年和1989年分别获原上海第二医科大学医学硕士和医学博士学位。现任上海交通大学医学院消化系疾病第三研究室主任、上海交通大学医学院附属新华医院消化内科主任。兼任上海市内科学会委员和上海市消化病学会委员等职。本项目负责人长期从事肝纤维化防治研究，在抗肝纤维化中药筛选与机制研究、生物小分子合成、脂质体药物传递和基因转染、基因重组及基因治疗等方面有丰富研究经验。率先在我国开展钙拮抗剂尤其是中药粉防己碱对肝纤维化防治研究，取得丰富的粉防己碱抗肝纤维化基础和临床研究成果，在国内外期刊发表相关论文50余篇。先后承担包括
27、国家自然基金在内的各类科研项目15项，指导或协助指导博士后、博士生及硕士生70余名，获省部级以上科技进步奖10项。近四年主持了国家自然科学基金项目“RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究(编号30170412）”和“人卵泡抑素防治肝纤维化的实验研究(编号30170411)”的肝纤维化防治研究工作（以上2项目均已经顺利结题），指导完成上海市自然科学基金项目“Smad7和uPA双基因共表达对实验性肝纤维化的影响(编号03ZR14050)”和上海市教委基金项目“粉防己碱影响肝星状细胞活化信号分子研究（编号02BK14）”。近五年发表的与本课题相关论文（第一作者或通讯作者），其中一篇与本课
28、题设计密切相关的重要论著2005年发表于SCI索引源期刊“Journal of Ethnopharmacology”并被SCI收录（收录号 IDS Number: 963XN）（见附件二、三）： 1 李定国, 陈颖伟。肝纤维化研究现状及展望。上海第二医科大学学报 2005；25(2):101-6。（述评）2 Chen YW, Li DG, Wu JX, Chen YW, Lu HM. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factor-bet
29、a in vitro via up-regulation of Smad 7. J Ethnopharmacol 2005；100(3):299-305.（论著SCI收录号 IDS Number: 963XN）3 Chen YW, Wu JX, Chen YW, Li DG, Lu HM. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells in vitro via transforming growth factor-beta signaling. World J Gastroenterol 2005；11(19):29
30、22-6. （论著）4 陈源文, 李定国, 吴建新, 陈颖伟, 陆汉明。粉防己碱对大鼠肝星状细胞跨膜信号转导的影响。中华肝脏病杂志 2005；13(8):609-10。（论著）5 陈源文, 李定国, 吴建新, 陈颖伟, 陆汉明。粉防己碱上调Smad7表达抑制大鼠肝星状细胞活化。中国药理学通报 2005；21(5):563-7。（论著）6 王志荣, 陈锡美, 李定国, 魏红山, 黄新, 展玉涛, 汪余勤, 陆汉明。粉防己碱抑制肝纤维化大鼠肝组织c-fos和c-jun mRNA表达。上海医学 2003；26(5):332-6。（论著）7 王志荣, 李定国, 陈锡美, 魏红山, 黄新, 展玉涛, 徐
31、芹芳, 陆汉明。联合应用粉防己碱与甘草酸抗肝纤维化的实验研究。中华消化杂志 2003；23(7):435-6。（论著）8 王连升, 陈颖伟, 张建华, 李定国, 陆汉明。RGD-M6P对原代肝星状细胞的影响。上海第二医科大学学报 2005；25(2):112-5。（论著）9 杜学亮, 陈颖伟, 王连升, 徐芹芳, 李定国, 吴真。人工合成RGD小肽对肝星状细胞付泌细胞外基质的影响。放射免疫学杂志 2004；17(6):433-5。（论著）10 程计林, 周欣, 高志刚, 霍玉青, 徐芹芳, 李定国。外源性转化生长因子1与小鼠肝细胞Smad7 mRNA及蛋白表达的关系。中华医学杂志 2002；8
32、2(2):111-3。（论著）11 陈源文, 吴建新, 李定国, 陆汉明。转化生长因子-与转基因治疗肝纤维化。中华消化杂志 2002；22(10):621-3。（综述）12 程计林, 周欣, 李定国, 魏红山, 黄新, 王志荣, 展玉涛, 张晶, 徐芹芳, 陆汉明。RGDS肽对TGF刺激肝星状细胞分泌细胞外基质的影响。临床肝胆病杂志 2001；17(3):173-5。（论著）13 Wei FS, Li DG, Lu HM, Zhan YT, Wang ZR, Hang X, Xu QF. The role of enalapril in pathogenesis of CCL4 induced hepatic fibrosis. Journal of Shanghai Second Medical U
