1、课程设计标准模板燕山大学课 程 设 计 说 明 书透明质酸对牛卵母细胞体外成熟影响的设计学院（系）： 环境与化学工程学院年级 专业： 00级 生 物 制 药 学 号： 040110050001 学生 姓名： 赵宏伟 指导 教师： 赵红卫 教师 职称： 讲 师 燕山大学课程设计（论文）任务书院（系）：环境与化学工学院 基层教学单位：生物工程系 学 号040110050001学生姓名赵宏伟专业（班级）00级生物制药设计题目透明质酸对牛卵母细胞体外成熟的影响设计主要内容1.HA浓度对牛卵母细胞体外成熟的影响2.HA在不同基础培养液中对卵母细胞成熟的影响3.OCS、BSA与HA 对牛卵母细胞体外成熟的
2、影响设计要求1.要有明确设计的目的2.设计合理的操作方式3.设计出合理的测定指标4.设计的内容要与题目基本一致5.设计总结与分析工作量1.至少阅读15篇以上的相关科技文献2.设计文字至少在15000字以上工作计划8.278.28 查阅资料8.298.31 整理文献9.1 9.5 提出设计方案9.6 9.10 撰写说明书9.119.12 检查内容，准备答辩9.139.14 答辩参考资料1 Pincus G, Enzmam EV. The comparative behaviors ofmammalian eggs in vivo and in vitroJ ExpMed,1935, 62:665
3、-675.2王欣,陈庆华, 李元瑞.大蒜品种及预处理条件对超临界C02萃取效果的影响J.食品与机械，2003, (2): 13-14. 3王欣,李元瑞.临界充体萃取过程的优化选择J.中国油脂, 2000, 25 (6): 200-203. 指导教师签字基层教学单位主任签字燕山大学课程设计成绩评定表设计者姓名: 赵宏伟 学号: A100000000 设计题目: 透明质酸对牛卵母细胞体外成熟的影响 说明书成绩评定（满分100分）： 得分设计内容的切题程度：满分20分 （ ）设计内容立题合理性：满分10分 （ ）设计内容的规范程度：满分10分 （ ）设计书前后内容完整：满分20分 （ ）设计说明说排
4、版成绩：满分20分 （ ）设计说明书的工作量：满分10分 （ ）设计过程平时成绩： 满分10分 （ ）总分成绩： 答辩成绩评定：（满分100分） 得分仪表成绩：满分20分 （ ）口语表达：满分20分 （ ）幻灯质量：满分20分 （ ）设计分析：满分40分 （ ） 总分： 设计撰写成绩（70%）答辩成绩（30%）合计教师签字： 年 月 日200X-201X X季学期生物工程专业课程设计结题论文透明质酸对牛卵母细胞体外成熟影响的设计学院（系）： 环境与化学工程学院年级 专业： 00级 生 物 制 药 学 号： 040110050001 学生 姓名： 赵宏伟 指导 教师： 赵红卫 教师 职称： 讲
5、师 摘 要本设计拟定在改良的基础培养液中添加HA，主要探讨HA对牛卵母细胞成熟的影响。设计内容主要分为三部分：HA浓度对牛卵母细胞体外成熟影响的设计；HA在不同基础培养液中对卵母细胞成熟影响的设计；OCS、BSA与HA 对牛卵母细胞体外成熟影响的设计。第一部分设计拟定探索出HA能够提高卵母细胞成熟的最佳浓度，为HA对卵母细胞成熟影响的研究奠定基础；第二部分设计是在第一部分的基础上分析HA对母细胞成熟的影响，拟定探索基础培养基是否影响HA的效果；第三部分设计就是在前两部分的基础上，探讨新发现的HA是否由于传统的添加物 OCS、BSA。通过本次设计，拟定探讨HA能否有效地提高牛卵母细胞的成熟率，并
6、确定最佳的浓度范围，进一步与传统添加物比较，新型的HA能否代替OCS、BSA，成为一种成分确定的卵母细胞成熟添加物。关键词：透明质酸；牛卵母细胞；体外成熟；卵裂率目 录第一部分：文献综述1.XXXXXXXXX 11.1 XXXX 错误！未定义书签。1.2 XXXX 错误！未定义书签。1.3 XXXX 错误！未定义书签。1.4 XXXX 错误！未定义书签。2. XXXXXXXXX 错误！未定义书签。2.1 XXXXX 错误！未定义书签。2.2 XXXXX 错误！未定义书签。2.3 XXXXX 错误！未定义书签。2.4 XXXXXX 错误！未定义书签。2.5 XXXXX 错误！未定义书签。2.6
7、XXXXX 错误！未定义书签。2.7 XXXXX 错误！未定义书签。2.8 XXXXX 错误！未定义书签。3. XXXXXXX 错误！未定义书签。3.1 XXXXX 错误！未定义书签。3.2 XXXXX 错误！未定义书签。4. XXXXXX 错误！未定义书签。4.1 XXXX 错误！未定义书签。4.2 XXXXX 错误！未定义书签。4.3 XXXXXX 错误！未定义书签。4.3.1 XXXX 错误！未定义书签。4.3.2 XXXXX 错误！未定义书签。4.3.3 XXXXXX 错误！未定义书签。4.4 XXXXX 错误！未定义书签。第二部分：课程设计部分1. 材料 错误！未定义书签。1.1 X
8、XX 错误！未定义书签。1.2 XXXX 错误！未定义书签。1.2.1 XXX 错误！未定义书签。1.2.2 XXXX 错误！未定义书签。1.3 XXX 错误！未定义书签。1.4 XXX 错误！未定义书签。2. 方法 错误！未定义书签。2.1 XXX 错误！未定义书签。2.2 XXXX 错误！未定义书签。2.3 XXXX 错误！未定义书签。2.4 XXXX 错误！未定义书签。2.5 XX 错误！未定义书签。2.6 XXXXX 错误！未定义书签。2.7 XXXXX 错误！未定义书签。3. 设计 错误！未定义书签。3.1 HA浓度对牛卵母细胞体外成熟的影响 错误！未定义书签。3.2 OCS、BSA
9、与HA对牛卵母细胞体外成熟的影响 错误！未定义书签。3.3 HA在不同基础培养液中对卵母细胞成熟的影响 错误！未定义书签。4. 分析与总结 错误！未定义书签。参考文献 错误！未定义书签。第一部分 文献综述1. XXXXXX（标题四号（黑体）1.1XXXX（小四 黑体）1.1.1XXXX（小四 宋体）XXXXXXXXXXXXXXX（正文字体宋体小四，固定值21磅）2.XXXX（标题四号（黑体）2.1（小四 黑体）（正文字体宋体小四固定值21磅）第二部分 课程设计部分透明质酸对牛卵母细胞体外成熟的影响随着现代动物生物技术的发展，卵母细胞的需求日益增加，而且卵母细胞的成熟程度直接影响卵母细胞的利用效
10、率，提高卵母细胞成熟的质量将会有益于这一问题的解决。但是，体外成熟的卵母细胞与体内成熟相比较，支持胚胎发育的潜力有限；因此，进一步模拟卵母细胞体内的生长环境仍然是目前研究的重点。研究表明，在哺乳动物卵泡液、输卵管和子宫液中存在大量的粘多糖分子14，透明质酸（hyaluronic acid，HA）便是其中主要成分，它由颗粒细胞、卵丘细胞和上皮细胞分泌5，并在牛的卵母细胞、卵丘细胞、早期胚胎和囊胚上发现了其受体6，其主要功能是支持细胞粘结和迁移、调节细胞基因表达、蛋白质分泌、细胞增生分化等，影响细胞代谢途径、影响腺苷酸环化酶的活性以及ATP的浓度7,8。国外有人在卵母细胞成熟液中添加HA可代替血清
11、和血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）使卵母细胞成熟9，国内尚无此类研究。因此，本研究通过在无血清培养基中添加HA对牛卵母细胞进行成熟培养，探索不同浓度的HA对卵母细胞成熟培养的影响，并能否代替BSA和血清使卵母细胞成熟，以期寻找牛卵母细胞无血清成熟培养的较佳途径。1试验材料1.1 卵巢猪卵巢采集自河北省秦皇岛市海滨区新店子屠宰场。猪宰杀剖腹后，立即无菌剪下卵巢，挑选黄体期和红体较少，卵泡直径约35 mm、大小均匀的卵巢，使用37 的PBS缓冲液冲洗干净，置于37 的PBS缓冲液4h内带回实验室。1.2 试验用的仪器仪器厂商型号体式显微镜日本NikonSMZ荧光显微镜
12、日本NikonE600全自动高压消毒锅日本YamatoSM-51CO2培养箱美国 BINDER低温台式高速离心机德国 Eppendorf自动数字天平ADEK-120A液氮罐Taylar-Wharton1.3 试验药品药品厂商TCM199GIBCOHepesSIGMAFCSSIGMAFSH宁波市激素制品有限公司LH宁波市激素制品有限公司PFF自制青霉素大连美罗大药厂链霉素大连美罗大药厂蔗糖上海生物优先公司GlySIGMADMSOSIGMA0.25ml细管北京耀北生物技术公司四孔板北京耀北生物技术公司2.方法2.1卵母细胞的采集从屠宰场收集卵巢后，放入35双抗生理盐水中，用保温瓶在3 h 内运到实
13、验室，去除血污。然后用带有18G针头的一次性注射器，抽吸直径2 10 mm卵泡中的卵泡液。吸卵液为TCM199+25 mmol/L HEPES+10 g/mL肝素+4.0 g/L BSA。吸出液收集在35 mm一次性培养皿中，静置510 min后，在实体显微镜下挑选形态及颜色正常的、卵丘颗粒细胞层完整、细胞质均匀的卵母细胞。2.2卵母细胞的成熟培养收集的卵母细胞用成熟培养液半量冲洗3次，然后移至至少平衡2 h培养液滴中，每滴放置约1020枚卵母细胞，上覆石蜡油，在39，5的CO2和相对饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养2224 h。成熟培养液为见试验设计。2.3体外受精 用含有6 g/L BSA、
14、3.0g/mL肝素、3.0 g/L青霉素、1.0 g/mL亚牛黄酸和0.3 g/mL肾上腺素组成的受精液做成30 L受精滴，放入CO2 培养箱中平衡12 h。然后，用改良的Tyrodes液离心洗涤解冻精液23次，最终用受精液将精子密度稀释至2106/mL。在精液洗涤的同时，分离卵丘卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes，COCs）上的卵丘细胞，使卵母细胞和卵丘细胞相互分离，用受精液洗涤3 次，每10个卵母细胞移置一个受精滴中。再用移液器吸取10 L处理好的精液加至受精小滴中，然后覆盖石蜡油，在39、5 CO2、饱和湿度培养箱中进行孵育，48 h后检查卵裂率。3. 设计
15、3.1 HA浓度对牛卵母细胞体外成熟的影响将选择的卵母细胞随机分配到HA浓度为0、1.5、3.0、4.5、6.0 mg/mL培养液中进行体外培养，以空白组为对照组（CK）。检查极体排出率，再将成熟的卵母细胞进行体外受精检查卵裂率，以确定HA的最佳浓度。3.2 OCS、BSA与HA 对牛卵母细胞体外成熟的影响将选择的卵母细胞随机分配到含有HA、发情母牛血清(Oestrus Calf Serum，OCS)与BSA的mTCM-199中进行体外培养，以HA组为对照组（CK），检查极体排出率，再将成熟的卵母细胞进行体外受精检查卵裂率，探索HA能否代替OCS和BSA。3.3 HA在不同基础培养液中对卵母细
16、胞成熟的影响将选择的卵母细胞随机分配到含有4.0mg/mL HA的mTCM-199和mSOF培养液中进行体外培养，检查极体排出率，再将成熟的卵母细胞进行体外受精检查卵裂率，确定HA的效果是否与基础培养液有关。4分析与总结3.1 HA浓度对牛卵母细胞体外成熟的影响HA作为一种粘多糖不仅能够改善无血清培养基的物理特性，而且通过降解代谢为细胞成熟提供营养与能量10。本设计，3.2 OCS、BSA与HA对牛卵母细胞体外成熟的影响Stojkovic 等9认为HA可代替血清支持培养系统，但本设计XXXXXXX。以上分析表明在无血清培养条件下，HA可代替BSA，但是效果还不及血清。3.3 HA在不同基础培养
17、液中对卵母细胞成熟的影响Stojkovic等9（1999）在SOF-HA液中的卵母细胞成熟率比本研究mTCM-199-HA的结果高，本设计XXXXXXXX 本设计通过在改良的基础培养基中添加HA使牛卵母细胞成熟，初步认为HA在一定的浓度范围内可能对牛卵母细胞的成熟具有促进作用；在无血清培养中拟代替BSA，但是培养的效果可能如血清，因此完全代替血清还需要进一步探讨分析。另外HA在不同的基础培养基中，对卵母细胞的成熟应该无明显差异。参考文献1 Pincus G, Enzmam EV. The comparative behaviors ofmammalian eggs in vivo and in
18、 vitroJ ExpMed,1935, 62:665-675.2 Suchanek E, Simunic V, Juretic D and Grizelj V. Follicular fluid contents of hyaluronic acid, follicle-stimulating hormone and steroids relative to the success of in vitro fertilization of human oocytes J. Fertility and Sterility, 1994, 62: 347-352.3 李宏丹, 魏嘉等.型糖尿病的干
19、细胞治疗研究进展J. 生命科学, 2007, 19(4): 401-408. 4 陈长浩, 傅学奇等. PDX-1基因与糖尿病治疗J. 生命的化学, 2004, 24(1): 52-54. 5 卢克良, 钟延美等. PDX-1促进大鼠骨髓间质干细胞体外分化为胰岛素分泌细胞J. 中国现代, 2009, 12(1): 12-16. 6 于瑾, 王启伟. 间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞的研究进展J. 中国生物工程杂志, 2005, 25 (8): 6-9. 7 姜铧, 张洹等. PDX-l与糖尿病J. 郧阳医学院学报, 2008, 27(1):81-83. 8 朱岚. PDX-1的基因表达及调节M.
20、 国外医学内分泌学分册, 2005, 25(1): 32-34.9 董为伟, 杨于嘉等. 高血糖对体外培养的胎鼠胰岛PDX-1基因的影响J. 重庆医科大学学报, 2003, 28(5): 559-561. 10 李艳琼, 李薇等. PDX-1诱导胰岛素分泌细胞形成研究进展J. 医学研究杂, 2010, 39(4): 119-121.11 吴木潮, 程桦等. 多种生长因子分阶段诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞J. 中华内分泌代谢杂志, 2006, 22(3): 268-272. 12 井绪东, 王跃春等. 诱导干细胞向胰岛样细胞分化的研究进展J. 生命科学, 2007, 19(5): 526-530.13 李艳琼, 张彦等. PDX-1诱导的肝细胞转分化研究进展J. 国际遗传学杂志, 2009, 32(5): 360-376.
