1、万寿菊植物不同部位中光活化成分a三联噻吩在不同生长期的含量概述万寿菊植物不同部位中光活化成分a三联噻吩在不同生长期的含量莫卓群 杨 华 管金星 （长沙今草生物科技有限公司 湖南 长沙 410000）摘要： a-三联噻吩（a-T）是一种光活化杀虫剂，它是一种优良的光活化毒素。本文采用高效液相色谱法对陕西西安地区万寿菊同一品种的根、茎、叶、花柄、花、根乙醇提取物在不同生长时期连续4年时间的aT含量测定。方法： 采用Phenomenex prodigy 5m ODS3 100A (4.6 mm250 mm,5m)色谱柱，流动相为甲醇水（85:15），流速1.0ml/min，检测波长351nm，柱温3
2、5。结果：aT进样量在0.0495 2.475g（R2=0.9995）与峰面积呈线性关系；平均回收率（n=6）为101.07%。结论：本方法具有较高的灵敏度和较好的重现性，快速便捷，专属性强，结果准确，适用于万寿菊及其根乙醇提取物中a-T的含量测定。结果显示根的含量最高，其次是花柄、花、叶，含量最低的是茎；不同生长期根的aT含量差异显著，7月含量最高，9月最低。花柄和花8月含量高。茎的含量很低，含量变化不明显。根乙醇提取物含量随根含量变化而变化，产率7月份的最高。万寿菊花的采集时期在89月为最佳，也就是在植物盛花末采集。关键词：万寿菊 a-三联噻吩 光活化杀虫剂 反相高效液相色谱 万寿菊(Ta
3、getes erecta L)，又名：金盏花（Marigold）, 臭芙蓉，菊科、万寿菊属，一年生草本，高50150厘米；茎直立，粗壮，具纵细条棱，分枝向上平展；叶羽状分裂，长510cm，宽48cm，裂片长椭圆形或披针形，边缘具锐锯齿，上部叶裂片的齿端有长细芒，沿叶缘有少数腺体，基部收缩成长爪，顶端微弯缺；头状花序单生，管状花花冠黄色，花期7-9月；原产墨西哥，我国各地均有栽培。可生长在海拔1,150米至1,480米的地区，多生在路边草甸。万寿菊常于春天播种，花大、花期长，常用于花坛布景，可供观赏。根：苦、凉；解毒消肿，用于上呼吸道感染，百日咳，支气管炎，眼角膜炎，咽炎，口腔炎，牙痛。叶：甘，
4、寒；用于痈、疮、疖、疔，无名肿毒。花序：苦，凉，平肝解热，祛风化痰，用于头晕目眩，头风眼痛，小儿惊风，感冒咳嗽，顿咳，乳痛，痄腮。花：清热解毒，化痰止咳，有香味，可作芳香剂，曾用作抑菌、镇静、解痉剂。我国万寿菊的种植面积较广，万寿菊花花朵盛茂，产花率极高，花中叶黄素含量很高1，主要用来提取叶黄素，是提炼叶黄素及类胡萝卜素的主要原料；叶中的精油可用来杀没灭瓜果的腐霉病；其根含有黄酮、生物碱和特殊的活性物质而备受重视，成为从2400种记载的控害植物中挑选出来的43种广谱控害植物之一，被誉为“控害植物精华”2。万寿菊的根提取物对小菜娥（Plutella xylostelle）、欧洲玉米螟（Ostri
5、nia nubilalis）、烟草天蛾（Manduca sexta ）、白纹伊蚊（Aedes albopictus）3、埃及库蚊（A.aegypti）、中华按蚊（Anopheles sinensis）、谷蠢（Rhizonertha dominica）、黄粉甲（Tenebrio molitor）、山楂叶螨（Tetranychus viennensis）等有较好的毒杀活性，并且以光活化活性为主3，4，12。万寿菊的根提取物对多种线虫的杀虫活性的主要杀虫活性成分是噻吩类物质，其中的主要物质是BBT、BBTOAc、BBTOH和a-三联噻吩5，13；（aT）在所有器官（根、茎、叶、花）有都存在14。aT
6、是一种光活化杀虫剂【6,8】，它是一种优良的光活化毒素，在光照时其杀虫活性成几十倍的提高11。AT在阳光下的半衰期为4h，发挥杀虫作用的过程也是活性成分本身降解的过程，不会在环境中持久残留，被称为“绿色农药光活化农药”7。因植物性杀虫剂的来源受到地域、季节、土地资源、生态条件、气候等诸多因素的制约，因此不同地区种植的不同品种的万寿菊其有效成分含量不同9。长沙今草生物科技有限公司和陕西西安地区某万寿菊种植基地从2011年开始研究万寿菊的种植和综合开发。本文以陕西西安地区某万寿菊种植基地种植的万寿菊为研究试材，采用高效液相色谱法测定了2012年至2015年四年时间同一品种的根、茎、叶、花柄、花和根
7、乙醇提取物在不同生长时期（采样日期为每月20日）中aT的含量10，为综合开发利用万寿菊和工业化生产提供支持。1仪器和试药1.1 主要仪器Agilent 1260仪（G1311B，VWD：G1314F，7725i进样器，ChemStation中文色谱数据工作站），MS105DU电子天平（Mettler，0.01mg），FA1104 电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司，0.1mg），KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），LU5A5-PCP-2A反渗透净水机（深圳立昇净水科技有限公司），SYZ-550型石英亚沸高纯水蒸馏器（江苏省金坛市白塔石英玻仪厂），RE-3000A旋转蒸发
8、器（上海亚荣生化仪器厂），GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），DZF-6020MBE真空干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），SHB-III循环水式真空泵（郑州长城科工贸有限公司），B-220可调恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂），JJ-1.25W精密增力电动搅拌器（常州国华电器有限公司），GY-10A 500克多功能粉碎机（江西赣州市客家大道180号），酒精计。1.2 化学试剂甲醇为色谱纯（Spectrum HPLC Grade），乙醇等其余试剂均为分析纯，水为超纯水。aT对照品（纯度99.0%,美国Aldrich公司）。万寿菊（整株）采自陕西西安某万寿
9、菊栽培基地。万寿菊根乙醇提取物自制。2 方法2.1 对照品溶液的制备精密称取T对照品1.25mg（精确至0.01mg），置于50ml棕色容量瓶中，加入色谱纯甲醇约45ml，超声（功率300W，40KHz）溶解20min，溶解完全后，冷却至室温，加甲醇定容，充分摇匀。使用时过0.45m滤膜即可(对照品浓度24.75g/ml)，备用。2.2 供试品溶液的制备2.2.1 原药材供试品溶液的制备 每次随机摘取30株万寿菊，清洗泥沙等杂物，阴凉处沥干水分，将每株的根、茎、叶、花柄（序）、花分别整理后合并，分别在3538电热鼓风干燥箱中干燥48.0h，冷却至室温，粉碎，过60目筛，得万寿菊原药材各部位供试
10、样品。取10.0g供试样品在105条件下恒温8.0h测定水分。 精密称取万寿菊原药材各部位供试样品2.5g（精确至0.01mg），置于50ml棕色容量瓶中，加入甲醇（A.R.）约45ml，超声（功率300W，40KHz）提取40min，冷却至室温，加甲醇定容，充分摇匀。过0.45m滤膜即可。2.2.2 万寿菊根乙醇提取物供试品溶液的制备 精密称取过60目筛的根乙醇提取物80.0mg（精确至0.01mg），置于50ml棕色容量瓶中，加入甲醇（A.R.）约45ml，超声（功率300W，40KHz）溶解20min，冷却至室温，加甲醇定容，充分摇匀。过0.45m滤膜即可。 2.3 检测波长的选择 采用
11、PAD检测器对1g/mL的aT在流动性中在190nm400nm扫描，a-T最大吸收波长为352nm，选择351nm为检测波长，信噪比高，极限稳定，待测组分峰形对称。2.4 色谱条件 Phenomenex prodigy 5m ODS3 100A(4.6 mm250 mm,5m)色谱柱，流动相为甲醇水（85:15，V甲醇/V水），流速1.0ml/min，检测波长351nm，柱温35，进样量10.0L，采用外标法定量分析。aT理论塔板数大于5000，对称因子为0.99。对照品及供试品色谱图见图2。 图2 aT对照品、万寿菊根（2013年8月）和万寿菊根乙醇提取物（2013年8月）HPLC2.5 万
12、寿菊根乙醇提取物的制备 称取过60目筛的万寿菊根样品100.0g（精确至0.1g），置于1000ml三颈圆底烧瓶中，第次加入70%乙醇水溶液700mL，浸提8.0h，然后在搅拌下65提取1.5h，冷却至40抽滤；滤渣进行第次提取，加入70%乙醇水溶液500mL，搅拌下65提取1.5h，冷却至40抽滤；滤渣进行第次提取，加入70%乙醇水溶液400mL，搅拌下65提取1.0h，冷却至40抽滤。 合并提取滤液，在60，P-0.095MPa下回收乙醇完全，置7580，P-0.095MPa真空干燥至水分小于1.0%，取出置干燥器中冷却，粉碎过60目筛 ，得万寿菊根乙醇提取物。2.6 测定 在上述色谱条件
13、下，待仪器稳定后，先注入数针对照品溶液，计算各针峰面积，直至对照品溶液峰面积变化小于1.0%，按照标样、试样、试样、标样的顺序测定。2.6.1 aT的含量测定按下式计算 AT含量% = （A样M标N标%）/（A标M样） 100% 式中： A样 样品溶液样品的峰面积； A标 对照品溶液对照品的峰面积； M样 样品的质量（mg）； M标 对照品的质量（mg）； N标% 对照品的质量百分含量（%）。2.6.2 样品中aT含量% = AT含量% /（100（%）水分含量（%）100%。2.7 允许差 每个样品平行测定3次，其结果之差应小于0.5%，取平均值作为测定结果。2.8 标准曲线的测定精密称取T
14、对照品12.5mg（精确至0.01mg），置于50ml棕色容量瓶中，加入色谱纯甲醇约45ml，超声（功率300W，40KHz）溶解20min，溶解完全后，冷却至室温，加甲醇定容，充分摇匀 (对照品浓度247.5g/ml)。准确吸取对照品溶液各0.2mL，1.0mL，2.0mL，4.0mL，6.0Ml,10.0mL于10ml棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度得6个不同浓度的对照品液。按上述色谱条件测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标分别得线性方程：y = 66340 X -18.80,R2=0.9995。线性范围aT为0.0495 2.475g。2.9 精密度实验 精密吸取aT对照品进样6次，峰面积R
15、SD为0.56%，进样方法和仪器精密度良好。 表1-1 精密度实验数据重复峰面积RSD%123456结果1619.61601.81610.21622.51605.21623.60.562.10 重现性实验取同一批次万寿菊根原药材，分为5份，以2.2.1制备方法制备5份样品液，分别测定aT峰面积， RSD%为0.89%，重现性良好。2.11 稳定性实验取同一批次万寿菊根乙醇提取物供试品溶液，避光放置0、1、2、4、8、12、24h进样测得aT峰面积的RSD% 0.97%，表明供试品在避光条件下24h内基本稳定。2.12 加样回收实验精密称取已知含量的万寿菊根乙醇提取物6份，精密加入aT对照品液2
16、ml、4ml、6ml按供试品制备方法操作，测定；aT平均回收率为101.07%，RSD%为1.15%。3 结果与分析 对2012年至2015年于每年7月20日、8月20日、9月20日采摘的同一品种的根、茎、叶、花柄、花、根乙醇提取物的供试样品进行aT测定。表2 万寿菊及根提取物中aT的含量年份 采 摘 根SE 茎SE 叶SE 花柄SE 花SE 根提取物SE 根提取物产率 时 间 （PPm） （PPm） （PPm） （PPm） （PPm） （PPm） （%）2012年 7月 155.00.57 4.80.74 2.80.64 1083.80.81 14.3 8月 135.60.62 3.10.7
17、7 9.70.86 29.90.71 25.70.62 1084.70.95 12.5 9月 84.70.71 4.20.93 6.10.42 0.80.78 830.30.75 10.2 2013年 7月 154.80.97 3.90.44 2.50.74 29.90.80 26.70.23 1113.60.79 13.9 8月 136.2 0.82 4.00.57 8.20.76 31.20.78 28.50.69 1107.30.67 12.3 9月 87.80.78 4.90.91 6.40.62 1.10.67 860.70.55 10.2 2014年 7月 153.70.77 5.
18、80.73 2.60.46 31.10.65 27.20.53 1090.00.82 14.1 8月 136.80.82 3.70.87 9.2.00.96 28.90.77 21.60.52 1077.10.85 12.7 9月 88.60.78 3.90.83 6.80.49 1.40.97 894.90.73 9.9 2015年 7月 150.80.71 5.20.73 2.50.36 29.40.56 26.00.63 1108.80.90 13.5 8月 135.20.92 3.50.83 11.10.76 27.30.97 22.00.32 1053.71.13 12.1 9月 8
19、6.30.88 4.60.63 7.10.69 0.70.77 814.10.93 10.6 图3 2013 年不同部位、不同时期万寿菊中aT的含量图41 2013 年不同部位、不同时期万寿菊中aT的含量变化图42 2014 年不同部位、不同时期万寿菊中aT的含量变化图43 2015 年不同部位、不同时期万寿菊中aT的含量变化从图中可以看出：从不同部位来看，以根中的含量为最高，其次是花柄、花、叶，含量最低的是茎；不同生长期根的aT含量差异显著，7月含量最高，可达155PPm，9月含量最低,含量下降明显。 从图中可以看出，不同生长期：花（9月15日后花已凋落）的aT含量变化不显著，变化较平稳；花
20、柄含量变化与花相似，7月后呈下降,8月下旬后是花的晚期，随花的凋落，含量开始显著下降；叶8月含量最高，然后平稳下降；茎在花前含量高，花后平稳降低，但在整个生长周期中含量很低。 图5 20122015年不同时期万寿菊根乙醇提取物中aT的含量图6 20122015年不同时期万寿菊根乙醇提取物产率 万寿菊根乙醇提取物中aT的含量78月高，8月下旬后是花的晚期，随花的凋落，含量开始显著下降；产率随季节而明显下降。 不同生长时期万寿菊根乙醇提取物HPLC图谱：图71 万寿菊根乙醇提取物（2013年7月）HPLC图72 万寿菊根乙醇提取物（2013年9月）HPLC万寿菊根乙醇提取物中噻吩类物质主要组分随植
21、物生长期的不同而变化，aT在89月组分百分比较高。4 结论试验结果表明，万寿菊植物整株都含有aT，其根的含量最高，其次是花柄、花、叶，含量最低的是茎；不同生长期根的aT含量差异显著，78月含量最高；花柄和花8月含量高；茎的含量很低，含量变化不明显；根的乙醇提取物含量随根含量变化而变化， 78月份根产率较佳；提取物中噻吩类物质主要组分随生长期的不同而变化，aT在89月组分百分比较高，10月（9月下旬土壤中根开始腐烂）以后逐渐降低。本文建立了测定万寿菊及根提取物中aT含量的反相高效液相色谱定量方法，采用甲醇和水为流动相，以甲醇：水=85:15达到了最佳的分离效果。试验结果证明，万寿菊花的采集时期在
22、89月为最佳，也就是在植物盛花末采集；此时花中的aT含量最低，而根中的含量较高，根的乙醇提取物质量和产率均较理想。以采集花用于提取叶黄素为主要原料时，不要将花柄连同一起采集。参考文献：1. 盛爱武,等.万寿菊色素浸提方法及其性质的初步研究.仲恺农业技术学院,2001,14(4):38-41.2. 王新国,除汉虹, 赵善欢.杀虫植物万寿菊的研究进展.西安联合大学,2002,2(5):-10.3. 乐海洋，赵善欢.万寿菊提取物对白蚊伊蚊幼虫的光活化活性及有效成分的研究J. 华南农业大学学报，1998,19（2）：812.4. 王鸿雷,刘素琪,丁起盛,等.光暗条件下万寿菊根氯仿提取物对山茶叶螨酯酶的
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