1、现代生化药学课后题答案第一章 PCR1 PCR的英文全称是什么? Polymerase Chain Reaction2 PCR是谁发明的？Kary Mullis3 PCR的基本原理是什么？PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA片段为模板，以一对分别与模板DNA互补的寡核苷酸为引物，在DNA聚合酶的作用下，根据半保留复制的机制沿着模板DNA链延伸，直至新的DNA合成。不断重复这一过程，则可使目的DNA片段得到扩增。4 PCR反应的产物中一般会生成几种长度不同的产物？反应结束时他们的含量分别是怎样的？PCR反应中一般会产生2种不同长度的产物：一种是预期长度的产物，一种是比预期长度长得多的产物；前者
2、以指数级数增加（2n），后者以几何级数增加（2n）。因此后者在总产物中所占比重很小，可忽略不计。5 一般PCR反应中包括几种基本成份？它们的功能分别是什么？7种基本成分:模板,特异性引物,热稳定DNA聚合酶,脱氧核苷三磷酸(dNTP),二价阳离子,缓冲液及一价阳离子,石蜡油(可忽略)模板：待扩增的DNA或RNA,甚至细胞；引物：与靶DNA的3端和5端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。只有每条引物都与靶DNA特异性结合，才能保证其特异性，引物越长，特异性越高。两段引物间的距离决定了扩增片断的长度；两引物的5端决定了扩增产物的5端位置。说明引物决定了扩增片断的长度、位置和结果。D
3、NA聚合酶：a.聚合作用，将dNTP中脱氧单核苷酸逐个加到3-OH末端,b.3-5外切酶活性，校正功能,c.5-3外切酶活性，切除错配核苷酸；石蜡油：维持恒热和整个体系中盐浓度，减少PCR过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。6 PCR反应对模板有什么要求（种类及质量要求等）？基因组DNA、噬菌体DNA、质粒DNA、cDNA、mRNA、预先扩增的DNA均可作为模板。PCR反应对模板纯度要求不是很高，经过标准分子生物学方法制备的样品即可以作为模板；但是模板中绝对不能含有蛋白酶、核酸酶、Taq酶抑制剂和任何可以结合DNA的蛋白；虽然片段长短不是影响PCR效率的关键因素，短片段模板PCR效率
4、更高；为保证反应的特异性，应使用ng级的克隆DNA、g级的单拷贝染色体DNA、或104拷贝的待扩增片段。7 什么叫PCR的引物？什么叫特异性引物？什么叫简并性引物？引物：所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5端决定扩增产物的5末端位置。(引物要大大过量)特异性引物：引物是与靶DNA的3端和5端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定的结构，才能保证其特异性。简并性引物：简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性,可以
5、参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏好,减少简并性。8 引物设计的基本原则有哪些？a.引物长度一般在2024bp(16,30)：这样长度的引物保证了不易形成杂合体；b.（G+C）%含量：两段引物的此数值应相近；在已知模板序列时应与模板的相近。40%-60%c.引物本身不能形成明显的次级结构，如发卡结构；d.两引物间不可发生互补(特别是3端，若不可避免那3端互补碱基不可超过2个碱基)；e.引物3端配对：引物3端为DNA聚合酶连上寡核苷酸的地方，因此该端5-6个碱基与DNA的配对必须严格、准确。9 PCR中使用的DNA聚合酶有哪几种，各具有哪些特点？a.Klenow片段：为DNA聚合酶的片段
6、，有聚合酶活性和35外切酶活性(最适37)；b.Taq酶：耐热DNA聚合酶，可耐受9395摄氏度(最适74-75)，是PCR普及的关键。它避免了不断补加DNA聚合酶的繁琐操作，提高了退火和延伸的温度，减少了非特异性产物和DNA二级结构对PCR的干扰，提高了PCR的特异性、敏感度和产量。它没有35外切酶活性，无校对功能，点突变较多。依赖Mg2+。c.Stoffel片段：第二代耐热DNA聚合酶，去除Taq酶的53外切酶活性，将97.5摄氏度的半衰期提高到20min，而Taq酶只有5min；对复合PCR（2个或以上模板位点的PCR）更有效；d.VentTMDNA多聚酶：耐受100摄氏度以上高温达2h
7、；具有校对功能(35外切酶活性)。e.RTth 逆转录酶：有依赖于RNA的耐热DNA聚合酶活性和依赖于DNA的耐热DNA聚合酶活性，这两种活性分别依赖于Mn2+和Mg2+。10PCR反应中对于加入的dNTP有什么要求？1）dNTP应具有一定浓度：50-200mol/L, 不得低于10-15。浓度过高会抑制Taq酶活性，较低浓度可降低错误掺入；高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度过低会导致产量过低；2）标准PCR中包含四种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，否则会诱导聚合酶错误掺入而降低产率、提前终止反应；3)不能反复冻融，否则会降解。11 PCR反应中加入的二价阳离子有什么功能？常用的是什么离子？缓
8、冲液中二价阳离子的存在至关重要，因为耐热DNA聚合酶需要游离的二价阳离子作为辅助离子，它影响着PCR的产量和特异性。常用Mn2+和Mg2+, Ca2+无效。(引物与dNTP都有二价阳离子结合)12 PCR反应一般分为几个步骤？各步骤有什么特点？A变性：双链DNA变成单链DNA。变性温度的高低由G+C含量决定；变性时间由DNA链长度决定。常规PCR变性条件为9495度45s。B 退火，将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；退火是使引物和模板DNA复性。复性过程采取的温度（Ta）至关重要。复性温度过高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率很低；复性温度太低，引物将产生非特异性复性，导致非
9、特异性的DNA片段的扩增。退火温度通常在比理论计算的引物和模板的熔解温度低35的条件下进行。C 延伸：寡核苷酸引物的延长，一般在耐热DNA聚合酶的最适温度下进行。对于Taq酶，为7278度。D 循环数：PCR扩增所需的循环数取决于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。一般扩展条件：9460s 3760s 72120s，共25-30个循环13 什么叫PCR的反应平台？形成的原因可能是什么？PCR反应不是无穷的进行，到了PCR后期，当产物达0.31pmol/L时，由于产物的堆积，使原来以指数增长的速率变成平坦的曲线。形成原因：由于引物和dNTP的减少，Taq酶失活；或由于底物过剩、非
10、特异性产物的竞争、变性时解链不完全、退火时产物单链自己缔合、最终产物的阻化作用。14 提高PCR反应的特异性一般可以使用哪几种方法？A 引物设计：引物长度、碱基配对是否严格、GC%含量、退火温度、引物浓度与纯度、稳定性、是否为简并性引物等；B 使用热启动：在变性完成之后再加入DNA聚合酶(或聚合酶才有活性)，这样可以提高特异性，因为DNA聚合酶在低温时也有活性，可能引起非特异的扩增。C 镁离子浓度：不同的模板和引物有不同的镁离子浓度，应进行预实验进行探索；较高的镁离子浓度会提高产量，同时降低特异性；dNTP浓度较高时应适当提高镁离子浓度。E 促进PCR的添加剂：降低DNA熔解温度，从而有助于引
11、物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区，可提高特异性和产率；F 使用巢式PCR：降低扩增多个靶位点的可能性，提高特异性15 常用的促进PCR特异性的试剂有哪些？甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱，PCRx Enhancer Solution。16 什么是热启动？在模板DNA完全变性后再加入DNA聚合酶（或使DNA聚合酶有活性）的方法，可减少低温下DNA聚合酶活性造成的非特异性扩增。17 RACE的全称是什么？Rapid Amplification of cDNA Ends（cDNA末端的快速扩增）18 什么叫定量PCR？利用PCR反应来测定样品中的DNA或RNA的原始拷贝数量。利用每个循环都能
12、同步侦测到PCR产物的增生，以获得达到反应饱和前的资料。(注：不能根据终产物量来确定起始拷贝数)19 为什么PCR中对产物进行终点检定量不准确？(PCR扩增曲线为S型曲线)随着PCR的进行，反应体系中的引物、dNTP，甚至模板都会供不应求，导致PCR的效率下降，产物增长速度越来越慢。直到Taq酶都被饱和后，反应就进入平台期。在实际实验中，由于各种环境因素的复杂相互影响，每个反应进入平台期的时间及平台期的高低都不同，导致终产物浓度各不相同。即使是重复实验，也不可能做到同时进入平台期。因此反应终产物与原始拷贝数无线性关系，定量不准确。20 什么是定量PCR的Ct值？Ct值是如何确定的?Cycle
13、threshold（Ct）：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，即在PCR中，荧光信号开始由本底进入指数增长的拐点处所对应的循环数。Ct值的含义是：PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。确定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省没置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。实验操作中，Ct值定义为极限上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射所对应的PCR循环次数。“基线上方”也就是阈值高度的量化，定义是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。阈值所在的横线与PCR扩增曲线的交点所指的PCR循环次数就是Ct值
14、。Ct值越小，模板DNA的起始拷贝数越多；Ct值越大，反之。正常：1830。Ct值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于试验质量。21 简述Taqman探针技术的原理。Taqman探针法是高度特异性的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的53外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号，由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5端标记有报告基团，3端标记有荧光淬灭基团，当探针完整的时候，报告基因所发出的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。
15、随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其53外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号强度就代表了模板DNA的拷贝数。根据其3，端标记的荧光猝灭基团的不同分为：普通的Taqman探针和TaqmanMGB探针22 解释下列各种PCR的基本原理：(1) RT-PCR （Reverse Translation-PCR）(获得基因完整编码区序列)RT-PCR是一种从细胞mRNA中高效灵敏地扩增cDNA序列的方法。由两大步骤组成，一是反转录(RT)；另一是
16、PCR。反转录的起始材料为RNA(mRNA)。RNA的提取：用异硫氰酸胍-酚-氯仿提取细胞中的RNA；mRNA的提取：亲和层析法(mRNA3端的polyA尾巴与固定相oligo(dT)特异性结合)；RT：在反转录酶的作用下，将mRNA反转录为cDNA第一链，即以oligo（dT）、随机六聚寡核苷酸或基因特异序列为引物，与mRNA结合之后，在反转录酶的作用下延伸合成cDNA第一链，再以其为模板PCR；PCR：设计基因特异的上下游引物，其中上游引物与cDNA第一链复性后延伸合成cDNA第二链，再以cDNA第一链和第二链为模板，用上下游引物进行PCR。(2) 多重PCR (肿瘤检测)用于检测多个基因
17、的表达，且这些基因都与某一疾病的检测、治疗或预后有关。其原理与常规RT-PCR相似，分为反转录和PCR两部分，不同点在于：在反转录过程，前者使用Oligo（dT）或随机六聚寡核苷酸为引物，而不用基因特异性引物；在PCR过程，前者需要设计多对引物，以扩增多个基因表达产物。(3) 3-RACE 3RACE用于mRNA已知序列下游(即3端)未知序列的扩增，可分为两步。 （1）以与polyA尾巴互补的序列为引物， 反转录获得3末端第一链cDNA序列（2）以靠近第一链cDNA3端的序列为特异引物合成cDNA第二链，再PCR扩增A反转录获得3末端第一链cDNA：3末端本身具有PolyA，可以与引物结合。引
18、物也同样具有oligo(dT)，但这种引物在5端有OP（Outer Primer）和IP（Inner Primer）的特殊结构，便于为以后的两轮PCR提供引物；在3端加入一个锚定核苷酸，可以使反转录在紧接着PolyA的交界处进行，这样可以有效减少同聚物的产生。B第一链cDNA3端的扩增：设计两种引物GSOP和GSIP。由于cDNA已含有外源性OP和IP序列，故可以用来自目的基因的GSOP和来自锚定序列的外源性OP进行第一轮扩增，用GSIP和IP进行第二轮扩增，以此增强特异性。(4) 简并PCR 一般PCR根据确定的核苷酸序列设计引物，简并PCR一般用于已知氨基酸序列而不知道核苷酸序列的情况。根
19、据氨基酸密码子的简并性，设计两组带有一定简并性的引物库，以扩增出未知核苷酸序列的基因。这些引物有很多相同碱基，但也有碱基不同，这样保证了和多种同源序列发生退火。(5) 不对称PCR不对称PCR的基本原理是采用不等量的一对引物产生大量的单链DNA。 分为引物浓度不对称PCR和热不对称PCR。结果是产生大量的单链DNA，又避免了在检测时要先出去剩余引物的操作。引物浓度不对称PCR：两引物的浓度不同，其中浓度低的为限制性引物，起决定性作用，只有当限制性引物耗尽后才会开始大量产生ssDNA；浓度高的为非限制性引物。前10-15循环为双链产物，而后为单链。常规热不对称PCR（常规引物长度不对称PCR）：
20、一对引物的碱基数目与组成不同造成退火温度不同。将限制性引物比非限制性引物的退火温度低至少10度。在刚开始的1015个循环中，退火温度略低于限制性引物的退火温度，产生双链DNA，以耗尽限制性引物；之后的退火温度便以非限制性引物的退火温度为准，大量产生单链DNA。交错式热不对称PCR(TAIL-PCR)：利用一系列序列特异性的巢式引物和一个短的任意引物引导扩增，一种半特异性的PCR(6) 竞争性PCR (C-PCR) (mRNA最精确的定量方法之一，定量PCR的改进)首先将mRNA逆转录为cDNA，然后在扩增体系中加入浓度已知的竞争性参考模板，这两种模板都可以与引物竞争性结合，但产物可因大小不同或
21、酶切位点不同而区分开。之后在凝胶电泳上测定两种产物的浓度后即可推断mRNA的初始浓度。(7)巢式PCR 由两轮PCR和两套引物组成。首先对靶DNA进行第一步扩增，然后从第一次反应产物中取出少量作为模板进行第二次扩增，第二次PCR引物与第一步反应产物序列互补，第二次PCR扩增产物即为目的产物。提高特异性和灵敏性。外侧引物25bp，退火温度高(68)；内侧引物17bp，退火温度低(46)(8) 降落PCR(touch-down PCR)降落PCR是Don于1991年最早发明的，退火温度起始于高于Tm值计算15度，之后每过一个循环温度降低1(或n)，直到达到一个较低的退火温度(Tm值以下5)，这个温
22、度为“touchdown”退火温度。由于正确和非正确的退火温度造成的产量是指数级的，因此可以使正确产物得到累计。当温度降低到非特异性退火温度时，就会发生非特异性结合，但此时的特异性结合产物已经累计了一个几何级数的优势，因此非特异性结合产物的量不会很多。第2章 放射性同位素知识和应用1 什么叫“核衰变”？放射性同位素的原子核很不稳定，会持续不断、自发放地出射线，直到变成另一种稳定同位素。衰变时可放出射线、射线、射线、电子俘获，但不一定几种同时都会放出。2 什么叫半衰期？特点是什么？半衰期：一定数量的放射性同位素原子数目减少到原来一半时所需要的时间。半衰期越长，说明衰变的越慢；反之越快。半衰期是放
23、射性同位素的特征参数，不同的放射性同位素有不同的半衰期。3 分子生物学实验室常用的几种放射性同位素有哪几种？他们的半衰期分别是多少？氢-3 ：12.3年( E最小) 碳-14 ：5720年 磷32：14.3天( E最大) 硫35：87.1天 碘131 ：8.05天 4 什么叫放射源？用放射性物质制成的，能产生辐射照射的物体。5 什么叫同位素示踪法？有什么优点？利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法。灵敏度高(1014-1018克水平)、方法简便、定量定位准确、符合生理条件。6 同位素示踪法中使用的同位素是哪种同位素?在不同的实验中、不同的实验要求下选用的同位素不同。一般情形是
24、根据实验目的和实验周期长短，来选择具有合适的衰变方式，辐射类型和半衰期，且放射毒性低的放射性同位素。7 什么叫同位素效应？指放射性同位素（或是稳定性同位素）与相应的普通元素之间存在着化学性质上的微小差异所引起的个别性质上的明显区别，对于轻元素而言，同位素效应比较严重。8 举例说明同位素示踪法在分子生物学核生物化学中的应用。物质代谢的研究、物质转化的研究、动态平衡的研究、生物样品中微量物质的分析、最近邻序列分析法物质代谢的研究：体内存在着很多种物质，究竟它们之间是如何转变的，如果在研究中应用适当的同位素标记物作示踪剂分析这些物质中同位素含量的变化，就可以知道它们之间相互转变的关系，还能分辩出谁是
25、前身物，谁是产物 ，分析同位素示踪剂存在于物质分子的哪些原子上，可以进一步推断各种物质之间的转变机制。9 放射性测量的原理是什么？探测仪可以分为哪2类？放射性同位素发出的射线与物质相互作用，会直接或间接产生电力和激发等效应，以此探测放射性的存在、强度和放射性同位素的性质。分为径迹型和信号型。10 闪烁计数器的工作原理是什么？闪烁型探测器由闪烁体-光电倍增管-放大器-分析器-定标器组成。闪烁体吸收射线后发出光信号，被光电倍增管收到而发生光电效应，转化成电信号并逐级放大，最后被定标器记录下来。放射性同位素越多，发出的光信号越多，电信号也越多。11 什么叫闪烁体？一类能吸收能量，并在1微秒内甚至更短
26、将能量以光的形式发射出来的物质。12 液体闪烁计数器和晶体闪烁计数器分别适合检测什么样的放射性线？液体闪烁计数器适合检测-ray和低能-ray；晶体闪烁计数器适合-ray。13 人体各种器官中，对辐射最为敏感的是什么器官?造血器官、胃肠道（小肠最敏感，胃和结肠次之）14 什么叫细胞的间期死亡？增殖死亡？细胞的间期死亡：细胞受辐射照射后，不经分裂，在几小时内死亡。（两类细胞发生间期死亡一类是不分裂或分裂能力有限的细胞，如淋巴细胞和胸腺细胞；另一类是不分裂或可逆性分裂的细胞，如成熟神经细胞、肝细胞、肾细胞等。）增殖死亡：细胞受辐射照射后，经1个或几个分裂周期后，因失去增值能力而死亡。主要是由于DN
27、A分子损伤后错误修复和染色体畸变等原因造成有丝分裂障碍。15 什么叫外照射？内照射？辐射的确定性效应？随机效应？外照射：辐射源由体外照射人体。生物效应强。如-ray、中子、X-ray。内照射：放射性物质通过某种途径进入人体，以其辐射能产生生物效应者为内照射。如ray。辐射的确定性效应：辐射的严重程度与照射剂量的大小有关，效应的严重程度取决于细胞群中受损细胞的数量或百分率。如白细胞减少、皮肤红斑脱毛、白内障。随机效应：效应的发生率与照射剂量的大小有关，这种效应在个别细胞损伤时即可出现，无阈剂量。如诱发癌症和遗传效应。16 放射防护的3原则是什么？放射实践正当化；放射防护最优化；个人剂量限制。17
28、 外照射防护的基本措施是什么？时间防护、距离防护、屏障防护。18 放射性的“三废”是指哪三废？放射性废气、废液、固废。19 外照射的，和伽马射线应该分别如何防护？粒子穿透能力弱，不会引起外照射损伤，纸可阻挡；辐射常采用低原子序列的铝或有机玻璃；X、射线常采用高原子序列的铅、铁或经济适用的混凝土等材料；20 医院中使用的X光机中有没有辐射源？为什么？没有。高速电子轰击靶物质时，会产生X射线。X光机的核心部分是X线管，通常由安装在真空玻璃壳内的阴极和阳极组成。阴极为钨丝，阳极则根据不同需要由不同材料制成多种形状。也就是说，X光机里没有“密封源”第3章 分子杂交技术1 核酸分子杂交的分子基础是什么？
29、核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区，这就是核酸分子杂交的基础。不要求两条单链碱基顺序完全互补。RNA-RNA, DNA-DNA,DNA-RNA2 举例说明哪些生物反应是属于探针靶反应？a抗原-抗体b.外源凝集素-碳水化合物c.亲和素-生物素d.受体-配基e.互补核酸间的杂交3 核酸探针的种类有哪些？各有什么特点？A基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类。B根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针及寡核苷酸探针等几类。C DNA探针还有单链和双链之分各自特点：DNA探针：最常用的核酸探针
30、；主要特点有：这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便DNA探针不易降解。一般可有效抑制DNA酶活性DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择。(多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列，须是特异的)cDNA探针：互补于mRNA的DNA分子(一般都为编码序列)。cDNA是由RNA经逆转录酶催化产生的不含有内含子序列，尤其适合于基本表达的检测。RNA探针：主要用于研究目的，而不是用于检测。高杂交效率，但也易降解、标记方法复杂（标记效率低）。寡核酸探针：链短、序列复杂度低、分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基对变
31、化一次可大量合成寡核苷酸探针，价格低廉，可用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记4 探针标记技术可以分为哪两类？非放射性标记技术(金属Hg,荧光物质FITC,半抗原如地高辛,生物素,酶如辣根过氧化物酶)和放射性同位素标记技术(32P 14.3天,35S 87.1天,125I 60天,3H 12.3年，其中32P最常用)5 核酸探针常用的酶促标记技术有哪几种？缺口平移、DNA快速末端标记、用T4多核苷酸激酶(PNK)标记DNA5末端、随机引物延伸(DNA聚合酶或反转录酶)、聚合酶链式反应(PCR，用于大规模检测和非放射性标记)6 缺口平移标记技术的原理是什么？利用了什么酶的哪些？原理：首先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链上制造一些缺口，缺口处会形成3-羟基末端，这时再在大肠杆菌DNA聚合酶的催化下将核苷酸残基加在3-OH上，同时根据该酶的53核酸外切酶活性，此酶将缺口5侧核苷酸依次切除。其结果是在缺口平移。若用高强度的放射性核苷酸（-32 PdATP）,即得到被标记的DNA探针。酶：DNA聚合酶的核酸外切酶活性，核酸外切酶水解核苷酸的活性7 DNA快速末端标记中使用的酶是什么酶？使用的常用同位素是什么？DNA快速末端标记
