1、微生物遗传育种研究进展题 目： 微生物遗传育种研究进展 姓 名： 毛德昌 学 号： 20171103014 专 业： 微生物学 方 向： 微生物生态学 任课教师： 李翠新（副教授） 2017年12月29日微生物遗传育种研究进展摘要：微生物育种是现代工业、医药、食品等行业生产中重要的一个环节，本文中介绍了几种微生物育种的方法，包括诱变育种、杂交育种、代谢调控育种等育种方法，其中主要介绍微生物遗传育种一种新的育种技术低能离子注入育种技术和原生质体育种技术。低能离子注入育种技术为我国科学家所创建的一种技术，为微生物的育种工作提供了新的方法。关键词：微生物育种，离子注入，原生质体融合目录1前言 12自
2、然选育 13诱变育种 23.1物理诱变 23.2化学诱变因子 33.3生物诱变因子 43.4复合因子诱变与新型诱变剂 44杂交育种 44.1有性杂交 44.2准性杂交 54.3原生质体融合育种 54.3.1 原生质体融合的促融方法 64.3.2原生质体融合育种的应用 64.4 代谢控制育种 75基因重组 76小结 8参考文献 81前言微生物是自然界中广泛存在的生物群体，在工业、医药、食品、科研等行业中具有广泛的应用，在工业上是某些工业产物的产生个体，医药行业将的很多种药物是来源于微生物个体的初级或次生代谢产物，方方面面都有微生物的影子，对于微生物育种最早是来源于什么时候，这个也许应该可以追溯到
3、人类对微生物的应用。生活中到处都存在着微生物的影子，人类为了能够更加充分的利用微生物，就会将个体形状优良的微生物保留下来，以便将其更好的利用，这边开始了微生物的育种，儿这种育种似乎是对微生物的育种工作已经开展，只是仍然停留在一个比较初步的阶段。上世纪五十年以前对微生物的育种是在个体宏观表现上的对人类有用的形状上的育种工作，上世纪五十年代以后，DNA分子结构的确立，微生物的各个基因结构逐步得到阐释，微生物的各种代谢途径调控机制也逐步得到解释，对微生物进行遗传育种的方法也逐步开始出现多样化。微生物遗传育种的主要方法可以大概分为物理方法、化学方法和生物方法，或者将微生物的育种工作分为传统育种和现代生
4、物技术育种，二者的区别在于是否有现代生物技术方法参与育种工作。2自然选育不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。这类突变没有人工参与并非是没有原因的，一般认为自然突变有两种原因引起，即多因素低剂量效应和互变异构效应。所谓多因素低剂量效应，是指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等作用引起的突变。互变异构效应是指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配1。自然突变可能会产生两种截然不同的结果，一种是菌种退化而导致目标产量或质量下降；另一种是对生产有益的突变。为了保证生产水平的稳定和提高，应经常地
5、进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。在工业生产上，由于各种条件因素的影响，自然突变是经常发生的，也造成了生产水平的波动，所以技术人员很注意从高生产水平的批次中，分离高生产能力的菌种再用于生产。同时也可利用自发突变而出现的菌种性状的变化，去选育优良的菌株，如在味精发酵被噬菌体污染过程中，所选出的抗噬菌体菌株。自然选育是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种，防止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。但是自然选育的效率低，因此经常要与诱变育种交替使用，以提高育种效率。3诱变育种1927年Miller发现X射线能诱发果蝇基因突变。之后人们发现其他一些因素也能诱发基因突变，并逐渐弄清了
6、一些诱变发生的机理，为工业微生物诱变育种提供了前提条件。1941年Beadle和Tatum采用X射线和紫外线诱变红色面包霉，得到了各种代谢障碍的突变株。这之后诱变育种得到了极大发展。诱变育种是以诱变剂诱发微生物基因突变，通过筛选突变体，寻找正向突变菌株的一种诱变方法。诱变剂有物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂。3.1物理诱变物理诱变剂包括紫外线、X射线、射线、激光、低能离子等。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力，最大的吸收峰在260nm，紫外辐射能作用于DNA，因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂2。紫外辐射可以引起转换、颠换、移码突变或缺失等。紫外线是常用的物理诱变因子，
7、是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。由于紫外线的能量比X射线和射线低得多，在核酸中能造成比较单一的损伤，所以在DNA的损伤与修复的研究中，紫外线也具有一定的重要性。常用的电离辐射有X射线、射线、射线和快中子等。如射线具有很高的能量，能产生电离作用，因而直接或间接地改变DNA结构；电离辐射还能引起染色体畸变，发生染色体断裂，形成染色体结构的缺失、易位和倒位等。低能离子注入育种技术是近些年发展起来的物理诱变技术。该技术既以较小的生理损伤而得到较高的突变率、较广的突变谱，而且具有设备简单、成本低廉、应运行和维修、对人体和环境无害等优点。最近几年，低能离子用于微生物诱变育种研究也取得可喜成绩。目前利
8、用离子注入进行微生物菌种选育时所选用的离子大多为气体单质离子，并且均为正离子，其中以N+为最多，也有报道使用其他离子的，如H+、Ar+、C6+。辐射能量大多集中在低能量辐射区3。阮丽娟等（1993年）用低能离子注入糖化酶生产菌，仅仅经过l-2年时间，糖化酶生产菌活力已从平均发酵1.5万单位提高到2万单位，最高一株达2.6万单位4。氮离子注入法在近年来的生物育种上得到广泛应用，取得较好的效果5-9。菌种孢子经过离子束轰击，将氮离子注入菌种孢子内，经过生化反应，氮离子取代了和R碱基中的离子，形成了新的分子，改变了碱基的分子基团，从而改变了部分基因，达到基因突变的目的5-8。袁成凌等10（2003）
9、研究表明，在离子注人（10KeV，31014N+/cm2）条件下，后代菌株离散程度明显高于自然分离。经连续诱变处理，最终获得一株花生四烯酸高产菌I49-N18，该菌每升培养液可得生物量26.3g，干菌体中油脂含量为33.8%，其中花生四烯酸的含量占总脂的52.36%。而其AA产量高达4.66g/L，比对照N7菌株产量提高126.2%，且继代遗传功能稳定，表明I49-N18是一株极具工业化前景的高产菌，同时证明离子注人是一种有效的诱变手段。赵凤祥等11（2010）氮离子注入方法对提高龟裂链霉菌的产量正向突变频率有明显效果。此外还有赵楠等12（2010），付桂杰等13（2013）先后采用氮离子注入
10、井冈霉素产生菌诱变，选育春雷霉素高产菌株，且获得高产菌株，吕维勋等14同样也采用氮离子注入方法对非达霉素产生菌进行诱变筛选。除此之外，还有微波、双向复合磁场、红外射线和高能电子流等新诱变技术，它们与其他诱变源一起进行复合诱变，能起到很好的诱变效果，因此从某种意义上称这些诱变源为“增变剂”15。3.2化学诱变因子化学诱变剂是一类能与DNA起作用而改变其结构，并引起DNA变异的物质。其作用机制都是与DNA起化学作用，从而引起遗传物质的改变。化学诱变剂包括烷化剂如甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝基乙基脲、乙烯亚胺及氮芥等、天然碱基类似物、脱氨剂如亚硝酸、移码诱变剂、羟化剂和金属盐类如氯化锂及
11、硫酸锰等。烷化剂是最有效，也是用得最广泛的化学诱变剂之一，依靠其诱发的突变主要是GCAT转换，另外还有小范围切除、移码突变及GC对的缺失。化学诱变剂的突变率通常要比电离辐射的高，并且十分经济，但这些物质大多是致癌剂，使用时必须十分谨慎16。化学诱变作为一种经典而传统的育种技术，在育种研究领域仍然具有重要作用和地位，不仅在优良高产工业菌株选育中一直得到广泛应用，近年来还在拓展药源微生物菌株资源相关领域展露出新的应用研究发展空间。化学诱变与其他传统诱变育种方法一样，具有盲目性和随机性等不足，但也有无需知晓遗传背景和代谢途径、操作简便、不需要价格昂贵的现代高档仪器设备等显著优势。针对传统诱变的这些不
12、足，只要组合使用相关筛选技术，从而能够实现快速筛选目标菌株，化学诱变技术仍可通过优化诱变筛选实验操作程序，在微生物育种研究中进一步发挥不可替代的重要作用。迄今化学诱变育种研究多采用组合2种或2种以上化学或物理诱变因子的复合诱变方法。在实际实验操作中，有用不同种类的单一诱变剂交替进行2轮或多轮诱变的，也有用2种诱变剂同时作用或依次作用诱变的，还有化学诱变结合抗生素抗性的筛选等多种方式。但为了筛选获取目的菌株，无论何种诱变方式都要配合进行含量测定或相关活性筛选等工作17。3.3生物诱变因子生物诱变剂应用面比较窄，因此应用受到了限制。3.4复合因子诱变与新型诱变剂某一菌株长期使用诱变剂之后，除产生诱
13、变剂“疲劳效应”外，还会引起菌种生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢等，这对生产不利，在实际生产中多采用几种诱变剂复合处理、交叉使用的方法进行菌株诱变18。复合诱变是指两种或多种诱变剂的先后使用、同一种诱变剂的重复作用、两种或多种诱变荆的同时使用等诱变方法。普遍认为，复合诱变具有协同效应。如果两种或两种以上诱变剂合理搭配使用，复合诱变较单一诱变效果好。近年来，一些新型诱变剂被开发出来，并被证明有良好的效果。1996年，离子束诱变用于右旋糖酐产生菌，得到产量提高36.5的突变株；1999年N2激光辐照谷氨酸产生菌钝齿棒状杆菌，谷氨酸产量和糖酸转化率比对照提高31；此外，用红外射线诱变果胶酶产生菌、
14、双向磁场应用于产腈水合酶的诺卡氏菌种的诱变育种都得到了较好效果。4杂交育种杂交是指在细胞水平上进行的一种遗传重组方式。杂交育种是利用两个或多个遗传性状差异较大的菌株，通过有性杂交、准性杂交、原生质体融合和遗传转化等方式，而导致其菌株间的基因的重组，把亲代的优良性状集中在后代中的一种育种技术。通过杂交育种可以实现不同的遗传性状的菌株间杂交，使遗传物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质基础，扩大变异范围，获得新的品种。同时不仅可克服因长期诱变造成的菌株活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的“疲劳”效应19-21。常见的杂交育种有有性杂交、准性杂交和原生质体融合三种
15、。4.1有性杂交有性杂交是指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。凡能产生有性孢子的真菌，原则上都能像高等动、植物杂交预育种相似的有性杂交方法来进行育种20。一般方法是把来自不同亲本、不同性别的单倍体细胞通过离心等方式使之密集地接触，就有更多的机会出现种种双倍体的有性杂交后代。在这些双倍体杂交子代中，通过筛选，就可以得到优良性状的杂种。4.2准性杂交准性杂交是在无性细胞中所有的非减数分裂导致DNA重组的过程，微生物杂交仅转移部分基因，然后形成部分重组子，最终实现染色体交换和基因重组，在原核和真核生物中均有存在。准性杂交的方式主要有结合、转化
16、和转导，其局限性在于等位基因的不亲合性。有性杂交和准性杂交的常规形式见表1。表1 微生物常规的杂交形式类别杂交方式供体与受体细胞关系参与交换的遗传物质原核微生物接合体细胞暂时沟通部分染色体杂合转化细胞不接触，吸收游离DNA 片断个别或少数基因杂合转导细胞不接触，质粒、噬菌体介导个别或少数基因杂合真核微生物有性生殖生殖细胞融合或接合整套染色体高频率重组准性生殖体细胞接合整套染色体低频率重组4.3原生质体融合育种原生质体融合育种（protoplast fusion）是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。通过2个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交的目的。1960年，法国的Barsi研究小
17、组在进行2种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时日本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。1974年，匈牙利的Fereczy等22采用离心力诱导的方法实现了白地霉（Creotrichum candidum）营养缺陷型突变株原生质体的融合：随后人们相继用NaCl、KCl和Ca（NO3）2等作为诱变剂进行融合，但融合率比较低。1978年，国际工业微生物遗传学讨论会提出了原生质体的融合问题，使这一技术迅速扩展到了育种领域。1979年，匈牙利的Pesti等23首先提出了运用融合育种技术提高青霉素产量的报告，从而开创了原生质体融合技术在遗传育种中的应用。
18、微生物原生质融合技术是体内基因重组的一种方法，是在动植物细胞融合的基础上发展起来的。是将遗传性状不同的两种菌（包括种间、种内和属间）融合为一个新细胞的技术，其优点在于：（1）重组频率较高：（2）受接合型和致育型的限制小，将原生质体进行融合与细胞表面结构无关，二亲株中任何一株都可起受体与共体的作用，这有利于不同种属间微生物的杂交：（3）遗传物的传递更为完善，原生质融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，既有质配又有核配，原核微生物可以有2个或多个完整的基因组携带到一起的机会，放线菌中还能形成短暂的或拟双倍体的融合物，在真菌中能形成暂时的或稳定的双倍体。原生质融合技术主要包括原生质体的
19、制备、原生质体的融合、原生质体的再生和融合子的选择等步骤。4.3.1 原生质体融合的促融方法由于在自然条件下， 原生质体发生融合的频率非常低， 所以在实际育种过程中要采用一定的方法进行人为地促融合。（1）化学法用化学融合剂促进原生质体融合。化学试剂中最常用的是PEG 结合高Ca2+、pH诱导法。优点：不需要特别的仪器设备，操作简便。缺点：原生质体聚集成团的大小不易控制，且PEG本身对原生质体具有一定的毒性，可能影响原生质体的再生，另外融合率不高。（2）物理法用物理的手段（如电场、激光、超声波、磁声等）使亲本的原生质体发生融合。最常用的主要有电处理融合法、激光诱导融合法以及在电融合技术上改进的方
20、法等。优点：电融合条件可控，融合率高，无毒。缺点：设备条件要求高，费用较高。（3）生物法紫外灭活的病毒膜片能使细胞间产生凝聚和融合。病毒制备困难，操作复杂，试验重复性差，融合率很低，适用于动物细胞融合。4.3.2原生质体融合育种的应用蒋文泓等24以禽多杀性巴氏杆菌（Pasteurel lamultocida）5:A弱毒菌株与禽大肠杆菌O2弱毒菌株作亲本进行原生质体融合，成功获得3株具有双亲耐药性和双亲菌体血清型的融合菌株，为进一步研制细菌多联高效弱毒菌苗开辟了新途径。石海波等25将副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei HD1.7）与小白链霉菌（Streptomy ces
21、albulus）进行原生质体融合，获得了产生广谱高效肽类天然防腐剂的融合菌株。金玉娟等26采用原生质体融合技术对G+的链霉素抗性红霉素敏感的芽孢杆菌B12-13-2和G-的红霉素抗性链霉素敏感的欧文氏菌E26-2-3进行多批次原生质体融合，从稳定的284株融合子筛选到6株脱胶能力强的融合菌株，降低了脱胶成本，使生物脱胶实现产业化，避免了由化学脱胶工艺而引起的严重环境污染。裘娟萍等27以原生质体融合技术构建广谱抗噬菌体菌株。肖在勤等28将热灭活的凤尾菇原生质体与金针菇原生质体融合，选出双亲细胞质和细胞核都融合的无锁状联合菌株，经融合核分裂技术处理后，融合核分裂成为具有锁状联合的双核菌株。近年来，
22、灭活原生质体融合、离子束细胞融合、非对称细胞融合以及基因重排分子育种等新方法相继提出并且应用于微生物育种，这是原生质体融合技术的新发展。4.4 代谢控制育种代谢控制育种兴起于20世纪50年代末，以1957年谷氨酸代谢控制发酵成功为标志，并促使发酵工业进入代谢控制发酵时期。近年来代谢工程取得了迅猛发展，尤其是基因组学、应用分子生物学和分析技术的发展，使得导入定向改造的基因及随后的在细胞水平上分析导入外源基因后的结果成为可能29。快速代谢控制育种的活力在于以诱变育种为基础，获得各种解除或绕过微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使有用产物选择性地大量生成积累，打破了微生物调节这一障碍。从微生物育种
23、史中可以看出，经典的诱变育种是最主要的育种手段，也是最基础的手段，但它具有一定盲目性，代谢控制育种的崛起标志着育种发展到理性阶段，作为微生物育种最为活跃的领域而得到广泛的应用，它与杂交育种结合在一起，反映了当代微生物育种的主要趋势。代谢育种在工业上应用非常广泛。Tsuchida等采用亚硝基胍诱变等方法处理乳糖发酵短杆菌2256，最终选出一株L-亮氨酸高产菌，可在13%葡萄糖培养基中积累L-亮氨酸至34g/L。代谢控制育种提供了大量工业发酵生产菌种，使得了氨基酸、核苷酸、抗生素等次级代谢产物产量成倍地提高，大大促进了相关产业的发展。5基因重组基因重组是遗传的基本现象之一，菌株能够经过基因重组获得
24、新的遗传型，从而获得具有优良性状的菌种。基因重组是杂交育种的理论基础，由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，所以不论是方向性还是自觉性，都比诱变育种前进了一大步。基因工程育种技术在许多方面都有突破性的进展，主要体现以下几方面：（1）目的基因的获得，一般通过化学合成法、物理化学法、鸟枪无性繁殖法、酶促合成法、Norther杂交分析法、cDNA文库筛选法、杂交筛选法等方法获得目的基因；（2）载体的选择，基因工程载体主要是质粒和病毒。载体一般为环状DNA；（3）重组子体外构建；（4）重组载体导人受体细胞；（5）重组体筛选和鉴定，以合适的筛选方法选择具有最佳性能的突变重组子。6小结微生物
25、遗传育种在基因工程、细胞工程、蛋白质工程和酶工程等现代生物技术的支持下，创造出许许多多的设计技巧、科技含量高、目的性强、劳动强度低、效果显著的育种方法，为人类获得稳定性好、高产、新种类的工程菌株和开发新药和工业产品，以及提高产品产量和质量提供了有力的保障。参考文献1贺淹才.基因工程技术指南M.北京:科学出版社,1998, 922王付转,梁秋霞,李宗伟,等.诱变和筛选方法在微生物育种中的应用J.洛阳师范学院学报,2002,2:9598.3冯志华,孙启玲.低能离子注入微生物育种及其机制研究进展J.四川食品与发酵,2002,113(2):68.4吴定,路桂红低能离子注入法诱变微生物育种J.新技术新工
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