1、国家自然科学基金标书2项目类别申报学科代码1科学部编号AC03030306国家自然科学基金申 请 书项 目名 称：产瘫后关节主动肌与拮抗肌同步收缩发生机制的研究制的基础研究申 请 者：所 在 单 位：邮 政编 码：200433通讯地 址：电 话：传 真：电子信箱 (Email):KeJiChuFudan.Edu.Cn申 请 日 期：2002年3月国家自然科学基金委员会1997年制填 报 说 明 一、填写申请书前，请先查阅国家自然科学基金有关项目申请办法及规定。申请书各项容，要实事，逐条认真填写。表达要明确、严谨，字迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现的缩写词，须注出全称。 二
2、、申请书为十六开本，复印时用B5复印纸，于左侧装订成册。第三页起各栏空格不够时，请自行加页。一式六份（至少一份为原件），由所在单位审查签署意见后，按申报学科投送国家自然科学基金委员会对口科学部。地区科学基金项目，申请书另报送省（自治区）科委一份原件。 三、封面右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别和申报学科代码1由申请者填写。 四、下列人员不得作为申请项目的负责人提出申请，但可作为项目组成员参加研究： 在读（含在职）研究生 已离退休的科研人员 申请单位的兼职科研人员 五、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请（含参加）的项目数，连同在研的国家自然科学基金项目数（不含重点项目
3、、重大项目），不得超过两项。 六、同一项目组研究容相近的项目，只允许报送一个学科。 七、申请者可因同类项目竞争等原因，提出不宜评议本项目的专家（与单位，3人以），密封于信封中，钉在申请书原件封面，或另专函相关学科，供科学部选择同行评议人时参考。科学部将对此信息。 八、国家自然科学基金委员会地址：市海淀区双清路83号，通讯地址：8610信箱。 邮政编码：100085 一、简表研究项目名称中文产瘫后关节主动肌与拮抗肌同步收缩发生机制的基础研究英文Basic study of mechanism for co-contraction of agonists and antagonists in ob
4、stetric brachial plexus palsy(OBPP)类别 A.自由申请 B.高技术探索 C.青年 D.地区高技术探索项目主题号 E.重大 F.重点 H.专项A申报学科名称1骨外科学名称2神经外科学 A. 基础研究 B. 应用基础 代码1C03030306代码2C03030307B申请金额20.00万元起止年月2003 年1 月至 2005 年12月所用实验室A. 国家重点 B. 部门开放实验室编号B申请者姓名中文性别A. 男出生年月民族名称汉拼音B. 女A号代码01专业技术职务名称教授学位 A. 博士 B. 硕士 C. 学士 A博士学位授予国别或 地 区国(地区)名中国A.
5、院士B. 博士生导师C. 博士后代码011代 码156B所在单位名 称系（所）单位代码性 质A. 高等院校B. 科研机构C. 其它邮政编码隶属关系名称教育部A申请者代码360所在地 省 (自治区、直辖市) 市(县) 静安区乌鲁木齐中路12号项目组总人数高级中级初级博士后博士生硕士生参加单位数52121号专业技术职务所在单位名称及代码项目中的分工签字副教授分子生物学研究主要成员(不含申请者)博士生细胞生物学研究博士生趋化性实验研究技师实验检测1研究容和意义摘要分娩性臂丛损伤后主动肌拮抗肌同步收缩严重妨碍肢体功能恢复，其发生机制不明。本项目将在复制出产瘫较成人臂丛损伤瘫瘫后较较易发生同同步收收缩的
6、动物模型后，研究幼年动物神经再生的趋化性特征、雪旺氏细胞及髓鞘成熟的形态特点、远断端神经雪旺氏细胞及近端神经胞体等结构分泌神经趋化因子等相关成分的功能特征，从而阐，明产瘫同步收缩的发生本质，为，相应治疗疗提供依据主题词1. 主题词数量不多于三个；2. 主题词之间空一格（英文用/分隔）。中文分娩娩性臂丛损伤同步收缩机制英文Obstetric brachial plexus palsy/ Co-contraction / Mechanism简 表 填 写 要 求一、简表容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最新发布的国家自然科学基金申请项目分类目录及代码为准
7、填写。高技术探索课题主题号按高技术新概念新构思探索课题项目指南中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。二、凡选择性栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。三、部分栏目填写要求：项目名称应确切反映研究容和围，最多不超过25个汉字 (包括标点符号）。基础研究指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。应用基础研究指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。申报学科申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。申请金额以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。起止年月
8、起始时间从申请的次年1月算起。终止时间为完成年度的 12月。所用实验室系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的开放实验室。所在单位名称及代码按单位公章填写全称。例如“中国科学院光学精密机械研究所”不得填“中科院光机所”或“光机所”。全称中的数字，一律写中文，例如：中国航天工业总公司第七一所。首次申请国家自然科学基金的单位，尚未编入单位代码，其代码暂不填写。参加单位数指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位(合作者所在单位)，以阿拉伯数字表示。项目组主要成员指在项目组对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作用的人员，本人应在申请书
9、上亲自签名。本栏双线右侧容不输入计算机。研究容和意义摘要与主题词均录入软盘。2二、立论依据 （包括项目的研究意义、国外研究现状分析，并附主要参考文献及出处） 对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。产瘫是指在分娩过程中，胎儿的臂丛神经因遭受到头肩分离暴力而发生的牵拉性损伤，其疗效目前仍未获得根本性突破，原因之一在于对其病理本质及演变规律认识有限，致使临床上对此损伤的最佳神经探查时机及手术方式仍存在较大的争议(1)。Narakas(1987)首先描述了产瘫自然恢复过程中因神经的无序再生(H
10、aphazard reinnervation)而导致的嗽叭征-一种因肩旋、外展、屈肘肌同步收缩而发生的手摸嘴姿势畸形，此后，有关同步收缩对于产瘫功能恢复的危害性逐渐被认识。所谓同步收缩，是指主动肌兴奋时，拮抗肌也同时产生收缩(在正常情况下应放松)，此时患肢虽然肌肉饱满，收缩有力，但难以产生有效动作，其神经再生实属无效。我国学者庄垂青(David chwei-chin1998)(2)详述了产瘫后期的各种肩部畸形，指出再生神经的交叉支配(Cross-innervation)导致的同步收缩是阻碍肩功能恢复的原因之一,据此提出采用胸大肌及大圆肌重建肩外展功能；此后，他(2002)(3)又根据肘关节的主
11、动肌与拮抗肌同步收缩的发生现象采用肱二头肌移位于肱三头肌恢复伸肘功能-在肱桡肌能维持屈肘的前提下。笔者(2000)(4)在临床上发现，产瘫发生同步收缩现象远较成人臂丛损伤多见，并采用神经电生理方法建立了同步收缩的量化检测方法及指标，同时还证明在正常幼儿中不存在此种病理现象；以后，又根据检测结果采用背阔肌斜方肌等重建肩外展及外旋功能，获得较好疗效(5)。除手术治疗外，尚有采用肉毒杆菌毒素A局部注射使拮抗肌休眠而恢复肌平衡的方法(6)。以上这些关于同步收缩的研究报道仅限于临床现象的描述及治疗方法的探索，并不涉及到其发生本质的研究，致使目前临床上仍缺乏完善的防治措施。笔者设想，同步收缩产生的原因可能
12、在于婴幼儿周围神经雪旺氏细胞的特殊性(如某些特定结构功能不健全)，缺乏对神经再生的趋化作用，使本应长入主动肌的再生轴索支配了拮抗肌纤维，反之亦然。如果这种设想得到实验证实，可能对产瘫相关后遗症的防治产生积极意义。神经的趋化性研究自八十年代以来一直受到学术界的关注。我国学者饶毅的课题组(Rao Y, 1999) (7)首先从大鼠的嗅觉中枢提纯与分离到了一种神经趋化因子（Slit蛋白），从而揭示了神经再生趋化性的分子学基础。目前周围神经再生趋化性的组织特异性(神经近端长入神经远端)、终未器官特异性(感觉神经和运动神经分别长入相应远端)特征己获广泛认同(8)，但对解剖特异性(近端长入同名神经的远端)
13、的研究尚有不同报道：Politis及我国学者庆(Zhao Q)(9)均实验性证明了解剖特异性的存在，但也有相反的研究结果 (10)。有关幼年动物神经趋化性特征的研究尚未见报道，而不同年龄动物神经再生趋化差异的比较研究可能为最终阐明产瘫同步收缩的机制奠定理论基础。3-1 三、研究方案1. 研究目标、研究容和拟解决的关键问题研究目标本研究的目标是通过实验研究阐明产瘫较成人臂丛损伤更易发生主动肌拮抗肌同步收缩的病理本质及相应的细胞和分子生物学基础，为临床上开展产瘫早期神经探查、精确修复（以防止神经的错向生长），以及后期功能重建动力肌的合理选择（尽可能采用拮抗肌作动力）提供理论依据。研究容(1) 建立
14、产瘫较成人臂丛损伤更易发生主动、拮抗肌同步收缩的动物模型：通过对幼年及成年大鼠臂丛切断、置管连接后其主动肌、拮抗肌神经再支配的诱发肌电位检测，比较两组动物主动、拮抗肌同步收缩发生程度的差异，从而建立模拟临床现象的实验模型。该模型的成功建立，将使我们的临床发现得到实验性验证并证明此现象的病理基础主要存在于周围而非中枢神经系统。(2) 研究造成幼年大鼠较易发生同步收缩的病理基础： 将通过比较两组动物神经再生时趋化性在组织和解剖特异性水平的差异，阐明其病理基础。所谓“组织特异性”是指再生神经选择性进入远端神经膜管的能力，而“解剖特异性”指再生神经选择性进入同名神经远端的能力。由于臂丛根干部无主要特定
15、单一神经(产瘫均为根干部损伤)，难以检测神经再生的解剖特异性，而坐骨神经己是公认的研究趋化性的合适部位，故本课题将坐骨神经作为趋化性研究的替代神经。将研究幼、成年两组大鼠切断之坐骨神经近断端长入远端神经膜管的轴索数量之差异，并在此基础上比较两组大鼠切断之胫神经近端再生轴索长入远端胫神经膜管的能力，从而判断两组大鼠神经趋化性在组织及解剖特异性水平有无差别。在确定“趋化性”差异是造成同步收缩的主要原因后，将进一步研究导致这种病理现象的细胞和分子生物学基础。(3) 研究导致幼年大鼠神经趋化性差的形态学基础： 将采用电脑图象切片分析及电镜等技术，分析两组大鼠在周围神经雪旺氏细胞器成熟度及髓鞘厚度等发育
16、方面的差别，同时再采用免疫组化技术比较组成髓鞘主要成分P0蛋白在两组动物中的不同, 从而明确导致幼年大鼠神经趋化性差的形态学基础，并为寻找更深层次的原因奠定基础。 (4) 研究导致幼年大鼠神经趋化性差的生化原因： 将对两组大鼠经过预变性的周围神经标本，采用分子生物学技术检测与神经趋化相关的生化因子(如Slit蛋白)等在远断端雪旺氏细胞及神经元胞体等结构的表达，并比较二者的差异，从而在基因水平揭示产瘫较成人臂丛损伤更易发生主动、拮抗肌同步收缩的生化基础。拟解决的关键问题(1) 将3mm硅胶管桥接切断的臂丛上干，复制出产瘫较成人臂丛损伤更易发生同步收缩的动物模型； (2) 用Y型管桥接法建立比较神
17、经趋化性在组织和解剖特异性水平差异的动物模型； (3) 建立雪旺细胞器及髓鞘成熟度的定量检测方法； (4) 设计检测神经趋化因子(如slit蛋白)mRNA水平表达量及表达部位的方法。42. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 I建立比较产瘫及成人臂丛损伤后同步收缩发生差异的实验模型 取幼年(新生大鼠)和成年 (生后3月，相当于人类青壮年) 大鼠各15只，显露右侧臂丛上干并切断，用硅胶管套接使形成3mm的神经缺损。3月后暴露并刺激C5神经根，于三角肌、大圆肌记录波幅并计算比值；同法刺激C6记录肱二头肌、肱三头肌波幅并计算比值。用非参数统计方法可比较两组大鼠同步收缩发生程度的差异。可
18、行性分析：我们既往的研究已经证实大鼠与人类臂丛解剖形态相似，是模拟人臂丛损伤的理想的动物模型。II 研究不同年龄大鼠神经趋化性在组织特异性水平的差异 取幼、成年大鼠各20只，游离坐骨神经并切断，将其近端与自制Y型硅胶管近端相吻接，Y型管两出口端分别接神经远端与游离肌腱（神经缺损6mm）。术后3、6周分别检测实验侧与健侧坐骨神经的传导速度和波幅，计算两侧传导速度比值和波幅比值。然后取Y型管坐骨神经近、远端再生组织制成切片，作髓鞘染色后计数有髓轴索量，并计算两者比值。均采用非参数统计比较差异。III不同年龄组大鼠神经趋化性在解剖特异性水平差异的研究 取幼、成年大鼠各20只，于右股后区游离胫、腓总神
19、经并切断，将胫神经近端与Y型管近端相吻接，Y型管两出口端分别接胫、腓总神经远端（神经缺损6mm）。于术后3、6周分别检测胫、腓总神经侧的波幅和传导速度，计算两侧的波幅比值和传导速度比值，然后取Y型管远端胫、腓总神经的再生组织，作髓鞘染色计数有髓轴索量，计算两侧的比值。统计方法同上。可行性分析：成年动物在组织和解剖特异性水平的神经再生趋化性特征己得到较多实验证实，本实验必要时可采用较高级的动物(如狗)重复解剖特异性的研究。IV不同年龄大鼠正常坐骨神经的雪旺细胞形态和结构差异的研究(1)两年龄组正常坐骨神经髓鞘厚度及雪旺细胞成熟度的形态比较研究 取幼、成年大鼠各10只，将坐骨神经标本作透射电镜检查
20、：利用医用图像处理系统分别计算髓鞘厚度、轴索与神经纤维总直径的比值。此外，测量雪旺细胞线粒体数量与体积、核浆体积之比、基膜的厚度。t检验和非参数统计作结果分析。可行性分析：雪旺细胞成熟度的量化标准将与我校细胞超微与电镜教研室合作制定。(2)两年龄组正常坐骨神经Po蛋白表达量的免疫组化比较研究 取幼、成年大鼠各10个，用免疫组化法测定大鼠髓鞘的主要成份-Po蛋白的含量，t检验作统计分析。可行性分析：相关的免疫组化试剂已有商品化供应。 V不同年龄大鼠坐骨神经损伤后slit mRNA表达的定量和定位比较研究(1)不同年龄大鼠坐骨神经损伤后近远端slitmRNA表达量差异的研究 取幼、成年大鼠各18只
21、，一侧坐骨神经切断后用硅胶管套接（缺损5mm）。分别于术后1、3、7天取两组大鼠各6只，将实验侧坐骨神经近、远端制成标本；另取正常(未作手术)两组大鼠各6只，取相应的坐骨神经标本。根据slit的cDNA序列(Genbank 登录号：4506250)使用Primer3软件设计slit特异性引物，用 5-12. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析实时定量RT-PCR法检测相应标本的slitmRNA的表达量，用上述统计方法比较两组差异。（2）不同年龄大鼠坐骨神经损伤后神经近远端slit mRNA 定位与分布研究分别取上述术后7天和正常(未作手术)的幼、成年大鼠各2只(共8只)，将相应的
22、坐骨神经制成标本，制作Dig标记的slit -RNA 探针，作原位杂交，从而追踪slit-mRNA在不同年龄大鼠的(损伤或正常之)周围神经的表达与分布。可行性分析：神经趋化因子-slit蛋白在中枢神经系统已被提纯，但在周围神经领域中的研究鲜见报道。现有研究表明中枢神经系统的胶质细胞可分泌slit蛋白，故选择周围神经的相应结构-雪旺细胞等作神经趋化功能的研究，在理论上是合理的。我们将与本校国家开放重点实验室-神经生物学实验室开展合作，以完成神经趋化性的分子生物学研究。3.本项目的创新之处 (1)开展分娩性臂丛损伤后主动肌拮抗肌同步收缩发生机制的基础研究，其结果可能为临床上产瘫手术方式的改革提供理
23、论依据。(2)开展不同年龄动物神经趋化性差异的研究以及雪旺氏细胞器成熟度与神经趋化性关系的研究，为阐明“幼年动物神经趋化性差”的设想奠定细胞形态学基础。(3)开展周围神经中神经趋化因子（slit蛋白等）的基因水平检测，为阐明“幼年动物神经趋化性差”的设想奠定生化基础。5-24.年度研究计划及预测进展2003.1- 2003.12: 实验试剂、器材、及设备的准备，预试验；建立比较幼、成年大鼠臂丛损伤后同步收缩差异的动物模型；2004.1-2004.12 研究不同年龄大鼠神经趋化性在组织特异性及解剖特异性水平的差异；研究造成幼年大鼠神经趋化性差的细胞形态学基础；2005.1-2005.12: 研究
24、造成幼年大鼠神经趋化性差的生化学基础并完成系列论文。5.预期研究成果(1)幼年动物臂丛损伤后其同步收缩的发生较成年动物明显；(2)幼年大鼠神经趋化性在组织特异性水平较成年大鼠差；(3)幼年大鼠神经趋化性在解剖特异性水平也较成年大鼠差；(4)雪旺氏细胞发育不成熟是造成幼年大鼠神经趋化性差的细胞形态学基础；(5)幼年大鼠周围神经中神经趋化因子在损伤再生后的分泌不足是造成神经趋化性差的生化基础。上述成果的临床意义 (1)提示对于较严重的分娩性臂丛损伤应早期神经探查、精确修复，否则可能出现主动拮抗肌的同步收缩而使恢复无效； (2)对于晚期存在同步收缩的产瘫行功能重建时，应尽可能采用拮抗肌作动力肌，以在
25、增加动力的同时减少阻力。6 四、研究基础1.与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩2.已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况） 申请者所在单位是卫生部手功能开放实验室，有显微外科和神经病理研究室，拥有一流实验设备及仪器，但目前尚缺乏分子生物学实验的整套设备。准备与本校国家开放性实验室一神经生物学实验室合作，完成相关课题，目前己开始着手有关研究计划的按排。73.申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著目录*和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务；青年科学基金申请者还应注明学位论文名称
26、及导师与工作单位* 论文：作者题目刊名年份卷（期）页码 专著：作者书名出版者年份8 五、经费预算支 出 科 目金 额（万元）计 算 根 据 及 理 由1. 合 计20科研业务费1.0文献检索及国出差等费用实验材料费152.0Y型管及消耗性实验材料2.0实验动物(SPF级)及饲养5.0P0等免疫组化试剂及电镜标本制作和使用6.0相关基因探针制备及鉴定等分子生物学材料仪器设备费1.0肌电图仪的电极等配件实验室改装费0协作费2.0与病理科，神经生物学国家开放实验室等合作所需材料和劳务费项目组织实施费1.0项目鉴定、验收及论文发表等注: 预算支出科目按下列顺序填写: 1. 科研业务费 2. 实验材料费
27、 3. 仪器设备费 4. 实验室改装费5. 协作费 6. 项目组织实施费。开支围详见国家自然科学基金资助项目财务管理办法第二章。9 六、申请者正在承担的其它研究项目 （攀登计划、863计划、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号、任务来源、起止年月、负责或参加以及与本申请项目的关系等情况）严重创伤早期反应与后期修复的基础研究, 国家973项目 (批准号：G1990542)，项目来源于国家科技部。起止日期为2000年1月至2004年12月，本人作为其中第六子课题周围神经损伤及再生的基础研究的参加者。主要研究加速周围神经再生速度的调控因素、周围神经损伤的基因治疗及人工神经研制等，目前正按计划进行。七、申请者承担（负责或参加）国家自然科学基金资助项目的情况批准号项目名称起止年月负责或参加进展或完成情况39770748A39870743A臂丛神经根机能解剖的实验及临床应用基 础研究多因素修饰人工神经促周围神经定向再生 作用及机理探讨1998.1-2000.121999.1-2001.12负责参加按时完成并己上交总结报告按
