1、PCR技术综述摘要：PCR（polymerase chain reaction）即聚合酶链式反应，是一种通过体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。本文主要针对PCR的概念，原理和方法，简要介绍常用的PCR相关技术及其原理，方法及应用。关键词：PCR；原理；应用及展望聚合酶链式反应（polymerase chain reaction），简称PCR，又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由变性、退火及延伸等反应构成一个周期，可循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有高特异性、高度灵敏性、高丰产量等特点，此方法在分子生物学、微生物学
2、、医学及遗传学等多领域都被广泛应用。1、PCR技术发展史上个世纪60年代末，人们开始致力于基因体外分离技术的研究，但由于核酸含量较少，大大限制了DNA的体外操作。Khorana在1971年最早提出了核酸体外扩增的设想，DNA经变性之后与合适的引物杂交，再用DNA聚合酶延伸引物，不断重复该过程就可以克隆出tRNA基因。但是，由于当时的基因序列分析方法不是很成熟，热稳定性较强的DNA聚合酶也还没有发现，相关引物的合成处在手工合成阶段，所以这种想法没有什么实际意义。1985年，美国科学家Kary Mullis在高速路的启发下，经过两年努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技
3、术的第一篇学术论文。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供了合适的条件模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶和合适的缓冲体系。自此，PCR技术得到了生命科学界的一致认可，Kary Mullis也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。然而，最开始的PCR技术还很不成熟，在那个时候是一种操作复杂、成本高昂的实验室技术。直到Saiki等人从一种嗜热杆菌提取到一种耐热DNA聚合酶，才使得PCR的扩增效率得以提高，PCR技术也开始得到广泛应用，成为遗传与分子生物学分析的根本基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：从定性发展到定量；从原先只能扩增几个kb到目前已能扩增几十个k
4、b的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多。2、PCR技术原理基本PCR条件：1、DNA模板(Template)，2、引物(Primers)，3、DNA聚合酶(Polymearse)，4、合成的原料及水。PCR的反应包括三个主要步骤，分别是：Denaturation、Annealing，and Extension。Denaturing即将DNA加热变性转为单链DNA作为复制的模板；而Annealing则是令引物于一定的温度下附着于模板DNA两端，最后在DNA聚合酶的作用下进行引物的延长(Extension of primers)及另一条链的合成。PCR反应步骤简单，但是具体操作复杂，
5、如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，避免假阴性或假阳性等情况的产生。3、PCR技术的分类31 实时荧光定量PCR技术（real-time PCR）学者经研究在1996年首创了实时荧光PCR技术，现已应用于医学、分子生物学和其他基础研究领域。该技术基于传统技术的优势，同时具有实时性、准确性、无污染，还实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃。荧光定量PCR技术的最大特点是将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助荧光信号的累积，实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知样品进行定量分析。一个PCR循环反应结束之后，
6、定量PCR仪就可以收集一个荧光信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化，这样就可以得到一条荧光扩增曲线。32 多重PCR技术（mutiplex PCR）多重PCR技术，即在同一管中加入多对特异性引物，与管内的多个模板反应，可同时检测多个目标DNA。多重PCR可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段14。在同一反应体系中，进行多个位点的特异性扩增时，引物之间的配对以及引物间的竞争性扩增等都会对扩增产生影响。若能选择适宜的反应体系和反应条件，就可极大地提高多重PCR的扩增效果，比如退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。33 单分子PC
7、R技术（SM-PCR）单分子PCR技术与传统PCR技术相比，其基本循环过程是一样的，但在反应条件、模板数量、DNA聚合酶选择和引物设计方面有不同，是以少量或单个DNA分子为模板的PCR。在单分子PCR技术反应中，DNA模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量，这也是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应严格控制Gc含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。（在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物。）由于单分子PCR反应的变性温度（96-98）比常规PCR（94）略高，因而对DNA聚合酶热稳定性的要求也更严格，需要
8、较好的热稳定性。其变性时间（5-15s）、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术。34 数字PCR技术（digital PCR，dPCR）最后要特别介绍的是数字PCR技术，它是近年来引起重视并迅速发展起来的一种突破性的定量分析技术，包括两部分内容PCR扩增和荧光信号分析。在PCR扩增阶段，数字PCR先将样品稀释到单分子水平，再平均分配到几十乃至几万个单元中进行反应。与定量分析PCR对每个循环进行实时荧光测定的方法不同，数字PCR是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集，有荧光信号标记为1，无标记为0，有荧光信号的反应单元中至少含一个拷贝。所以理论上，在样品中目标DNA浓度极低的情况下，有
9、荧光信号的反应单元数目等于目标DNA分子的拷贝数。但是，通常每个反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子，就需要使用泊松概率分布函数进行计算，根据反应单元总数、有荧光信号单元数以及样品稀释系数，就可以得到样本的最初拷贝数(浓度)。数字PCR通过终点检测计算目标序列的拷贝数，不需要采用内参和标准曲线；此外，由于数字PCR采用终点检测，因此也不依赖于Ct值，受扩增效率的影响就大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力也大大提高，具有很高的准确度和重现性。而且在数字PCR标准反应体系分配的过程(稀释过程)能够极大的降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也适用于在复杂背景中检测稀有
10、突变。4、PCR技术的应用4.1 PCR在食品行业检测PCR技术在食品行业主要用于微生物含量的检测。传统方法检测食品中致病菌的步骤繁琐费时，需经富集、分离、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定以及必要的动物试验等过程，并且传统方法无法对那些难以人工培养的微生物进行检测。对肉制品的检验，蛋白质鉴定技术已经成功运用于鉴别生鲜肉类的品种，但当食品中的肉类经切碎、蒸煮、熏烤等加工后，失去了原有的形态学特征和质地，从而破坏物种特有的蛋白质和抗原决定部位。所以，蛋白质鉴定肉类品种的稳定性和可靠性较差，已不能满足现代肉类安全检测的要求。使用PCR技术建立检测清真食品中是否含有猪肉或猪油的方法，物种特异性P
11、CR技术可以用于清真食品的鉴定，是一种可以信赖和合适的技术。4.2 PCR在医学中的应用在临床医学方面也经常使用PCR技术，如对乙肝病毒、肿瘤等的检测。PCR技术在肿瘤病毒病因、肿瘤相关基因、肿瘤相关抑癌基因等研究方面已经取得了可喜的成果。同时PCR技术也被用于多点突变遗传病的检测。PCR在法学中已应用于亲子鉴定，血型鉴别以及指纹鉴别等。如对血迹，无法用传统血清学的方法进行血型检验时，就可采用PCR方法检验ABO和MN血型。4.2.1 PCR在肿瘤诊断上的应用遗传学改变主要是引起癌基因激活和抑癌基因失活，使基因发生突变、缺失、增加和易位等而导致了细胞癌变。PCR不但能有效地检测基因的突变、重排
12、、易位等，而且能准确检测癌基因表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、鉴别、分型、分期及预后评估等。目前用于肿瘤检测的PCR主要有定量RT-PCR，它在肿瘤诊断、治疗等方面具有广泛的应用价值。4.2.2 PCR在遗传病诊断上的应用十几年来，该技术在遗传病诊断的临床应用方面获得了极大的成功，如地中海贫血、血友病、杜氏肌营养不良症、脆性x综合症、苯丙酮尿症、Turner综合征等这些遗传病都可以通过PCR技术进行扩增，然后利用基因分析直接检测出突变位点。4.2.3 PCR在感染性疾病方面的应用目前PCR在医学检验中对感染性疾病的诊断极具突出，只要核酸序列是清楚的，就可以检测到任何有限的病原体，从而判断疾病是
13、否处于隐性或亚临床状态。4.3 PCR在应用水中的检测1990年，Bejetal在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。而对于水中得而大部分细菌，通常采用分离培养来鉴定它们弄得种类和数量，但是分离方法和培养基的选项额是限制检测效率的问题所在，使得一部分细菌由于不能在人工培养基上生长，使得鉴定的细菌种类和数量低于环境中的实际值。因此运用PCR技术可对水体进行直接检测，缩短检测时间，扩大检测范围，并且具有较高的精确度。同时也可以反映水环境中微生物病原体的种类及多样性。4.4 PCR
14、技术在农业中的应用4.4.1 PCR在转基因产品检测中的应用目前，研究者已经利用PCR技术成功建立了检测转基因马铃薯、大豆和玉米的技术路线，对转基因大豆和玉米的检测低限分别到达了1和0.1。4.4.2 PCR在研究植作物生长发育方面的作用植物的生长、发育、分化和衰老都涉及基因的时空顺序表达，因此研究这个过程中基因表达的变化是揭示生长发育机理的重要手段。RT-PCR（逆转录）是研究植物基因表达水平变化的一项重要技术。通过研究不同植物或同一植物不同发育时期的基因表达水平来揭示植物生长发育的机理。4.4.3 PCR在作物抗病性基因分析、定位中的应用在作物病害研究中，作物抗病性及其机制研究一直是当今作
15、物病理学和作物抗病育种中的热点和难点。我们现在已知作物对病原物的抗性是由相对的基因所控制的，即基因对基因理论。因此，寻找与作物抗病性紧密连锁的基因标记的研究中有十分重要的理论意义和实践意义。利用PCR和RAPD（分子标记）技术能够找到与抗性紧密连锁的分子标记，并将其进行定位。4.5 PCR技术在非生物学中的应用DNA的初级结构核苷酸序列具有极其丰富的信息含量，利用PCR扩增，可以从非常少的DNA原始材料中获取信息。在对伪造产品的检测和污染源的追踪调查等方面，都可通过PCR来鉴定。此外，它还可用于遗传图谱构建、器官移植的组织类型鉴定和检测转基因动植物中的植入基因等领域，使人类基因重组成为可能。科
16、学家们还在继续尝试扩增来自更稀有、更陌生样品的序列。总之，PCR作为一项“革命性的新技术”不仅推动了分子生物学及相关学科的发展，而且还为相应的产业提供一片广阔的“天空”，将在商业领域中占有重要领地。5、展望传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛地应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并被广泛应用。未来的研究主要会集中在PCR全自动化和去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来有非常好的应用前景。参考文献1常世敏.PCR 在食品微生物检测中的应用J.邯郸农业高等专科学校学报，20
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