1、CART技术与肿瘤精准免疫治疗CAR-T技术与肿瘤精准免疫治疗本文由爱康得生物原创2015年1月20日，美国总统奥巴马在国情咨文演讲中提出 精准医学计划” 一时间 精准医疗”成为一大热门词汇。在美国，精准医疗称为 Precision Medicine ”而早在百余年前的中国，中医就提出了 精准医疗”这一概念，称为 辩证施治”肿瘤又被称为多基因疾病，其发病机理，疾病发展过程，疾病病症与表现在个体之间差存在异。 肿瘤的发生因素很复杂，遗传因素，外环境与内环境以及体细胞与干细胞的 DNA损伤与修复，导致基因突变的逐步积累，最终演变为各种癌症的发生（图 1）。肿瘤发生的机理如基因突变，逆分化，肿瘤干
2、细胞，免疫监视，端粒与端粒酶等等还有太多的未知领域。 这些错综复杂的因素导致相同组织器官癌症引发的机理不一致，相同机理引发的癌症部位不一致。 肿瘤的发生往往有数千个突变类型，每个病人的突变类型不一样，所以传统的治疗模式出现了许多困惑， 如无法解释的耐药性，肿瘤基因组的异质性， 有效治疗响应监测手段的缺乏等， 在此时，精准治疗对于肿瘤的治疗十分重要。图1:肿瘤发生的复杂性。肿瘤的发生因素很复杂，遗传因素，外环境与内环境以及体细胞 与干细胞的DNA损伤与修复，导致基因突变的逐步积累，最终演变为各种癌症的发生。肿瘤精准免疫治疗发展当前，广泛用于肿瘤精准免疫治疗的药物为靶向药物和单克隆抗体， 其利用肿
3、瘤细胞与正常细胞之间分子生物学上的差异（包括基因、酶、信号转导等不同特性），抑制肿瘤细胞的生长增殖，最后使其死亡。如用于治疗非小细胞肺癌的易瑞沙和特罗凯， 用于治疗大肠癌的西妥昔单抗，用于治疗乳腺癌的曲妥珠单抗， 用于治疗前列腺癌伊马替尼等。 但肿瘤细胞十分狡猾，在靶向药物使用过程中， 肿瘤为躲避药物的作用会产生突变， 继而产生耐药使这 类药物失去效力，如易瑞沙平均耐药时间约 1年，特罗凯耐药时间还要更短些，大约在 8个月左右。耐药后肿瘤进展十分迅速，病人不得不重新寻找其他治疗方法。2013年是值得纪念的一年，科学杂志评论作为 2013年度最重要的科学突破的榜首癌症的免疫疗法。其中以程序性死亡
4、因子 1抗体（anti-PD1）及其它免疫检查点抗体和嵌 合抗原受体T细胞疗法（CAR-T疗法）最受瞩目。PD-1在恶性黑色素瘤和肺鳞癌的治疗获 得重大突破，被美国 FDA批准用于临床。CAR-T在B细胞恶性肿瘤的治疗获得巨大成功， ALL完全缓解率达到惊人的 90%。在此我们着重聊一聊 CAR-T免疫疗法。CAR-T免疫疗法是通过整合嵌合抗原受体的基因修饰的 T细胞来抵抗肿瘤细胞的疗法。嵌合抗原受体可以特异性识别肿瘤相关抗原靶点，识别结合后将激活增殖 T细胞的信号传递至胞内，引起 T细胞激活和增殖，从而有效杀伤肿瘤细胞。自 1989年以色列魏茨曼科学研究所免疫学家 ZeligEshhar将免
5、疫球蛋白scFv与Fc & RI受体（丫链）或CD3复合物（Z链） 胞内结构域融合并导入 T细胞制备出第一代 CAR-T以来，CAR-T经历了 20余年的发展（图 2）。CAR分子大致可分为5代演变：I代，特异性T细胞激活；II代，增加共刺激因子，提 高细胞毒性；III代，同时具有两个共刺激因子，提高 T细胞增殖能力与杀伤毒性；IV代，整合自杀基因，精确调控，细胞因子释放（如IL-7 , IL-15 ）激活等；V代，通用型CAR （图3)。PrdlinicJ:studies wth martsity 20 CAR-T cell3rd Generaiion in 1! palienl treal
6、ed witti liEl&d bb open orCAR 21,22 2nd gorKiraHon* CAR d recbed duiB Id open onHr2/ieu (coIm dimicallnate.govcaicinorneli (27 database图2: CAR-T的发展历程scFv图3: CAR分子的演变。I代，特异性T细胞激活；II代，增加共刺激因子，提高细胞毒性; III代，同时具有两个共刺激因子，提高T细胞增殖能力与杀伤毒性；IV代，整合自杀基因, 精确调控，细胞因子释放（如IL-7, IL-15 ）激活等；V代，通用型CAR。CAR-T临床试验疗效与毒性在血液恶
7、性肿瘤方面， 2014年UPenn利用CD19-CAR-T细胞治疗复发难治性 B-ALL，完全缓解率达 90% ;2015年ASCO会议，MSKCC公布一组数据，CD19-CAR-T治疗B-ALL，32例受试者有29例获完全缓解，CR率达91%。在治疗实体瘤方面，利用 HER2-CAR-T治疗HER2+肉瘤患者，共19例患者参与临床实验，输注 CAR-T细胞数量逐步升高，无明显CAR-T毒性，部分瘤内有少量T细胞浸润，4例稳定病情达12周14个月，中位生存期10.3 月（5.129.1个月）（图4）; Mesothelin是一个肿瘤相关抗原，在很多恶性胸膜间皮瘤中 广泛高表达。以 Meso为靶
8、点，通过在 T细胞上瞬时表达 CAR分子，经静脉回输外加瘤内 注射的方式对 2例入选患者进行治疗，未出现明显的副作用， CAR-T细胞在两例患者体内80 6040加 VNgZLglcs4 3 2 1 mvm HdgMjoCJBloodIWnor0 Blood20-0 10 20 X 40Time After Infusion monthsi图4： HER2-CAR-T治疗HER2+肉瘤患临床疗效观察。部分瘤内有少量 T细胞浸润，4例稳 定病情达12周14个月，中位生存期10.3月（5.129.1个月）图5:以Meso为靶点，通过在T细胞上瞬时表达CAR分子，经静脉回输外加瘤内注射的方 式对2例
9、入选患者进行治疗，未出现明显的副作用，CAR-T细胞在两例患者体内均体现了一 定的抗肿瘤活性，患者腹水中的 Mesothelin阳性的肿瘤细胞数量明显减少。接受CAR-T治疗的患者会出现毒性反应。如寒战，发热，白细胞减少，溶瘤综合症，巨噬细胞活化综合症，细胞因子风暴，B细胞缺乏及低丙种球蛋白血症， 脱靶效应（ontarget/offtumor）等。其中几乎所有接受 CAR-T细胞治疗并且出现应答的患者都会出现细胞因子风暴， 这与T细胞的激活直接相关，而肿瘤负荷影响细胞因子风暴的级别（分为 14级）。通过输注前化疗预处理，使用输注细胞剂量递增方案， 并严密监测血清相关指标， 如IL-6水平，C-
10、反应蛋白等。利用 IL-6拮抗剂如Tocilizumab可治疗严重细胞因子风暴，并且不会影响CAR-T疗效。脱靶效应常见于 CAR-T治疗实体瘤患者中，由于靶向抗原在正常组织中也低表达，导致 CAR-T细胞攻击人正常组织，如人肺组织会低表达 Her2，Her2-CAR-T细胞可引起致命的肺毒性。通过降低 scFv亲和力，局部瘤内注射，寻找肿瘤特异性抗原等方法来减少或避免这类毒性的发生。由此可见，目前 CAR-T细胞治疗还不够精准。CAR-T临床试验数据统计与治疗方案研究截至2015年10月，全球共计110项CAR-T临床试验在 ClinicalTrials.gov注册，其中大 部分为血液肿瘤的
11、临床试验，实体瘤占 38项，均为I川期临床试验（表1），血液肿瘤靶点 选择最多的是CD19,实体瘤主要靶点选择是 EGFR,GD2,CEA,Her2 （图6）。CenterTargetIndicationSignal transductioDBaylor College of Medicine氐卫血2亠 TumorsCD3 CD2SBavor College of MedicineHer2Advanced OsteosarcomaCD3 : CD2SNalional Cancer InstituteHer2Metastatic CancerCD3 : CD2SSavior College of
12、 Medicinetfei2Pleomorphic lioblastotnaCDS : CD鹑Chinese PL A General HospitalSolid tumorsCDS： 4-1EBBav；of College of Me di cineFfei2jlioblaswmaRoger WiBianms Medical CenterCEAColcrecral CancerCDS ： CD2SRjogr Willianms Medical CtnttrCEA3 re ast CancerCDS : CD28Roger Willianms Medical CtnttrCEAAdenocar
13、cixtoimCD3 1 CD28Southwest Hospitalh ChinaCEA事strig lung= pancreatic, breas md colorectalCRUKCEAlOlid tumorsN ARoger WiUianms Xledical CenterCEAiver metastasesCD3 CD28Baylor College of MedicineGD2MeuroblastoiiiaCD3 :CMHKCGD2MeuroblastomaN ANational Cancer InstituttGD2Mon-n tin oblas tomaCDHCD23 0X40
14、Baylor College ofMedicmeGD2SleurobkstomaCD3CCD23 0X40Baylor College of MedicineGD2SarcomaCD3 :CD23 0X40Tesas Children 5 HospitalGD2NEUROBLASTOMACenterTargetIndic adonSignal (ransductionAbramsco Ceucer Center, UPeoumesoeliiiMetastatic Pancreatic CDuctal Adfu&E arrinoma Epi the It al Charian C an cerl
15、h (说 i eh ant Epith扯 tai Pleural Mesotheliomi：D3 ； 4dBBAbrams on C enc er Center UPamMalignant mesothdioma；D3 : 4-1BBAbrams du C siicsr Centermes0elinfollcw-up cf C AR T-Mis oNational Cancer InstituteEGFRVmGEoblastomI . CD2S 4-IBBAbramson Cencer Ceurerh UPamEGFRVm&libU stoma11BB;TCR；Chinese PLA Gene
16、ral HospitalEGFRAch-mced EGFR+ tumors4 ： 4BBRaiJi hospital： ShaaghziEGFRMslinant GkoniaiKCLEjGFRHead =nd neck cancer:Dj ； CD2SSeaitl? Childrmtil HospitalEGFRCD171Nenfablastoma G anglco neurob lastomaRoea WiUianms Medical CaterPSMAPiostat* Canca；I CD2ihltmonal Slaan-Kfltering Cncei CenterPSMAPiostate
17、 Cancer2D3 ； CD23City of HopeMedttal CenttrILHRhJMalLznant diDm：2timul Cmccr Institute-EGFR2let astatic Cannr:DSplus ratUZFAPh lai tgn ant m es othd iom aMAAbrams cm. C enc er Centex,. UPamcMetBre ast CancerAbramsDn C aicer Center, UPennSSIPsncreatic CancerXatiDELal Cancer InstituteKY-ESO-Lpo5ito e
18、cancersX且noiial Cancer InstituteMAGE-A3RenJi hospital： ShanhnGFC3Advancfti HCC表1: CAR-T实体瘤临床试验在ClinicalTrials.gov注册情况（截至2015.10）图6:实体瘤靶向抗原选择比例图在临床试验中，血液肿瘤的 CAR-T治疗方案为：在获得临床试验批准后，首先根据入选与排除标准筛选受试者， 与受试者签署知情同意书后对其病情进行评估， 采集分离PBMC，经T细胞分选，CAR病毒感染，洗脱扩增，质控检测后收获 CAR-T细胞。在细胞输注前 4天完成化疗预处理。连续 3天按10%，30%，60%的剂量
19、递增方式输注 CAR-T细胞。输注后半年内月度随访和半年后的季度随访，以及 15年后的转基因跟踪。实体肿瘤的CAR-T治疗没有获得如血液肿瘤治疗后的惊人疗效。实体肿瘤的治疗情况相对复杂多变。首实体肿瘤致密结构特点阻碍了 CAR-T对肿瘤组织的浸润，导致实体瘤内部没有足够的T效应T细胞；再者肿瘤微环境中存在免疫负调节因素的制约，如免疫抑制性纟田胞的存在(regulatory T cells, myeloid derived suppressor cells, and M2 tumor-associated macrophages)，抑制性细胞因子(TGF- 3, IL-10)，肿瘤细胞表面表达的
20、 T细胞功能抑制性蛋白分子(B7-H family members, Fas ligand)，引导CAR-T向肿瘤灶归巢的趋化因子等。所 以，CAR-T细胞输注前患者预处理方案，如何让 CAR-T细胞在体内有效增殖并保持高杀瘤活性，如何使CAR-T细胞有效浸润在实体瘤内部等一系列问题尚待进一步研究。 如使用CT模拟定位三维适形放疗技术对实体瘤进行预处理，或用微创介入或瘤内注射的方式，使CAR-T细胞更多地进入到实体瘤内部对靶细胞进行有效杀伤。 另外可以将CAR-T负载溶瘤病毒以提高对实体瘤治疗的效果(详见 CAR-T细胞与溶瘤病毒联用一文)。小结精准医疗是未来疾病治疗的发展方向， 但是目前肿瘤
21、的精准治疗长路漫漫。 如果将肿瘤比喻为阴，免疫系统比喻为阳，则阴阳之间相互对立，相互统一，相互制约，消长与共(图7）。图7：肿瘤与免疫治疗之间相互对立，相互统一，相互制约，消长与共仅依靠细胞治疗肿瘤还远远不够。 手术，化疗，放疗可以迅速降低肿瘤负荷， 特异性治疗如CAR-T,TCR-T,抗体药物等可以迅速锁定并杀伤肿瘤细胞，但是肿瘤而且很容易产生突 变，使用非特异性治疗如 DC疫苗，免疫增强剂来清除残余的肿瘤细胞。随着基因测序，分 子生物学技术，影像技术，大数据等快速发展，肿瘤的精准治疗也会得到长足的发展，并成 为未来肿瘤综合治疗的主要模式。 不过在最后笔者认为，对于肿瘤，做到健康规律的生活方
22、式，高危人群定期进行健康体检，以预防为主，早发现，及时并且根据病情进行综合治疗， 方为正道。于是，渴望一种懂得，可以一眼洞穿你所有清寂的薄凉。是恰好的温度，闪耀着阳光的味道，柔软又美好。那么这一路上的爱恨欢愁也就有了归宿，以后的日子，既便是山长水远，也都会坦然面对，给尘世以最初的温柔。只是在某个清晨，听见久远的一声问候，心，依然会瞬间柔软。原来我们的内心深处，还是那么渴望一场白首不相离的缘分，千万次回眸，始终还是你。然后，一起守着古朴的时光，迎接每一天的黎明。弱水三千，只取一瓢饮，不褪色，不黯淡，任凭尘世的风摇曳着冬日的风雪，我始终是你最美的红颜，你是我最美的时光。不说永远，陪伴便是最长情的告
23、白。龙应台曾写过一段文字： 有一种寂寞，身边添一个可谈的人，或许就可以削减。有一种寂寞，茫茫天地之间余舟一芥的无边无际无着落，人只能各自孤独面对，素颜修行。 ”不同的寂寞有着不同的归途，其实赏心之人无须太多，关键是否能入心。始终喜欢，一切纯善质朴的好，不论是人还是事，一份情深义重，才是水色尘心的悠远。而一同走过的山山水水，都会是生命的记载。如果可以，愿始终趋光而行，向着太阳升起的地方。无论飘摇还是安逸，都要坚守住内心那道光，我们可以不完美，但灵魂必须向美而生。有时，灵犀的相悦会铭记一生，我不知道岁月有多长，人生还会有多少未知。只是希望自己能做个心思澄明，有着简单的小欢喜，不过多的忧思，也不给自己添加太多束缚的人。阳光很暖，你也还在，如此，足够。看多了花开花谢，聚散离合，便逐渐明白，我们最终想拥有的不过是一份寻常的烟火，简单而情重，朴素而感恩。
