1、大鼠蛛网膜下腔出血模型的研究进展中国试验动物学报大鼠蛛网膜下腔出血模型的研究进展高志1,2, 赵海苹1, 罗玉敏1, 曾现伟2 吉训明（1.首都医科大学宣武医院，脑血管病研究室，北京 100053；2.潍坊医学院附属医院神经外科，山东潍坊，261031） 【摘要】蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage, SAH）是一种具有极强危害性的出血性脑血管病，近年来，尽管在蛛网膜下腔出血的诊断和治疗方面取得了明显的进步，但其高死亡率和高致残率并未得到有效控制，原因在于其发病机制至今尚未完全阐明。因此，寻找一种理想的蛛网膜下腔出血动物模型将对其病理生理机制及临床防治的研究起到巨大的
2、推动作用。本文介绍了多种大鼠蛛网膜下腔出血模型的制作方法、优缺点以及应用范围，期望对今后SAH的基础与临床研究提供帮助。【关键词】蛛网膜下腔出血；大鼠；模型，动物Experimental Models of Subarachnoid Hemorrhage in the RatGAO Zhi1,2, ZHAO Hai-ping1, LUO Yu-min1,ZENG Xian-wei2 JI Xunming1（1.Cerebrovascular Diseases Research Institute, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Bei
3、jing 100053, China;2.Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Weifang Medical College, Weifang, Shandong 261031, China.）【Abstract】Subarachnoid hemorrhage(SAH) is a kind of hemorrhagic cerebrovascular disease，which causes serious damage. Recent decades have seen the significant progress in
4、diagnosis and treatment of subarachnoid hemorrhage(SAH), but the high mortality and high morbidity has not effectively been controlled. The major reason is that the pathogenesis of SAH still remains unclear until now. Therefore, establishing an ideal animal model of SAH will have an enormous advance
5、d effect on research of pathophysiologic mechanism, clinical prevention and cure of it. The author reviewed various establishment methods of rat models after SAH, and their advantages，disadvantages and application. Looking forward to help humans in basic and clinical research of SAH.【Key words】Subar
6、achnoid hemorrhage；Rat；Model, animal蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage, SAH）是临床常见的出血性脑血管病之一，虽然其发病率只占脑卒中的5%，但致残率却高达50，病死率为25，严重威胁人类生命1。近年来，尽管在SAH的诊断和治疗方面有了明显的的进步，但其高致残率和病死率并未得到很好的控制，主要原因在于SAH所造成的多种变化，如脑损害、颅内压改变、血管痉挛等一系列病理生理和分子机制尚未完全阐明。由于临床研究受到多种因素的限制，因此寻找和建立一种简单、可靠、稳定的动物模型成为研究的热点2。在各种SAH动物模型中，大鼠具有与人类相似的
7、脑血管解剖特点且价格低廉，可进行大量重复实验的特点，成为研究SAH较为理想的实验对象。本文就大鼠SAH模型的研究进展进行综述。1. 大鼠SAH模型的制备制作大鼠SAH模型的方法多种多样，通常采用以下三种方法：（1）脑池、脑室或蛛网膜下腔注血法；（2）颅内动脉穿刺或撕裂法；（3）动脉周围置血法3。1.1 脑池注血法 1.1.1 枕大池注血法（autologous blood injection into cisterna magna, ACM）1985年，Delgado等4最先报道这种SAH模型，基本方法是沿大鼠颈部皮肤中间线纵行剪开至枕外隆凸，钝性分离皮下软组织，暴露环枕膜，将通过尾动脉或股动
8、脉抽取的0.3 ml自体血注入枕大池造成SAH，然后将大鼠置于倾斜20度的平板上，并保持头低尾高位，通过脑血管造影可见SAH引发椎-基底动脉痉挛，死亡率为11.5%。随后这一模型得到广泛应用，Germano等5研究此模型发现SAH后动物未出现类似于临床的急性或迟发性的神经功能障碍症状，猜测这可能与大鼠脑内丰富的侧支循环作用有关。模型制作成功的2-3天后可在基底部蛛网膜下腔发现凝血块，以后血块逐渐被吸收6。枕大池单次注血法建立的大鼠模型可以较真实的模拟SAH的病理生理过程，操作简单，出血量易于控制，但该模型发生迟发性血管痉挛的概率不恒定，目前在研究中已被二次注血法取代。枕大池二次注血法（doub
9、le hemorrhage injection）对单次注血法进行了改良，有效的克服了单次注血法血管痉挛不恒定的缺点，适合应用于蛛网膜下腔出血后迟发性血管痉挛的研究，目前最为常用7。Suzuki等8最先报道了这种改进后的枕大池两次注射模型，第一次注血48小时后进行第二次注射，两次注血量均为0.3 ml，基底动脉会出现两次血管痉挛：第一次出现在10分钟后，第二次出现在SAH后的第57天9。尽管第二次注射血液时大鼠没有出现明显的神经功能缺损，然而第二次注射后第2、3和5天会出现显著的神经系统功能障碍，死亡率与单次注血法相差不大，约1.5%-47%。Dudhani等在此基础上对此法又进行了改良，对枕骨
10、下区域进行了更深步的解剖，更清楚的暴露出寰枕膜，用25号针头穿刺注血0.15 ml后停留30s拔出穿刺针，避免血液外渗，48小时候进行第二次注血0.15 ml，5天后通过组织切片发现注血组基底动脉管腔横截面面积明显小于生理盐水组，且死亡率较低7。但两次注血时对大鼠局部解剖结构进行了反复操作，加重了手术创伤，极易感染，且注血时由于颅内压增高，脑脊液及血液易沿穿刺处露出，相对缓解了颅高压，这是穿刺法存在的不足。孙保亮等9在前人的基础上对两次注血法进行了改良，针头刺破环枕膜后将消毒过的PE10管小心插入膜下1.5mm，用医用生物胶固定后进行第一次注血，术后可将PE管封闭，用缝线和动物胶固定于皮下组织
11、，48小时后剪开PE管进行第二次注射。该方法进一步减少了对大鼠的非必要性创伤，并且可以通过留置的PE管对颅内压进行动态监测。与单次注血法相比，两次注血法引起的脑血管痉挛更为严重，也更为持久，在与迟发性脑血管痉挛相关的研究中使用广泛。此种方法操作较简单，枕大池空间较大，颅内压升高相对缓慢，血液主要分布于后循环，脑水肿的程度较轻，血管痉挛以基底动脉为主，血脑屏障的通透性改变不明显，最主要特点是脑血管痉挛的时间特征与人类的比较接近，造模7天后仍然非常明显，因此适合对血管痉挛慢性阶段各种机制的研究。枕大池两次注血法被认为是较为成功的模型，但枕大池穿刺过程中可能损伤脑干，且二次注血增加了颅内感染的机会，
12、死亡率相对较高，不能很好的模拟人脑动脉瘤破裂后引起的除血管痉挛以外的病理生理改变，这是需要改进的地方。 1.1.2 视交叉池注血法（prechiasmatic cistern respectively, APC）关于大鼠视交叉池注血法的报道最早见于Piepgras的经视神经孔注血SAH模型10。制备方法是将大鼠麻醉固定，通过尾动脉或股动脉抽取0.3ml自体血，无菌操作下用4号穿刺针经右视神经孔穿入视交叉前池注入无抗凝自体血，一分钟内注完，同样可诱导产生脑血管痉挛，但程度较轻。与枕大池二次注血法相似，也可在第一次注血后的48、96小时重复操作，改良为二次或多次注血法，诱导的病理生理改变也更为明显
13、。近年来，通过开颅法建立视交叉池注血SAH模型应用较为多见11,12，操作方法是将麻醉好的大鼠固定于脑立体定位仪上，钝性分离肌肉和骨膜后暴露出冠状缝、失状缝及bregma点，取bregma点前7.5 mm稍偏右侧处做为钻孔部位，此处距离失状缝约0.4mm，以避免损伤上矢状窦13。用牙科钻钻一孔径为1.0 mm的圆孔，4号针头小心挑破脑膜后可见清亮脑脊液流出，将细导管沿矢状面前倾45度插入，至尖端达到颅窝底，距大脑表面约1.0 cm，用骨腊封住钻孔防止脑脊液流出。用注射泵20 s内将0.3 ml非肝素化的自体血缓慢注入蛛网膜下腔，试验完成后用医用生物胶封闭骨孔。SAH后大鼠出现轻微的认知功能障碍
14、，第三天左右会在脑干和Willis环的基底面发现凝血块，5-7天后血凝块逐渐被吸收，死亡率约为20%14。在临床上，自发性SAH的最主要病因是颅内动脉瘤，且大约90的SAH发生在前循环，通过观察实验后取出的脑标本大体可以看出血液含量变异较小，比较恒定地分布于颅前窝底和基底池，与人脑动脉瘤破裂后造成的SAH血液分布相似；脑损害较轻，脑水肿不明显，血管痉挛主要发生在大脑前动脉，类似于临床上常见的前循环动脉瘤破裂的病理过程，因此适合研究前循环动脉瘤造成SAH的病理生理机制及脑血管痉挛的发病机制。由于该模型需要开颅操作，容易损伤脑组织，且开颅引起颅内压的变化，与人类SAH颅腔闭合的特点相悖。 在脑池注
15、血法模型探索中研究人员发现，血液注入脑池后产生的压力应与SAH后动脉血涌入蛛网膜下腔所产生的压力值相近，此时的压力值大约是正常颅内压的20-40倍15。根据大鼠SAH后压力值的是否恒定，脑池注入法模型可分为容量控制型和压力控制型。前者所需的注射压力可通过调整注入血液的体积和注射时间来调控，但注射过程中压力不恒定，且不易控制。而后者可通过使用注射泵来控制，保持颅内压力的恒定（一般在平均动脉压水平），注射血液过程中压力水平保持恒定不变，模型的脑血流量不受影响，在蛛网膜下腔出血停止原因的研究中应用较多16。需要注意的是大脑动脉会受到血管周围肾上腺素能神经支配的影响，特别是在对脑血管痉挛的反应性上，这
16、种影响在血液注射模型中容易被忽视17。 1.2 颅内动脉穿刺法（puncture of intracranial artery, PIC）1979年，Barry等18最先报道了颅内动脉穿刺法大鼠SAH模型，主要用来研究SAH后引起的血管痉挛，去除骨瓣后经斜坡暴露基底动脉，显微镜下采用立体定向技术用钨微电极刺破基底动脉造成SAH，术后第2天血管痉挛明显，3 d后蛛网膜下腔内的血凝块也被完全吸收。此法需行开颅手术，手术创伤大，死亡率高，目前很少应用。自发性蛛网膜下腔出血80一90发生于颈内动脉系统，尤其是Willis环的血管分叉处。1995年Bederson和Veelken针对ZeaLonga法脑
17、缺血模型进行改良，建立了血管内线穿刺法，一直沿用至今19, 20。其基本方法是取颈部正中切口，显微镜下暴露一侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，分离颈外动脉近分叉处的分支甲状腺上动脉和枕动脉并电凝，分离结扎并切断颈外动脉，用锐化后的尼龙线经颈外动脉导人颈内动脉的颅内段，有小的阻力感后再插人约2 mm刺破颈内动脉分叉部，抽出尼龙线即可形成大鼠蛛网膜下腔出血模型。造模后2小时可发现蛛网膜下腔有明显出血，范围累及整个Willis环；造模后48小时可见陈旧性血凝块附着在Willis环周围，通过测定基底动脉直径发现基底动脉出现痉挛。出血量的多少可通过改变尼龙丝尖端直径的大小来控制21，手术方法简单可靠，动脉
18、管壁的损伤和血流对脑组织的直接冲击作用都真实的模拟了临床上颅内动脉瘸破裂导致的SAH，出血时造成的颅内压突然持续上升与人类动脉瘤破裂后颅内压升高的实际情况类似，血管痉挛的程度也较为显著。这种模型的缺点在于SAH后24小时内的死亡率高达37.5到5022, 23，手术过程中出血量变化较大，血液的分布不可控制，容易造成脑实质出血。术后大鼠脑水肿严重，血-脑屏障破坏明显，同时颅底各血管均可发生明显血管痉挛，该方法制作的模型与临床上重型SAH病人（Hunt-Hess分级级）比较接近，因此适合对SAH后脑损害、血管痉挛等发病机制的研究。众多研究表明该模型还需要进一步完善，以控制高死亡率24。 1.3 动
19、脉周围置血法（clot placement） 该方法在制备大型动物如猴、狗的SAH模型中应用较多，而在啮齿类动物上则应用较少25。通过开颅手术暴露实验动脉，在动脉周围放置自体抗凝血或类似的血制品，同时显微镜下观察该动脉直径及血管壁厚度的变化，作为SAH后脑血管痉挛的监测指标。该方法的优点在于能使血液与实验动脉保持长时间直接接触，动态观察SAH后脑血管的变化。缺点是开颅手术复杂，创伤大，与临床上SAH后颅内压的增加不相符，且局限于研究SAH后脑血管痉挛，应用范围较窄。 2. 神经行为学评价大鼠发生SAH后引起的血管痉挛和脑损伤会引起相关的行为缺损，根据损伤部位及程度的不同，可表现为运动、感觉功能
20、障碍，认知、学习及记忆功能受损，通过神经行为学的评价可反映脑损伤及后期恢复的程度，并可作为判断造模是否成功的标志26。2.1 平衡木实验平衡木实验广泛用于评估脑外伤，蛛网膜下腔出血和脑缺血等动物模型的运动和平衡功能。常用方法是距地面40 cm的高度水平放置宽度和高度分别为1.5 cm、2.5 cm的木条，木条下放置泡沫垫，以减轻大鼠跌落后的损伤。将大鼠放置在木条的中央，记录动物在木条上坚持的时间，最高为120 s，可多次测量取平均值，时间越短，神经功能损伤越严重。另外也可以通过记录大鼠走完木条所用的时间及大鼠行走过程中失误次数和前后肢使用率进行评分，研究表明，大鼠SAH术后与术前相比通过木条的
21、时间延长，失误次数增加，术后1-4天尤为明显，以第一天为甚27。该方法从运动，平衡，记忆及注意力等方面对SAH大鼠进行了综合性评价，针对性强，且操作简单。存在的不足是没有完全标准化，所用木条的长度、宽度、形状均未统一，且敏感性较差。2.2 水迷宫实验测试大鼠学习、记忆功能的方法很多，而Morris水迷宫实验最常使用28。将测试平台置于迷宫中的某一象限，大鼠随机放于任一象限，依靠其记忆爬上平台，其损伤程度可用找平台所需的时间进行量化，若找不到可将其放于平台15 s后重新测试，为增加难度，平台的位置可每天变化29。Silasi等在其研究中应用动脉穿刺法制备模型，术后3-21天观察发现SAH组大鼠在
22、Morris水迷宫实验中表现出轻微的认知功能障碍，随着观察时间的延长，游泳距离和游泳速度都出现了较为明显的变化，可作为长期监测的指标。 研究人员猜测这可能与大脑皮层和海马内神经元的数量有关30。2.3 综合评分法Kaoutzanis等31提出的神经行为学评分量表最先应用于犬的SAH模型，后经改良应用于大鼠，它分别从运动反应、睁眼反应和进食情况对大鼠进行评价。最低3分，状态最差；最高11分，完全正常，可挑选术前、术后24 h、48 h等不同时间点对大鼠进行评分，综合性较强。Katz等32提出的100分法最先用于大鼠全脑缺血模型，应用较为广泛，有研究表明它对于大鼠SAH后的神经功能评价同样有效33
23、。该方法从一般行为学，颅神经反射，运动和感觉功能及协调能力等四个方面来评定大鼠SAH后神经功能损伤的程度，满分100分，得分越高，神经功能损伤越严重。蛛网膜下腔出血后的脑损伤并不局限于某一区域，引起的神经功能障碍也较为广泛，此法可通过量化的方式评估术后动物的神经功能状态，操作简便，无需额外的工具。由于该测试中一些指标出现异常后恢复较快，在SAH急性期内应用可信度较高，不宜作为长期监测的指标。迄今为止，蛛网膜下腔出血造成的多种变化，如脑实质损害、颅内压改变、血管痉挛等一系列病理生理和分子生物学机制尚未完全阐明，理想的动物模型可为SAH的研究提供有力的帮助。以上对几种常见的大鼠SAH模型及神经行为
24、学评价进行了综述，各种模型均存在自己的不足，如枕大池二次注血法虽然应用广泛，但仅限于SAH后脑血管痉挛的研究；颅内动脉穿刺法真实的模拟了临床上SAH的发病过程，但损伤太重，死亡率太高。随着对各种动物模型了解的加深，相信会建立一种趋于完美的大鼠SAH模型和完善的后期评价，真正的使动物实验服务于临床，这对深入研究SAH的病理生理学机制及治疗方案的选择都具有重要意义。参考文献1 van Gijn J.Kerr RS，Rinkel GJSubarachnoid hemorrhageJLancet2007；369(9558)：3063182 Suarez JI; Tarr RW; Selman WR.
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