1、乳酸测定方法的初步研究乳酸测定方法初步研究摘要乳酸是重要的生化产品，广泛应用于食品、医药、环保等各领域，目前L-乳酸的主要生产方法为微生物发酵法。近年来由于其可用于合成可降解塑料聚乳酸的性质而受到众多的关注，具有广阔的市场前景。本研究利用薄层色谱、EDTA和对羟基联苯法建立了乳酸的定性定量检测方法，并对实验条件范围进行了研究，结果如下：1、得到了分离提纯精制L-乳酸的具体参数：实验分别在55、60、65、70四个温度下直接用50%的稀硫酸酸解浓缩的乳酸钙溶液，用0.1%甲基紫溶液作为指示剂对粗L-乳酸进行了精制。在此范围内均可得到纯度大于90%的乳酸，精制后的乳酸颜色清澈，对精制的乳酸进行第二
2、次分子蒸馏得到了结晶乳酸。采用分子蒸馏技术精制L-乳酸，在操作压力为0.1Pa，蒸馏温度为70效果最好，同时实验发现适宜的蒸馏温度应低于75。2、确定了乳酸的薄层定性分析条件，实验结果表明，定性分析方法效果良好；方法简单，精确度高，显色稳定，重复性好，可应用于乳酸含量的测定。3、确定了利用EDTA法测定乳酸的可行性。在消除其他离子干扰的前提下，钙离子可迅速与乙二胺四乙酸二钠反应，以钙经酸为指示剂，用EDTA标准溶液滴定，溶液成纯蓝色为滴定终点，用滴定消耗的EDTA体积和摩尔浓度可求得乳酸钙的含量。4、在一定浓度范围内，乳酸含量与 565 nm 处波长吸光度呈线性关系，因此，可以通过测定 565
3、 nm 处的吸光度来测定乳酸的含量。通过实验证明此方法可行并且快速有效。5、用DNS法测定残糖含量中。以葡萄糖的浓度Y（mg/ml）对540nm分光光度值，进行线性回归，其回归方程为Y=1.4163X+0.0255，相关系数为0.9988。为以后测定发酵液中残糖含量奠定了基础。关键字：L-乳酸，精制，测定，分离，含量目录前言 - 2 -第一章 文献综述 - 2 -1.1 乳酸的性质 - 2 -1.1.1 乳酸的分子结构 - 2 -1.1.2 乳酸的理化性质 - 3 -第二章 乳酸测定方法研究 - 3 -2.1引言 - 3 -2.2 发酵液中L-乳酸的分离精制 - 4 -2.2.1 仪器与方法
4、- 4 -2.2.1.1仪器及试剂 - 4 -2.2.1.2 实验方法 - 4 -2.2.1.3结果与讨论 - 5 -2.3 同型、异型乳酸发酵的确定（薄层色谱） - 6 -2.3.1 仪器与方法 - 6 -2.3.1.1仪器及试剂 - 6 -2.3.1.2实验方法 - 6 -2.3.1.3结果与讨论 - 7 -2.4 乳酸含量测定 - 8 -2.4.1 EDTA滴定法确定乳酸含量仪器与方法 - 8 -2.4.1.1仪器及试剂 - 8 -2.4.1.2实验方法 - 9 -2.4.1.3结果与讨论 - 9 -2.4.2 分光光度法标准曲线确定乳酸含量仪器与方法 - 9 -2.4.2.1仪器及试剂
5、 - 9 -2.4.2.2实验方法 - 10 -2.4.2.3结果与讨论 - 10 -2.5 残糖含量的确定（DNS法） - 12 -2.5.1 仪器与方法 - 12 -2.5.1.1仪器及试剂 - 12 -2.5.1.2实验方法 - 12 -2.5.1.3结果与讨论 - 12 -第三章 结论 - 13 -3.1 结论 - 13 -参考文献 - 13 -致 谢 - 14 -前言乳酸是重要的生化产品，广泛应用于食品、医药、环保等各领域，目前L-乳酸的主要生产方法为微生物发酵法。乳酸发酵液的成分复杂，并且因原料和发酵工艺不同而各不相同。除乳酸外，发酵液中还包括菌体、残糖、蛋白质、色素、胶体、有机杂
6、酸、无机盐等多种杂质，因此从乳酸发酵液中提取乳酸是比较困难的。要得到精制乳酸就必须对其进行再加工，除去其中含有的有机物杂质。在国际上食品级的乳酸价格在 52 美分/磅，而精制的乳酸价格在 1 美元/磅，两者的价格差很大。本文围绕上述问题进行了一系列的研究。首先，进行了细菌乳酸发酵的提纯分离精制的研究，特别是温度对提纯过程的影响，其次，利用薄层色谱法、EDTA法、DNS法、分光光度法进行了对发酵液中乳酸测定研究，为实验室规模分析和制备高纯L-乳酸的工艺的提供了实验和理论依据。第一章 文献综述1.1 乳酸的性质1.1.1 乳酸的分子结构乳酸，英文名 Lactic acid，学名为-羟基丙酸 (-h
7、ydroxypropanoic acid)，分子式为 C2H5O COOH，分子量 90.08，是一种天然存在的有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。乳酸分子内含有一个不对称的C原子，因此具有旋光性，从而具有D-型和L-型两种构型。L-乳酸为右旋，D-乳酸是左旋的，DL-乳酸为消旋性，其结构式如下：1.1.2 乳酸的理化性质乳酸异构体的理化性质如表 1-1 所示：表 1-1 乳酸异构体的理化性质乳酸易与水互溶，很不容易结晶出来。乳酸浓度达60% 以上有很强的吸湿性，商品乳酸通常为60%溶液，药典级的乳酸含量为85.0%90.0%，食品级的乳酸含量为80%以上。通常乳酸为无色透明或浅黄色
8、糖浆状的粘性液，几乎无臭或微带有脂肪酸臭，味酸。与水、乙醇、乙醚、丙二醇、甘油、丙酮混溶，它几乎不溶于氯仿、石油醚、二硫化碳和苯，相对密度1.249，沸点122(2KPa)，常压沸点190。在67133Pa的真空条件下反复分馏，可以得到高纯度的乳酸，进而获得单斜晶体的结晶乳酸。但乳酸属热敏性物质，为保证乳酸无明显的分解，蒸馏温度不能超过130。由于乳酸含有一个羟基和一个羧基，因此它可以参与许多反应。如氧化反应、还原反应、缩合反应和酯化反应等。第二章 乳酸测定方法研究2.1引言乳酸易与水互溶，很不容易结晶出来。乳酸浓度达60%以上有很强的吸湿性，商品乳酸通常为60%溶液，药典级的乳酸含量为85.
9、0%90.0%，食品级的乳酸含量为80%以上通常乳酸为无色透明或浅黄色糖浆状的粘性液，几乎无臭或微带有脂肪酸臭，味酸。与水、乙醇、乙醚、丙二醇、甘油、丙酮混溶，它几乎不溶于氯仿、石油醚、二硫化碳和苯，相对密度1.249，沸点122(2KPa)，常压沸点190。由于乳酸含有一个羟基和一个羧基，因此它可以参与许多反应。如氧化反应、还原反应、缩合反应和酯化反应等目前，国外主要是以细菌为主，开展L-乳酸的发酵生产和研究，原因在于细菌厌氧发酵可大规模降低能耗，减少乳酸的生产成本。乳酸细菌发酵机理如图所示。细菌乳酸发酵代谢途径图解A-同型乳酸发酵 B-异型乳酸发酵 C-混合酸乳酸发酵2.2 发酵液中L-乳
10、酸的分离精制2.2.1 仪器与方法2.2.1.1仪器及试剂分子蒸馏装置、水浴锅、离心机、旋转蒸发仪50%稀硫酸溶液、0.1%甲基紫溶液2.2.1.2 实验方法 乳酸发酵液的成分复杂，除乳酸外，发酵液中还包括菌体、残糖、蛋白质、色素、其他有机酸和无机盐等多种杂质。这些杂质来源于发酵的原料、未消耗的营养盐或发酵的中间副产物。从乳酸含量约10%-20%成分复杂的发酵液中提取高纯度的乳酸是比较复杂的工艺，方法主要有：钙盐法、萃取法、吸附法、膜法、普通蒸馏法、分子蒸馏法等1 乳酸的参数L-乳酸的熔点：52.8-54.0，分子量：90.08。外消旋DL乳酸的熔点为16.8，沸点为122（14mmHg），相
11、对密度1.249.与水完全互溶，不易结晶。60%以上浓度的乳酸溶液有很强的吸湿性，乳酸能随热水蒸气挥发，常压蒸馏则分解，浓缩至质量分数为50%时部分转变成乳酸酐，含量为80%-90%乳酸产品一般含有10%-15%乳酸酐。2 实验流程简述 发酵液的主要成分是乳酸钙，实验采用乳酸钙直接酸解工艺制备粗乳酸，酸解所得的粗乳酸直接用旋转蒸发仪浓缩到几乎无水的状态，再将该浓缩乳酸加入分子蒸馏设备进行精制。3 实验具体步骤（1）取出成熟发酵液及时升温至90-100，并同时加入石灰乳碱化处理，将pH调至9.5-10（不可再高，否则残糖与氨基酸易发生褐色反应），搅匀后，静止4-6h，使菌体等悬浮物沉降下来，该澄
12、清过程应保温55。（2）将上清液倒出，再趁热过滤下部含较多沉淀的液体，将两部分液体合并，得到乳酸钙溶液。（3）将得到的乳酸钙溶液加到旋转蒸发仪中，在温度为70，真空度为0.2个大气压条件下浓缩脱水，当乳酸钙的浓度达到25%-28%时停止。（4）控制温度为70左右，直接用50%的稀硫酸酸解浓缩的乳酸钙溶液。用0.1%甲基紫溶液作为指示剂，早点板上检测酸解终点，刚好酸解完全时呈菊黄色，乳酸钙过量呈紫色，稀硫酸过量成绿色。硫酸过量可以相应地补加适量的Ca（oH）2，酸解完全静止1-2h使CaSO4充分析出。（5）再经减压抽滤，除去CaSO4滤渣，得到粗的L-乳酸溶液再经旋转蒸发器浓缩脱水（温度70，
13、真空度0.2个大气压），尽可能脱去水分。（6）最后将抽滤浓缩的L-乳酸加入到分子蒸馏设备中进行L-乳酸精制（设定条件为：操作压力为0.1Pa，蒸发温度为55-70，转子速率120r/min，进料速率为90ml/h）2.2.1.3结果与讨论实验分别在55、60、65、70四个温度下对粗L-乳酸进行了精制。在此范围内均可得到纯度大于90%的乳酸，精制后的乳酸颜色清澈，对精制的乳酸进行第二次分子蒸馏得到了结晶乳酸。采用分子蒸馏技术精制L-乳酸，在操作压力为0.1Pa，蒸馏温度为70效果最好，同时实验发现适宜的蒸馏温度应低于75，可以避免重组分堵塞设备造成设备清洗困难。采用分子蒸馏技术精制L-乳酸，原
14、料可以是未经脱色处理的含水量较少的粗乳酸，直接用分子蒸馏方法进行蒸馏就可得到各种浓度需要的L-乳酸产品。需要注意的是粗乳酸中糖含量应尽可能的降低，含糖过高时料液会粘在蒸发面上使整流操作无法进行。2.3 同型、异型乳酸发酵的确定（薄层色谱）2.3.1 仪器与方法2.3.1.1仪器及试剂离心机、分液漏斗、减压蒸馏装置、硅胶板、展开槽硫酸、乙醚、甲醇、乙醇、双蒸水、乙酸乙酯、氨水、甲酸、乙酸、氯仿、丙酮2.3.1.2实验方法 乳酸发酵液预处理及标准品溶液的配制乳酸发酵液预处理：各样品先用 0.5 mol/L 硫酸调节 pH 至 2，离心除去沉淀后，用 10 ml 蒸馏水分两次洗沉淀，洗液归并入离心所
15、得上层清夜中，将清液移至分液漏斗中，用乙醚提取乳酸，每次用量与清液体积相等，提取四次。然后放置于减压蒸馏上，使乙醚挥发完后，用 10 ml 乙醇来溶解，作为供试液。标准品溶液配制：用双蒸水稀释 88%的分析纯乳酸配制得浓度为 20 g/L 的乳酸标准溶液，用 0.45um 滤膜过滤，置于冰箱中备用。 展开剂的选择展开剂一般现用现配，选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，剧烈震荡，使混合液充分混合。根据研究对象的极性，本文选择的展开剂主要有以下几种：展开剂 1 乙酸乙酯2.5%氨水(95：5，v/v)展开剂 2 氯仿乙酸乙酯甲酸（5：4：1，v/v/v）展开剂 3 乙酸乙酯乙酸水（50：12：
16、10，v/v/v）展开剂 4 氯仿丙酮甲醇冰醋酸（7：1：1.5：0.5，v/v/v/v） 点样在薄层板上距底端约 0.5cm 处划出点样线（原线），再用铅笔每隔约 0.5 cm 作一圆点，标记为点样处。用玻璃制的毛细管吸取适量样液点样，若样品为水溶液，需边点样边加热干燥，防止斑点扩散，样点直径控制在 23 mm 范围内，勿损伤薄层表面。 展开展开前先将适量混合均匀的展开剂倒入层析缸，密闭 1530 分钟，用凡士林封口，使溶剂蒸汽饱和。将上样后的薄层板放入层析缸中，采用直立上行一次展开或二次展开，展距约为 3 cm 时，取出放于通风橱晾干。 显色方法的选择显色方法 1 0.5%溴酚蓝酒精溶液喷
17、雾后于 105 烘箱烘 10 分钟左右，显色显色方法 2 碘蒸汽显色2.3.1.3结果与讨论1） 吸附剂的选择薄层色谱简写作TLC（Thin Layer Chromatography），它是在吸附色谱的基础上发展起来的，包括有吸附、分配、离子交换、透析等作用，既有物理作用，兼有某些化学作用，并不是一种单一的机制。但对不同的色谱方法来说，总有一种占主要地位；移动相是液体，固定相是固体时，吸附和解吸附占主要地位；移动相和固定相都是液体的薄层色谱，则分配规律占主导地位。实践证明，不论是水溶性的糖、氨基酸或脂溶性的脂肪油、挥发油等都可以在吸附薄层上展开。吸附薄层常用的吸附剂有硅胶、氧化铝和聚酰胺等。硅
18、胶略带酸性，适用于分离酸性及中性的物质，氧化铝带碱性，适用于碱性物质和中性物质的分离。聚酰胺只对黄酮等某几类化合物分离效果较好。故本文选用硅胶作为吸附剂。（2） 展开剂的选择 溶剂系统的选择在吸附层析中，当所用吸附剂已定，则对同一化合物的解吸能力与展开剂的极性有关。展开剂一般是 23 种低沸点有机溶剂组成的多元溶剂系统。展开剂选择的基本原则是：能溶解待测组分；能使待测组分与杂质分开，达到基线分离；使待测组分斑点集中；使待测组分的Rf值（即比移值，表示物质在薄层色谱图谱上的相对位置）在 0.30.85 之间，比移值的计算方法为：Rf=OS/OF其中，OS 为从原点到斑点中心的距离，OF 为原点到
19、展开剂前沿的距离。本文所选择的四种展开剂实验结果如下：展开剂 1：展开后薄层板上成一条直线，说明其分离度不够；展开剂 2：各斑点仍留在原线，说明极性太弱；展开剂 3：未形成斑点，成为和溶剂前沿几乎平行的一条带，说明极性太强；展开剂 4：各发酵液样品基本都能分离出大小合适的斑点，其中较大的斑点Rf值与 88%纯度的乳酸分析纯Rf保持一致。 氯仿丙酮甲醇冰醋酸展开剂组分配比的研究根据实验结果，氯仿丙酮甲醇冰醋酸基本能达到分离的要求，但是还存在少许拖尾现象，这可能是由于冰醋酸加入量偏少的原因，冰醋酸在此展开系统中的作用主要是减少拖尾现象，因此，本文适当提高了氯仿丙酮甲醇冰醋酸展开剂中冰醋酸的含量，对
20、以下的不同配比作了研究：配比二 氯仿丙酮甲醇冰醋酸（7：1：1.5：0.5）配比二 氯仿丙酮甲醇冰醋酸（7：1：1.5：0.8）配比三 氯仿丙酮甲醇冰醋酸（7：1：1.5：1.0）结果表明，配比二的综合效果最好，配比一中冰醋酸含量较低，非极性溶剂所占比重较大，而待测物质乳酸极性强，两者之间作用力较弱，导致拖尾现象，层析效果差；配比三中冰醋酸含量较多，容易脱酸不彻底，使乳酸显色受到影响。所以，氯仿丙酮甲醇冰醋酸体积为 7：1：1.5：0.8 是最佳展开剂配比。 显色条件的选择薄层色谱的定位方法有物理检出法、化学检出法、生物与酶检出法、放射显影法。由于乳酸分子内没有共轭的发色基团，不适合用紫外线显
21、色，而乳酸呈酸性，可考虑采用 pH 指示剂溴酚蓝；元素碘是一种非破坏性显色剂，能检出大量的化合物，且价廉易得，显色迅速、灵敏，故本文对指示剂溴酚蓝和碘显色两种方法进行了研究。结果表明，溴酚蓝显色反应很灵敏，但在配制溴酚蓝酒精溶液时应将溶液 pH 值调到溶液刚好呈兰紫色，否则显色反应不灵敏；操作时喷雾应均匀适度，量小显色不清楚，量大则可能溶解乳酸，使斑点扩大；高温显色时须控制好时间，溴酚蓝遇酸显色为化学变化，长时间高温会使有色物质分解，造成乳酸斑点无法辨认，影响分析效果。用碘显色材料易得、操作简单，碘显色后在酸斑点存在的位置为黄色或无色，无色可能是因为乳酸分子中的双键的存在，使得两种物质发生了不
22、可逆的加成反应，使显色效果不明显。为方便操作，在后续的研究中都采用碘蒸气作为显色剂。按照以上所确定的薄层层析分析条件，取乳酸发酵液样品进行薄层分析，结果如图 2.1。由图 2.1 可知，发酵液中以乳酸产物为主。 1 2 3 1 2 31乳酸发酵液 A 2乳酸发酵液 B 3乳酸标准品溴酚蓝显色效果 碘蒸气显色效果综上所诉，确定了乳酸的薄层层析定性分析条件,以薄层层析硅胶为固定相，氯仿丙酮甲醇冰醋酸（7：1：1.5：0.8）为展开剂，0.5%溴酚蓝酒精溶液喷雾显色或碘蒸气显色都得到了良好的分析效果，但碘蒸气法更简单明显。2.4 乳酸含量测定2.4.1 EDTA滴定法确定乳酸含量仪器与方法2.4.1
23、.1仪器及试剂氢氧化钠(分析纯)溶液:20%(m/v)三乙醇胺(分析纯)1:1水溶液钙混合指示剂:钙一轻酸指示剂1克与99克氯化钠(GB1266一77，分析纯)混匀研细，棕色瓶保存盐酸轻胺(HG3一967一76):分析纯乙二胺四乙酸二钠(GB1401一78)标准溶液，0.05mol/l2.4.1.2实验方法乳酸钙可在热水中迅速溶解，并离解成钙离子和乳酸离子，而磷酸氢钙和石灰等钙离子不溶于水，在消除其他离子干扰的前提下，钙离子可迅速与乙二胺四乙酸二钠反应，以钙经酸为指示剂，用EDTA标准溶液滴定，溶液成纯蓝色为滴定终点，用滴定消耗的EDTA体积和摩尔浓度可求得乳酸钙的含量。称取样品1克(准确至0
24、.0002克)于100ml杯中，加水80ml，在电炉上加热至近沸，继续加热5分钟(小心不要溶液溢出)，冷却，定容100ml，待溶液澄清后(或过滤)，吸取上清液(滤液)10ml于锥形瓶中，加三乙醇胺10ml、蒸馏水50ml、氢氧化钠溶液10ml、0.5克盐酸轻胺摇匀后，再加钙混合指示剂少许，立即用乙二胺四乙酸二钠标准溶液滴定，溶液呈现纯蓝色为滴定终点。2.4.1.3结果与讨论乳酸钙(%)= 乳酸浓度(g/L)= 90.08CVv一滴定所消耗乙二胺四乙酸二钠标准溶液体积(ml)C一乙二胺四乙酸二钠溶液浓度(mol/l)M一称样重量(g)0.2182一每毫摩尔分子乳酸钙的克数90.08一乳酸的摩尔质
25、量V2一定容的样液体积(ml)V1一吸取液的体积(ml)每个试样取两个平行样测定，以其算术平均值作为结果。当乳酸钙含量在25%以上，允许相对偏差为1%;乳酸钙含量在10%25%，允许相对偏差为2%;乳酸钙含量在10%以下，允许相对偏差为3%。2.4.2 分光光度法标准曲线确定乳酸含量仪器与方法2.4.2.1仪器及试剂UV-2100 型紫外分光光度计、UV-240 紫外可见扫描仪、振荡器、水浴锅、离心机、无水乳酸锂、对羟基联苯、钨酸钠、硫酸铜、氢氧化钙、浓硫酸均为分析纯试剂；钨酸溶液：0.667 M 硫酸及 10%（W/V）钨酸钠溶液等体积混合，现配现用20%（W/V）硫酸铜：称取硫酸铜 20
26、g，加蒸馏水定容至 100 ml。1.5%对羟基联苯溶液：称取对羟基联苯 1.5 g 溶于 0.125 mol/L 氢氧化钠 100 ml 中（配时加热助溶，溶后为澄清液体）。贮于棕色瓶中，保存于 4 度冰箱，可使用一个月。乳酸标准储存液（0.5 mg/ml）：精确称取五水乳酸锂 53.25 mg，溶于 50 ml 蒸馏水中，加 0.5 M 硫酸 10 ml，后加蒸馏水定容至 100 ml。混匀后保存于 4 度冰箱。2.4.2.2实验方法 发酵样品预处理取适量发酵液样品 5000 r/min 离心 10 min，以除去菌体和碳酸钙沉淀，吸取上清液 0.5 ml 置于洁净离心管中，加入等体积 1
27、 mol/L 硫酸，静置约二十分钟后 10000r/m 离心十分钟，以除去硫酸钙。取上清液适当稀释，吸取稀释液 2.00 ml 于洁净离心管中，加入 2.00 ml 钨酸溶液，混匀，室温静置至溶液出现明显絮状物出现（约 45min），10000 r/m 离心 10 min,取上清置于 10 ml 洁净离心管中，60水浴保温 0.5 h，冷却待用。 最大吸收波长的确定 精确吸取 5 ml 待测液于具塞试管中，加入 0.1 g 氢氧化钙，混匀，然后加入0.2 ml 20%硫酸铜，迅速混匀，沸水浴 3 min，水浴冷却，3000 r/m 离心 5 min，取上清液 0.5 ml 入比色管中。 加入
28、6 ml 浓硫酸，混匀，沸水浴加热 5 min，取出后冰水浴冷却。 加入 1.5%对羟基联苯溶液 0.1 ml，充分混摇，静置 30 min。 置于沸水浴中加热 90 s，冰水浴冷却，在 400700 nm 波长范围内进行扫描，蒸馏水为空白做参比液，确定最大吸收波长。 最佳显色条件的确定以氢氧化钙、硫酸铜、浓硫酸、对羟基联苯溶液用量，静置显色时间，最后加热显色时间作为考察因素，采用正交设计选择最佳显色条件。 乳酸标准曲线的制作用 0.5 mg/ml 乳酸标准液，与发酵液同样预处理后，取 0、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.
29、60、0.70、0.80、1.00 ml 处理液分别置于 15支预先编好号的试管，各加水补足体积至 5 ml，按第三步中所确定的最佳显色条件操作，分别测定吸光度。以乳酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，作出标准曲线。2.4.2.3结果与讨论在乳酸发酵的过程中乳酸通常以乳酸钙的形式存在， 通过去除发酵液中的葡萄糖和蛋白质，并加入适当浓度硫酸酸化，钙离子转化成难溶的硫酸钙沉淀，使溶解度不高的乳酸钙全部转变为乳酸。乳酸在铜离子的催化下，与浓硫酸作用生成乙醛，乙醛能与对羟基联苯作用生成在 565 nm 处有特征吸收的紫色物质。在一定浓度范围内，乳酸含量与 565 nm 处波长吸光度呈线性关系，因此，可以
30、通过测定 565 nm 处的吸光度来测定乳酸的含量。（1） 最大吸收波长的确定乳酸发酵液样品显色后，扫描结果见图 2.2，表明，最大吸收波长为 565 nm。最大吸收波长的确定（2） 最佳显色条件的选择结果表明，氢氧化钙和浓硫酸的加入量对显色反应影响显著，其余因素的作用不显著，最佳显色条件为A2B3C2D1E1F3，即氢氧化钙 0.05g，20%硫酸铜 0.8 ml，浓硫酸 6 ml，对羟基联苯 0.125 ml，静置时间 15 min，加热显色时间 5 min。（3） 乳酸标准曲线的制备乳酸标准应用液浓度在 1080 g/ml范围内与吸光度值基本呈线性关系，当浓度大于等于 60 g/ml时吸
31、光度值大于 1，考虑到仪器误差的因素，故制备标准曲线时浓度范围取在 15、20、25、30、35、40、45、50 g/ml，得到如图 2.4 的乳酸标准曲线，求得标准曲线回归方程为A=0.0189C0.0808(A为吸光度值，C为乳酸浓度，n=8)，r=0.9989，在 1550g/ml范围内呈良好线性关系。乳酸标准应用液浓度与吸光度值之间的关系乳酸标准曲线本实验对发酵液进行预处理，排除蛋白质和葡萄糖的干扰，使测定结果更接近真实值；优化了显色条件，使测定时操作简便，精确度高，显色稳定，准确度高，适合于发酵液中乳酸含量的测定。2.5 残糖含量的确定（DNS法）2.5.1 仪器与方法2.5.1.1仪器及试剂UV-2100 型紫外分光光度计、振荡器、水浴锅、离心机、3,5-二硝基水杨酸2.5.1.2实验方法在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在
