1、生物技术综合试验目的：主要是通过本课程的学习，使学生受到严格的基因工程和分子生物学等技术实验技能的训练，熟悉现代生物技术仪器的基本操作使用和应用范围，加深对生物技术系列相关课程基本理论、基本技术原理的理解认识。实验一、质粒DNA的小量提取实验二、双酶切反应实验三、PET28-a质粒载体的胶回收实验四、引物设计实验五、目的片段的PCR扩增实验六、PCR产物的双酶切反应实验七、PCR产物的胶回收实验八、目的片段OMP31、BLS与PET28-a载体的连接反应实验九、大肠杆菌感受态细胞的制备实验十、重组质粒转化感受态细胞的实验实验十一、菌落PCR反应实验十二、IPTG诱导OMP31和BLS融合基因的
2、表达实验十三、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳实验一、质粒DNA的小量提取一、 目的要求1、 掌握用试剂盒提取质粒DNA的技术2、 掌握用分光光度计测定DNA浓度的方法二、 基本原理在染色体外能自主复制且稳定遗产的遗传因子称为质粒，大小在1kb-200kb之间，是双链闭合环状的DNA分子。在细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中都发现有质粒存在，其中细菌质粒存在最为普遍，在基因工程中常用作基因载体。碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法，是一种用的最广泛的制备质粒DNA的方法，此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，
3、双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节起pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三、 仪器、材料和试剂1.仪器：微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计2.材料：含有质粒的大肠杆菌DH5a3.试剂及溶液：LB培养基、葡萄糖 质粒小提试剂盒 操作步骤 1质粒DNA的提取1）培养细菌：将带有质粒的单菌落
4、，接种到LB液体培养基中，37oC，200r/min,过夜震荡培养；2）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL,12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）3）取过夜培养的细菌培养液3mL于Eppendorf管中,转速12000r/min离心1min,去掉上清夜,用滤纸吸干；4）向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液P1（确保已加入RNaseA），用枪头混匀；5）向离心管中加入250l溶液P2，温和上下翻转6-8次使菌体充分裂解。6）向离心管中加入350l溶液P3，立即温和上下翻转6-8次，充分混
5、匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。7）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）尽量不要吸出沉淀。12000rmp离心30-60s,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。8）向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW(加入无水乙醇)，12000rmp离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。9）重复步骤8。10）将吸附柱CP3放入收集管中，12000rmp离心2分钟，目的是将吸附柱中的残留的漂洗液去除。11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位滴加50-100ul洗脱
6、缓冲液EB，温室放置2分钟，12000rmp离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。 2用分光光度计测定质粒DNA的浓度五、问题讨论(1)提取质粒DNA有多种方法，所有这些方法都包括3个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。可采用溶菌酶破坏菌体细胞壁，SDS（十二烷基硫酸钠）可使细胞壁裂解。经溶菌酶和SDS处理后，在碱性条件下细菌染色体DNA和质粒DNA都变性，而当加入乙酸钾在中性条件下，巨大的染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA很快得以复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清夜中，用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到质粒DNA。(2)利
7、用核酸的紫外吸收测定核酸浓度的光学定量法，是定量DNA、RNA常用且快速的方法。组成核酸的五种碱基（G，A，T，C，U）均在260nm处有强吸收峰，正是利用这一强吸收峰而对核酸进行定量的。碱基的种类不同，最大吸收波长以及吸光系数不同，即使是相同碱基，也会随pH的变化，吸光系数也会产生变化，一般在中性附近进行测定。采用本法能够对纯度较好的核酸进行准确定量，对纯度不高的样品，因为糖和蛋白质均具有紫外吸收，常会产生定量不准的结果。另外纯化核酸所用的试剂如苯酚、EDTA等也有紫外吸收，在定量时需注意，特别是苯酚有很强的吸收，用苯酚处理过的样品定量时要特别的小心。核酸样品在260nm和280nm波长下均
8、有一定的光吸收值。如果比较纯的核酸样品，其OD260/OD280是固定的，对DNA样品而言其值大约为1.82.2,如高于2.2则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染，因此可用测定样品OD260/OD280的方法来分析核酸样品的纯度。六、试验结果 计算并记录你所提取的质粒DNA的浓度和纯度。实验二、双酶切反应一、实验目的1.掌握双酶切反应的基本原理2.掌握双酶切反应获得质粒载体的基本方法二、实验原理 DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:类、类、类。类和类酶在
9、同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。 DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分
10、别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 三、实验材料及试剂实验材料：实验一获得的PET28a质粒载体实验试剂：EcoR I 、Xho I、10x Hbuffer、灭菌水、冰、37水浴四、双酶切反应体系（20L）H buffer（10x）2L1LEcoR I1L0.5LXho I1L0.
11、5LDNA4L5LddH2O12L3LTotal20L10L五、实验步骤1) 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪按照体积由大到小的顺序加入上述溶液,再加入重蒸水使总体积为18l。2) 将管内溶液混匀后加入2l酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 3) 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。 4) 每管加入2l 0.1mol/L
12、EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。注：将加好的反应体系放入37恒温水浴锅中反应。如果是载体，则反映时间为56h，如果是DNA 则反应时间是12h。附：（A）（B）（C）BamH IHind 1xKEcoR IHind 1xmEcoR IBamH I1xKBamH IXho I1xKHind Xho I1xm实验三、PET28-a质粒载体的胶回收一、实验目的1.掌握琼脂糖凝胶的制备方法2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的方法3.掌握DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒的使用二、实验原理 根据DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的
13、溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。电泳过程中或电泳完毕，直接利用低浓度的荧光染料EB（溴化乙锭）进行染色，EB可以嵌入核酸双链的配对碱基当中，在紫外激发下，发出荧光，即可确定DNA条带在凝胶中的位置而且灵敏度很高，少知110ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。不同浓度的琼脂糖凝胶的分离范围凝胶中的琼脂糖含量（%）线状DNA分子的有效分离范围（Kb）0.35600.61200.70.8100.90.57.01.20.46.01.50.23.02.00.1
14、2.0 琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶试剂盒回收酶切产物。试剂盒中有一个特制的Column，将硅胶填制到这个特制的管中，利用硅胶在高盐低PH下吸附DNA,在低盐和高PH的条件下DNA可以再次被洗脱的原理，进行DNA的回收和纯化。三、主要实验仪器和试剂主要仪器：电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、微波炉、离心机等。主要实验试剂：1、50TAE （2 M Tris，1M 醋酸，50 mM EDTA（pH8.0）2、10上样缓冲液（loading buffer）3、分子量标准 DNA Marker4、琼脂糖5、EB （溴化乙锭）（黑暗保存）6、DNA回收纯化试剂盒（AxyPrep DNA 凝胶回收
15、试剂盒）四、实验步骤 琼脂糖凝胶的制备：1、将洗净的电泳槽洗净，置于平整的台面上，并调节水平；2、用1TAE 电泳缓冲液配制0.8%的琼脂糖，微波炉加热使其溶解；3、待琼脂糖溶液冷却至60C左右时，缓缓将琼脂糖倒入胶模中，厚度约5至7mm；4、插入梳子，静待琼脂糖凝固；5、将胶模放进电泳槽中，向电泳槽倒入1TAE电泳缓冲液，没过胶约5mm；6、小心拔掉梳子，用20 ul移液器吸取DNA溶液（20 ul DNA 加 23ul 10loading buffer），缓缓加入点样孔；并在最右边的点样孔加6 ul DNA Maker；7、接通电源，（注意电源的正负极！）电泳至条带前缘到达胶的2/3左右，
16、约2030分钟；8、电泳完毕，关闭电源。从胶模中取出琼脂糖凝胶，放入EB染色液中，染色6-8min，然后置于紫外灯下观察。酶切产物凝胶回收：1、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量。（100mg凝胶，计100ul体积）（尽量缩短暴露UV灯下的时间！）2、加入3个凝胶体积的Buffer DE-A（600 ul），混合均匀后，于65C 加热，直至凝胶完全熔化。3、加0.5个Buffer DE-A 体积的Buffer DE-B（300 ul）,混合均匀，当分离的DNA片段小于400 bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。4、吸取3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2 ml 离心管中）
17、，12000r/min离心1 min，弃滤液。5、将制备管置回2 ml离心管中，加500 ul Buffer W1， 12000r/min离心30 sec，弃滤液。6、将制备管置回2 ml离心管中，加700 ul Buffer W2, 12000r/min离心30 sec，弃滤液。重复一次。7、将制备管置回2 ml离心管中，12000r/min离心1 min。彻底去除残余的液体。8、将制备管置于1.5 ml离心管中，在制备膜中央，加2530 ul 65C Eluent或去离子水，室温静置1 min。12000r/min离心1 min洗脱DNA。五、思考题：1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效
18、率？2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？实验四、引物设计一、实验目的掌握引物设计的方法和原理二、实验步骤1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。2、用Primer Premier5搜索引物打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项
19、，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300500bp.点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：
20、3不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在5570度之间，GC应该在4555间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显
21、影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。3、用Oligo验证评估引物在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口
22、。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击ChangeCurrent oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Prime
23、r5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3端的Delta G.3端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kc
24、al/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。 Analyze中第四项为Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC需要控制在4060，而且上下游引物之间的GC 不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、GC me
25、thod和2(AT)4(GC)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm 值可以控制在5070度之间。第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另
26、外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。引物评价完毕后，可以选择FilePrint，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast
27、结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。三、注意事项：1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹
28、结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5），退火温度根据较低的Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. G值是指DNA双链形成所需的自由能，该
29、值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。9.引物序列应该都是写成5-3方向的，Tm之间的差异最好控制在2度之内。 10.密码子的简并，如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会
30、影响扩增特异性与效率。实验五、聚合酶链式反应（PCR）一 实验目的1 学习并掌握PCR基因扩增的操作方法2 理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性二 实验原理 设计出一对寡聚核苷酸引物可与目的DNA分子互补，以至于能被DNA聚合酶相向延伸，那么被该引物结合的摸板区就可通过变性、退火和聚合的循环来大量扩增，这一过程被称为聚合酶链式反应。该技术1985年由Mullis及同事们设计并研究成功，其原理类似于DNA的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段和与其两侧互补的寡聚核苷酸引物经过变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增倍数可达2n倍，该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必
31、须工具。 PCR的工作程序如下：在第一个循环中，目的DNA在加热至95，60s左右的条件下分成两条单链；当降温至55（约30s）左右时，引物首先与模板杂交复性；退火后温度再升至72（60s-90s）以进行聚合反应，聚合反应要消耗反应混合物中的dNTPs，并需要Mg2+。第一次聚合反应中不同的目标分子从引物3末端开始扩增，不断对目标分子进行拷贝，新合成分子的长度可以各不相同。当温度再次升高到95，变性所有新合成分子的第二次循环开始。 每一对PCR引物长度约为18-30个核苷酸，并且成对引物间的G+C含量应相似，以致使它们在相近的温度下与其互补序列结合。短的寡核苷酸的退火温度可用下列公式计算：Tm=2（A+T）+4（G+C），引物与目的序列的相应链退火，结果可通过向3端加核苷酸相向延伸，较短的片段较易扩增。三、实验材料及试剂1. 模板DNA（含有OMP31
