1、16SrDNA鉴定细菌的方法16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。6.BLAST比对获取相似片段。7.构建系统进化树试剂：1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高压灭菌
2、后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1，pH大约下降0.03个单位。1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。1.4 10TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。 1TE Buffer用10TE Buffer稀释10倍即可。1.5 10%SDS（W/V）：称10g，68加热溶
3、解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65溶解。配置时要戴口罩。6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4保存。7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65溶解。8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。10、TAE缓冲液：使用液1：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50：
4、242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。11、6上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4保存。12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。13、EB：10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等）14、蛋白酶K：20 mg/ml
5、 溶于水，-20保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56。无需预处理。15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20。（为避免RNA的干扰，使用RNA酶降解基因组中的RNA。）1.1细菌基因组DNA提取基本步骤： 材料准备 破碎细胞或胞膜内容物释放 核酸分离、纯化 沉淀或吸附核酸，并去除杂质 核酸溶
6、解在适量缓冲液或水中基因组DNA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪细菌基因组DNA提取方法综述细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同。1 快速微量提取法取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。加两倍体积无水乙醇，1/
7、10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4保存备用。2 蛋白酶/SDS法制备用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次。将菌体充分悬浮在5ml 1TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50放置3h-5h。用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚
8、/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次。乙醇沉淀DNA。用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1TE或ddH2O中。3细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37摇床（300rpm）培养过液。细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。菌体裂解：加入6l 50mg/ml的溶菌酶，37作用2h。再加2mol/LNaCl50l，10%SDS 110l，20mg/ml的蛋白酶K 3l，50作用3h或37过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）。抽提：菌液均
9、分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚氯仿异戊醇(25241)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）。沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10。洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。抽（凉）干后，溶于50l ddH2O中，取2-5l电泳。作PCR模板用。4. DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERALGrow cells overnight in 500 ml broth medium.Pellet cells by centrifugation, a
10、nd resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA.Freeze cell suspension at -20CAdd 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min.Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K.
11、 Place in 50C water bath for 60 min.Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary.Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).Spool out DNA an
12、d transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C.Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube.Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (m
13、ix by inverting).Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTACheck purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis.5 CTAB/NaCl裂解法接两环菌（0.75ml甘油管菌液）于25ml LB培养基中，37、200r/min培养24h。取1.5ml菌液于1.5ml Eppendorf 离心管中，8000r/min离心5分钟,弃去上清。加入1.5ml TE离心洗涤后,用567 ul TE溶解菌体,混匀。加入
14、30l 10%SDS和3 ul 20 mg/ml的蛋白酶K（100 ug/ml），混匀，于37温育1h。加入100l 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80l CTAB/NaCl,混匀,65温育10分钟。加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)（0.8ml）,混匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。上清中加入等体积的酚氯仿异戊醇(25241)(0.8ml),混匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。加入0.6倍的异丙醇（0.48ml）,轻轻混合直到DNA沉淀下来（0.5h）,12000r/min离心15分钟,收集DNA沉淀,用75%乙醇(1ml)12000r/min离心5分钟洗
15、涤DNA沉淀，真空干燥0.5h。用50 ul双蒸水溶解DNA, 加入终浓度为20g/mlRNaseA，4保存。用0.6%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的DNA , 每孔点样6l (4l样品+ 2l loading buffer) , 80 V , 电泳1.5小时。2.设计选择引物进行16S rDNA的PCR扩增一般细菌鉴定选择通用引物，最常用的通用引物为27F/1492R。27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-31492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-32.1 实验原理2.1.1 PCR多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称技术，是年代
16、中期发展起来的一种体外扩增特异片段的技术。此法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的序列的拷贝，技术虽然问世仅数年时间， 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。技术实际上是模拟体内DNA合成过程，是在模板， 引物和种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促合反应，技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。 反应分三步：变性（denaturation）；退火（annealing）；延伸（ex tension），反应过程见图。PCR（Polymerase Chai
17、n Reaction) 的原理2.1.2 16SrDNA的核酸序列分析16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrRNA）的基因，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。16SrRNA的序列高度保守，可精确指示细菌之间的亲缘关系，16SrRNA的大小为1500bp左右，所含信息能反映生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元。目前常用的是建立在PCR技术基础上的16SrRNA基因的直接测序法，方便快捷。较之23SrDNA等看家基因而异，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石”之称。其序列包含10个可变区（variable region）和与之相同的11个恒定区（
18、constant region），可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。2.1.3 PCR法的操作过程Step 1: DNA热变性；Step 2: 引物退火；Step 3: 引物延伸2.2 PCR反应标准体系DNA模板 引物反应缓冲液dNTPddH2O耐热聚合酶2.2.1 PCR反应体系各组分的作用和使用量及反应条件v模板：反应中量在ngng左右。且纯度较高， 以增加反应特异性。vdNTP:反应体系中达100M200M。vMg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。v引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右
19、；含量在40 70之间；引物内部不能有回该序列；引物端不能互补。vTaq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性聚合酶，在时分钟还有活力。v变性温度：在之间使模板充分变性。v复性温度：左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定， 它是反应特异性的决定因素。v延伸温度：左右，为Taq酶最适反应温度。2.2.2 材料设备及试剂设备：eppendorf管、微量取液器、台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、PCR仪试剂：16SrDNA引物、细菌基因组DNA、Taq Plus、dNTP、PCR、冲液、琼脂糖、TAE电极缓冲液、Lamdar DNA/Hind、染色液、 加样缓冲液2.2.3 操作步骤
20、PCR反应 依次混匀下列试剂5l 10PCR反应缓冲液1l 4种dNTP 2l 上游引物（引物） 2l 下游引物（引物）1l 模板DNA 0.5l Taq DNA聚合酶38.5l H2O混匀后离心5秒。扩增：用94变性3分钟， 94变性1分钟，61退火1分钟, 72延伸1分钟, 循环30轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72下最后延伸5-10分钟，使反应产物扩增充分。电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，分析PCR产物电泳结果。3.用试剂盒做琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收目的片段用TaKaRa DNA纯化试剂盒对PCR扩增产物纯化4. 纯化后的目的片断送到测序公司测序也可以直接将电泳检测后的PCR产
21、物送到测序公司，让公司对产物进行纯化和测序5 .BLAST比对获取相似片段。将测序得到的16S rDNA序列在NCBI上进行blast比对，选择与比对序列相似度高的菌株。6.构建系统进化树将选择的序列与测序序列用DNAStar软件的MegAlign构建菌株系统进化树。如果要测16S rDNA的全序列长度则需要对PCR产物做T-A克隆。T-A克隆步骤：PCR 连接 转化 鉴定1.1 T-A克隆需要在PCR产物末端加A尾巴有些PCR聚合酶可以在产物末端加A尾巴，但并不是所有的聚合酶会加A尾巴，所以在克隆之前最好搞清楚使用的酶到底是否加A，否则克隆出来的白班太少，又要讨论很久。具有3到5外切酶活性的
22、高保真酶就不会产生A尾巴。产物末端加A步骤：用高保真酶扩增完之后，在反应管中加入0.7-1unit的Tap聚合酶。无需更换buffer期中的dATP已经够用。在72孵育8-10min。立即进行纯化，沉淀、跑胶、或用纯化试剂盒。这一点相当重要，否则高保真聚合酶会将A尾巴或T载体上的T尾巴切掉。1.2 将加A尾巴的PCR产物与T载体连接常用的T载体有Invitrogen的T载体；Promege的pGEM-T和TaKaRa的pMD18-T。1.3 将载体与目的片断的连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中进行液体摇床培养，涂平板进行蓝白斑挑选。1.4 对挑选的菌落提质粒，电泳检测大小，对正确的阳性克隆的质
23、粒进行酶切目的片断回收。目前对于T-A克隆技可以通过T-A克隆试剂盒来完成。细菌16S rDNA鉴定是应注意的问题和常见问题1 细胞裂解注意事项1.1材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低1.2选择适当的裂解处理方式1.3高温温浴室定时轻柔震荡2 核酸分离纯化2.1采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系。2.2采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。2.3 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。2.4针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法。3 核酸沉淀、溶解3.1当沉淀的时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分。3.2沉淀是
24、加入1/10体积的NaAc(PH5.2,3M)，有利于充分沉淀。3.3沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等。3.4晾干DNA，让乙醇充分挥发。3.5若长期储存建议用TE缓冲液溶解，TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase，TE缓冲液PH8.0可以防止DNA发生酸解。4 DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应4.1 DNA中含有蛋白，多糖，多酚类杂质：应重新纯化DNA，去除杂质。4.2 DNA在溶解前有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应：应重新沉淀DNA，让酒精充分挥发。4.3 DNA中残留有金属离子：应增加70%乙醇的洗涤次数（2-3次）。5 DNA提取量少5.1 实验
25、材料不佳或量少：应尽量选择新鲜的材料。5.2 破壁或裂解不充分：G+菌裂解前应先用生物酶或机械方式破壁；高温裂解时，时间适当延长5.3 沉淀不完全：低温沉淀，延长沉淀时间；加辅助物促进沉淀。5.4 洗涤DNA时丢失：洗涤时最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒。6 DNA降解6.1 未很好的抑制内源核酸酶的活性：可增加裂解液中螯合剂的含量。6.2 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断：细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。6.3 外源核酸酶污染：所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。6.4 反复冻融：将DNA分装，保存于缓冲液中，避免反复冻融。7 反应体系对PCR扩增的影响7.1 DNA模板：v纯度：蛋白
26、、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应v完整性： 模板降解会导致PCR扩增无产物v浓度： 加量过多导致非特异性扩增增加7.2 引物v特异性：长度适当、避免二级结构和二聚体v完整性：避免反复冻融v浓度：应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少7.3反应BuffervpH值,盐离子浓度v稳定剂,增强剂7.4 Mg 2浓度v过高非特异性严重v过低无扩增产物7.4dNTP Mixture v浓度适当v避免反复冻融7.5ddH2OvpH值适当v避免污染8 PCR常见问题与分析8.1 无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因：1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当
27、或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策：1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间8.2 非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高 5.退火温度偏低6.循环次数过多 对策：1.重新设计引物2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数
