1、第1章 生物物理技术 显微技术 3第1章 显微技术摘要：电子显微镜（Electron Microscopy）的诞生，为我们认识微观世界又进了一步。电子显微镜包括透射电镜(Transmission Electro Microscopy，TEM)，和扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM）。本文将就电镜的原理、应用及目前的发展情况做一综述。关键词：透射电镜 扫描电镜 原理 应用目录1 透射电镜 (Transmission Electro Microscopy，TEM) 11.1 TEM的工作原理 11.2 TEM的组成 31.2.1 电子光学部分 31.2.2
2、真空系统 31.3 TEM的成像方式 31.3.1 吸收像 31.3.2 衍射像 41.3.3 相位像 41.4 TEM的样品制备 41.4.1 TEM的直接样品制备 51.4.2 TEM的间接样品制备 52 扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM） 62.1 SEM的工作原理 62.2 SEM的组成 72.2.1 扫描系统 72.2.2信号检测系统 72.3 SEM的成像方式 72.3.1 二次电子像 72.3.2 背散射电子像 82.4 特征X射线及能谱分析 92.4.1 波谱和能谱的比较 92.4.2 定性分析 92.4.3 定量分析 92.5 SEM
3、的样品制备 102.6 SEM的发展 102.6.1 环境扫描电镜( environmental scanningelect ron microscope，ESEM) （邵曼君等.2005） 102.6.2 扫描免疫电镜技术（immunoelectron microscopy） 102.6.3 低温电镜技术和三维重构技术 101 透射电镜 (Transmission Electro Microscopy，TEM)1.1 TEM的工作原理透射扫描电子显微镜是为了弥补光学显微镜不足而发展起来的。在说明透射电镜基本原理之前, 有必要简略分析一下显微镜的成像原理。物镜的分辨率是不能任意小的,这是由光的
4、本质决定的。由于光的波动性及其衍射现象, 使样品上的一个点经过物镜成像以后, 在像空间不是一个点, 而是以中心亮度为最大的一系列明暗相间的衍射圆环, 中心亮斑的光强度约为整个衍射图像光强度的34%。若要样品上两点能分辨开, 则它们衍射图像中心亮斑必须分离而不搭接, 所以对于一定的物镜来讲，存在一个由衍射斑点大小决定的能够分辨的最小距离。由衍射理论推导, 物镜的分辨率d的表达式为：式中d：物镜的分辨率：照明光波长n：样品与物镜之间的介质折射率：物镜的孔径半角由上式可知，要想提高分辨率即减小d，途径有三：第一，使减小；第二，提高样品与物镜之间的介质折射率，即增大n；第三，增大物镜的孔径半角。但是,
5、 缩短可见光的波长可能不是很大，在显微镜观察中, 经常采用对人眼最为敏感的绿光，为550nm；以空气作为物镜与样品之间的介质时n为1，如果使折射率极高的油类，最大可使n=1.6；至于角其极限是90。根据这些条件计算，光学显微镜的理论分辨率为200nm左右。把200nm放大到人眼可以分辨的0.2mm左右，就是光学显微镜的最高有效放大倍数，只能在1000倍左右。光学显微镜的第二个局限性是垂直鉴别率差，它随物镜数值孔径的增大即放大倍数的增加而减小，因此此时对样品的平整度要求就愈高。这一点也限制了光学显微镜的使用范围。根据分辨率公式，如果入射光的波长能够缩短，则能提高显微镜的分辨率，而由量子力学中的德
6、布罗意物质波的假设，即运动的电子既具有微粒性，也具有波动性。式中h为普朗克常量，mv为动量。由上式可知当电子经过不太高的50kV加速电压加速后，此时电子波的波长大概为0.0536，它大约只为绿光波长的5500的10-5倍，这样如果以电子波作为显微镜的照明光，显微镜的分辨率将会得到极大的提高。于是发展起来用电子束作照明源, 利用电磁场对运动电子的作用力使电子束会聚或发散, 以及电子束穿过样品不同部位散射程度的差别, 从而形像的衬度的透射式电子显微镜。其工作原理与光学显微镜相似，如图1所示。图1 电镜与光镜光路图比较由于电子波的长度只有可见光的10万分之一，要消除电磁透镜的相差比玻璃透镜更为困难，
7、因此透射电镜中一般都取近轴电子束作为照明源。电磁透镜的孔径角就变得很小，使其数值孔径一般只有玻璃透镜的百分之一左右。这样目前最好的透射电镜的分辨率一般为光学显微镜的1000倍，可以达到2左右。另外一个优点就是由于数值孔径非常小，从而提高了其景深，因此在观察粗糙样品时更有优势。11.2 TEM的组成透射电镜一般是由电子光学部分、真空系统和供电系统三大部分组成。a)透射电子显微镜 b) 透射光学显微镜透射显微镜原理和光路图 1.2.1 电子光学部分整个电子光学部分完全置于镜筒之内，自上而下顺序排列着电子枪、聚光镜、样品室、 物镜、中间镜、投影镜、观察室、荧光屏、照相机构等装置。根据这些装置的功能不
8、同又可将电子光学部分分为照明系统、样品室、成像系统及图像观察和记录系统。照明系统由电子枪、聚光镜和相应的平移对中及倾斜调节装置组成。它的作用：是为成像系统提供一束亮度高、相干性好的照明光源。为满足暗场成像的需要照明电子束可在2-3度范围内倾斜。电子枪。它由阴极、栅极和阳极构成。 在真空中通电加热后使从阴极发射的电子获得较高的动能形成定向高速电子流。聚光镜。聚光镜的作用是会聚从电子枪发射出来的电子束，控制照明孔径角、电流密度和光斑尺寸。电子透镜是电镜的核心部件。它有二种：静电透镜和磁透镜。静电透镜虽有其优点，但强的静电透镜需要很强的静电场，往往会在镜体内会引起击穿和弧光放电。所以静电透镜不能做成
9、焦距很短的强透镜，而只有强透镜才能很好地矫正象差。因此，在电镜中除在电子枪中使用静电透镜形成电子束外，一般不使用静电透镜而使用磁透镜。成像系统一般由物镜、中间镜和投影镜组成。物镜的分辨本领决定了电镜的分辨本领，中间镜和投影镜的作用是将来自物镜的图像进一步放大。中间镜主要通过对励磁电流的调节，放大倍数可从几十倍连续地变化到几十万倍；改变中间镜的焦距，即可在同一样品的微小部位上得到电子显微像和电子衍射图像。21.2.2 真空系统真空系统由机械泵、油扩散泵、换向阀门、真空测量仪奉及真空管道组成。它的作用是排除镜筒内气体，使镜筒真空度至少要在10-4 pa以上。如果真空度低的话，入射电子与气体分子碰撞
10、，由于气体分子对入射电子的散射使部分电子改变方向，不落在聚焦点上，从而产生图像的背底噪音；同时入射电子使气体分子电离，产生电子和离子，也会加大图像的背底噪音。残留的气体还会腐蚀灯丝，污染样品。因此真空系统的好坏对整个电镜的性能非常重要。1.3 TEM的成像方式TEM的成像可以分为三种情况：吸收像、衍射像、相位像。1.3.1 吸收像主要用于非晶样品的透射电子显微图像，当电子射到质量、密度大的样品时，主要的成相作用是散射作用。样品上质量厚度大的地方对电子的散射角大，通过的电子较少，像的亮度较暗。因此此时的图像衬度是由于样品不同微区间存在的原子序数或厚度的差异而形成的，即质量厚度衬度（质量厚度定义为
11、试样下表面单位面积以上柱体中的质量），也叫质厚衬度，如图2所示。早期的透射电子显微镜都是基于这种原理。 图2 质厚衬度成像光路图1.3.2 衍射像常用于晶体试样，电子束透射晶体样品后，由于各处晶体取向不同和(或)晶体结构不同，满足布拉格条件的程度不同，使得对应试样下表面处有不同的衍射效果，从而在下表面形成一个随位置而异的衍射振幅分布，这样形成的衬度，称为衍射衬度，如图3所示。这种衬度对晶体结构和取向十分敏感，当试样中某处含有晶体缺陷时，意味着该处相对于周围完整晶体发生了微小的取向变化，导致了缺陷处和周围完整晶体具有不同的衍射条件，将缺陷显示出来。可见，这种衬度对缺陷也是敏感的。基于这一点，衍衬
12、技术被广泛应用于研究晶体缺陷，当然也包括对蛋白质晶体的研究。（a）明场像 (b)暗场像 (c)中心暗场像图3 TEM的成像方式1.3.3 相位像当样品薄至100nm以下时，电子可以传过样品，波的振幅变化可以忽略，成像来自于相位的变化。由于试样很薄，衍射波振幅甚小，透射波振幅基本上与入射波振幅相同，非弹性散射可忽略不计。衍射波与透射波间的相位差为2。如果物镜没有象差，且处于正焦状态，而光阑也足够大，使透射波与衍射波得以同时穿过光阑相干。相干结果产生的合成波其振幅与入射波相同，只是相位位置稍许不同。由于振幅没变，因而强度不变，所以没有衬度。要想产生衬度，必须引入一个附加相位，使所产生的衍射波与透射
13、波处于相等的或相反的相位位置，也就是说， 让衍射波沿图X轴向右或向左移动2，这样，透射波与衍射波相干就会导致振幅增加或减少，从而使像强度发生变化，相位衬度得到了显示。 1.4 TEM的样品制备由TEM的工作原理可知其样品必须满足一下两个条件：供TEM分析的样品必须对电子束是透明的，通常样品观察区域的厚度以控制在约100nm到200nm为宜。所制得的样品还必须具有代表性以真实反映所分析材料的某些特征。样品必须导电。因此，样品制备时不可影响这些特征，如已产生影响则必须知道影响的方式和程度。 样品必须导电。TEM样品可分为间接样品和直接样品。这里将着重介绍一下生物样品的具体制备过程。1.4.1 TE
14、M的直接样品制备直接样品制备的主要工作是要将试样制备成为薄膜样品，使其对电子束“透明”，下面简要介绍一下生物样品的超薄切片法。一般细胞大小为微米数量级，比电镜要求的生物样品厚度在50nm左右，要对细胞进行“超微解剖”。制备超薄切片的一套方法叫超薄切片发。超薄切片发是透射电镜生物样品制备的诸方法中最经典、最基本的方法。生物样品超薄切片法的主要步骤有以下几个方面（1）固定：杀死组织，同时把从细胞间的联系直至细胞器的分子结构的全部组织的精细结构真实地保存下来（2）脱水：从组织中除去游离水分，并用一种既能和水又能和渗透液相混的惰性液体取代组织中的水（3）块染：由于生物样品的组成元素一般原子序数较低的元
15、素，因此直接将生物样品置于TEM观察，各个部分的质厚衬度相差不大，因此必须使组织某些成分结合重金属离子，引起电子散射能力差异，提高超微结构电镜图像的反差。（4）渗透和包埋：用另一种溶液或混合液取代脱水液。它们很容易硬化成固体，并且有足够的弹性，以切出50nm的平薄切片。（5）聚合：使渗入组织里的包埋液变硬，以便形成一个能牢固地支持组织的固态基质，而不混乱其空间联系。（6）切片：将带有组织的固态基质（称为包埋块）切成50nm左右的超薄切片。（7）切片染色：使载网上切片和重金属溶液反应，以增加组织成分的电子散射能力。31.4.2 TEM的间接样品制备有些材料不能直接制成薄膜样品，往往采用复型技术把
16、材料表面复制下来，制成复型膜，在电镜上观察。这种用复型膜形成的电子图像可称为复型像。常用的复型材料是非晶碳膜和各种塑料薄膜。 复型方法主要有：碳一级复型、塑料碳二级复型和萃取复型。下面将简单介绍一下用于生物样品制备的冰冻蚀刻技术。冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。操作过程如图4。标本置于-100C的干冰或-196C的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，
17、把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。 图4 冰冻蚀刻技术的操作流程2 扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM）TEM成像是依靠电子束穿过样品发生散射而得到的，因此对样品的厚度有严格的限制，一般需控制在200nm以下，更厚的样品电子束穿不透，也就无法成像。因此，一般透射电镜都不是观察样品本身, 而是观察从样品上复制出来的, 反映样品表面凸凹形状的复膜, 这也就限制了透射电镜的广泛应用。于是人们又进一步寻找分辨率比光学显微镜高, 又可以直接观察样品本身而不需要复型的显
18、微分析仪器。这样更加方便适用的SEM就应运而生了。2.1 SEM的工作原理SEM不是依靠透镜放大成像的原理，而是用细聚焦的电子束轰击样品表面，然后在样品表面激发产生某些物理信号，这些物理信号可以有效的反映样品表面状况，包括样品的表面形貌以及表面组成元素等。高能电子与样品相互作用产生的物理信号主要有二次电子、背散射电子、吸收电子、透射电子、俄竭电子、X射线、阴极发光和电动势等，如图5。现在SEM都与能谱（EDS）组合，可以进行成分分析。所以，SEM也是显微结构分析的主要仪器，已广泛用于材料、冶金、矿物、生物学等领域。下面将对在SEM中常用的二次电子、背散射电子和X射线这三种物理信号作重点介绍。4
19、 图5 入射电子束轰击样品表面产生的各种次级物理信号2.2 SEM的组成SEM的主要组成部分和TEM有些相似，可以分解为五个部分：电子光学系统、扫描系统、信号检测系统、显示系统和试样放置系统。这里就不再详细描述仪器的结构，仅就仪器各个组成部分的结构功能作简单的介绍。而其中的电子光学系统与TEM的电子光学系统基本一样，就不再赘述。2.2.1 扫描系统这一系统的作用是驱使电子束以不同的速度和不同的方式在试样表面扫描，以适应各种观察方式的需要和获得合理的信噪比。目前一般扫描电镜的扫描频率差不多与电视接收频率相同。扫描电镜能提供的扫描方式也有几种：最常用的是面扫描，用于观察适应的表面形貌或某元素在试样
20、表面的分布。点扫描主要用于对试样表面的特定部位作X射线元素分析。2.2.2信号检测系统对于入射电子束和试样作用时产生的各种不同的信号，必须采用各种相应的信号探测器，把这些信号转换成电信号加以放大，最后在显像管上成像或用记录仪记录下来。主要用的几种探测器有：二次电子探测器、背反射电子探测器、试样电流放大器、透射电流接收器和X射线探测器。这里就不作一一展开了。2.3 SEM的成像方式2.3.1 二次电子像入射电子与样品相互作用后，使样品原子较外层电子（价带或导带电子）电离产生的电子，称二次电子。二次电子能量比较低，习惯上把能量小于50eV电子统称为二次电子，仅在样品表面5nm10nm的深度内才能逸
21、出表面，这是二次电子分辨率高的重要原因之一。二次电子的产额 K/cos，K为常数，为入射电子与样品表面法线之间的夹角，角越大，二次电子产额越高，这表明二次电子产率对样品表面的原子序数关系不大而对表面形貌非常敏感。因此二次电子像是表面形貌衬度。如图6所示。用二次电子信号来调制显像管的栅极, 就会得到一幅反映样品表面形貌的图像。图像放大倍数等于显像管屏幕上的线度与样品上电子束扫描的线度之比。改变放大倍数, 只需改变样品上电子束扫描的振幅就能实现。二次电子图像是扫描电镜中分辨率最高的图像，因此目前所有的扫描电镜都可使用二次电子信号得到图像。图6 衬度原理形貌2.3.2 背散射电子像入射电子束在样品原
22、子的电场作用下,一部分电子改变运动方向, 从样品表面反射回来, 叫做背反射电子。背反射电子在样品中能量损失程度不一, 但多数具有较高能量（与入射电子的能量接近）。我们一般把能量大于50eV的次级电子称作背反射电子。把电子探测器安装在样品的上方并在其捕集极上加以适当的负压, 就可以阻止低能的二次电子进入探测器, 只接收能量较高的背反射电。背射电子与二次电子最大的不同就是它的产额随样品的原子序数增大而增加，背散射电子的信号强度I与原子序数Z的关系为：式中Z为原子序数，C为百分含量(Wt%)。 所以背散射电子信号的强度与样品表面的组成元素有关，即与组成样品的各元素平均原子序数有关。从而可以得到以反映
23、样品元素组成情况为分布衬度的图像。如图7、8所示。图7 背散射电子（BE）与二次电子(SE)的信号强度与元素原子序数（Z）的关系图8 ZrO2-Al2O3-SiO2系耐火材料的背散射电子成分像，1000ZrO2-Al2O3-SiO2系耐火材料的背散射电子像。由于ZrO2相平均原子序数远高于Al2O3相和SiO2 相，所以图中白色相为斜锆石，小的白色粒状斜锆石与灰色莫来石混合区为莫来石斜锆石共析体，基体灰色相为莫来石。2.4 特征X射线及能谱分析部分入射电子和核外电子作用，处于基态的核外电子吸收能量，向外层轨道跃迁，处于激发态。激发态的电子是不稳定的，会以辐射的方式向外释放能量，重新回到基态，释
24、放的能量中有部分是以x射线的方式释放，这部分x射线就是我们所说的特征x射线。由于不同元素的特征射线的能量或波长都有确定的特征值, 通过对特征射线的能量进行“色散”可以展开形成一个谱。根据谱上特征峰的能量位置, 可以确定样品中含有哪些元素并且根据特征峰的高度, 可以对元素的含量进行半定量和定量分析。这就是通常作为扫描电镜主要附件的射线能谱仪的基本原理。通常把测量出特征X射线波长的方法叫波长色散法（WDX），测定特征X射线能量的方法叫能量色散法(EDX)。2.4.1 波谱和能谱的比较在元素分析中，波长色散法与能量色散法各有其长处和不足。波谱分辨率高，能分析超轻元素（Be以上），定量分析技术比较成熟
25、，这是光谱仪的优点；而分析速度快，检测效率高，所用入射电子束流较小，则是X射线能谱仪的长处。目前一般扫描电镜同时装有X射线光谱仪和能谱仪，以满足快速定性和精确定量分析的要求。2.4.2 定性分析样品表面元素的定性分析的基础是Moseley关系式：式中为元素的特征X射线频率，Z为原子序数，K与均为常数.由式可知，组成试样的元素(对应的原子序数Z)与它产生的特征X射线波长()有单值关系，即每一种元素都有一个特定波长的特征X射线与之相对应， 它不随入射电子的能量而变化。如果用X射线波谱仪测量电子激发试样所产生的特征X射线波长的种类，即可确定试样中所存在元素的种类，这就是定性分析的基本原理。2.4.3
26、 定量分析试样中A元素的相对含量CA与该元素产生的特征X射线的强度IA (X射线计数)成比:CAIA，如果在相同的电子探针分析条件下，同时测量试样和已知成份的标样中A 元素的同名X 射线(如K线)强度，经过修正计算，就可以得出试样中A元素的相对百分含量CA：式中CA为某A元素的百分含量,K 为常数，根据不同的修正方法,K 可用不同的表达式表示，IA和 I(A) 分别为试样中和标样中A元素的特征X 射线强度，同样方法可求出试样中其它元素的百分含量。52.5 SEM的样品制备用于扫描电镜的样品大体分为两类：一是导电性良好的样品，二是不导电的样品。对于前者一般可以保持原始形状，不经或稍经清洗，就可以
27、放到电镜中观察。但对于导电性不好的样品，活在真空中有失水、放气、收缩变形现象的样品，需经适当处理，才能进行观察。生物样品，因其表面常附有粘液，组织液，体内含有水份等，用扫描电镜观察前，一般都需要进行脱水干燥，固定，染色，真空镀膜等处理。62.6 SEM的发展2.6.1 环境扫描电镜( environmental scanningelect ron microscope，ESEM) （邵曼君等.2005）ESEM是近年发展起来的新型扫描电镜。它与常规扫描电镜(SEM)的主要区别在样品室：常规扫描电镜样品室真空度必须优于10 - 3Pa，绝缘样品需要表面金属化；而ESEM 的样品室通入气体处于低真
28、空的“环境”状态，根据气体电离及放大原理，非导体及含水样品可以不经表面喷涂处理(喷金或喷碳)就能直接观察。这对一般含水的生物样品来说显得非常重要。72.6.2 扫描免疫电镜技术（immunoelectron microscopy）免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。它主要分为两大类：一类是免疫凝集电镜技术，即采用抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察；另一类则是免疫电镜定位技术。该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电子显微镜下观察，由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。免疫电镜的应用
29、，使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平。2.6.3 低温电镜技术和三维重构技术当今结构生物学引起人们的高度重视，因为从系统的观点看生物界，虽然生物大分子处于最低位置,可它决定高层次系统间的差异。三维结构决定功能结构是应用的基础：药物设计,基因改造，疫苗研制开发，人工构建蛋白等，有人预言结构生物学的突破将会给生物学带来新的革命。电子显微学是结构测定重要手段之一。低温电子显微术的优点是：样品处于含水状态，分子处于天然状态；由于样品在辐射下产生损伤，观测时须采用低剂量（lowdosetechnique)；观测温度低，增强了样品耐受辐射能力；可将样品冻结在不同状态，观测分子结构的变化，通过这些技
30、术，使各种生物样品的观察分析结果更接近真实的状态。 低温电镜技术和三维重构技术是当前生物电子显微学的研究热点.主要是研讨利用低温电子显微镜（其中还包括了液氦冷台低温电镜的应用）和计算机三维像重构技术，测定生物大分子及其复合体三维结构。如利用冷冻电子显微学测定病毒的三维结构和在单层脂膜上生长膜蛋白二维晶体及其电镜观察和分析。8参考文献：1. 徐柏森 杨静。实用电镜技术。东南大学出版社，20082. 马萍。磁透镜的工作原理及其在电镜中的应用。青岛大学学报.2001,14(2):67-703. 凌诒萍 俞彰。细胞超微结构与电镜技术。上海医科大学出版社，20084. 郭素枝。扫描电镜技术及其应用。 厦门大学出版社，20065. 张大同。扫描电镜与能谱仪分析技术。华南理工大学出版社，20096. 赵绍唐。SEM515扫描电子显微镜的原理与应用。 航空兵器，1991，（2）：7. 邵曼君。环境扫描电镜及其应用。1998, 27(1): 48-52.8. 付洪兰。实用电子显微镜技术。高等教育出版社，2004
