1、药用植物生物技术学生复习提纲6第一章 绪论药用植物生物技术课程特色： 理论和实践相结合 与时俱进 理论课、实验课并重学会利用各种途径来学习该门课程。教学安排： 三大部分：绪论、植物组织细胞培养、基因工程及其应用：发酵工程、茎、茎尖培养、育种技术、种质资源保存、转基因植物。第一节 生物技术概述一、生物技术的概念 （掌握）What is biotechnology？“New” Biotechnology the use of cellular and biomolecular processes to solve problems or make useful products .（CB。 Fel
2、dbaum，2004） 1917年，匈牙利工程师Karl Ereky首次提出“生物技术”这一名词。 国家“863”计划生物高科技丛书： 生物技术是以现代生命科学理论为基础，利用生物体及其细胞的、亚细胞的和分子的组成部分，结合工程学、信息学等手段开展研究及制造产品，或改造动物、植物、微生物等，并使其具有所希望的品质、特性，从而为社会提供商品和服务的综合性技术体系。生物技术是一门应用生物科学研究成果，以工程手段增加数量或提高质量从而满足人类日益增长的对生物制品需求的技术，是一门建立在现代生命科学理论基础上的技术。简单地说： 生物技术是利用生物 (动物、植物或微生物) 或其产物，来生产对人类医学或农
3、业有用的物质或生物。生物技术与相关学科的关系：1生物技术的建立与发展依赖于相关学科理论的发展。2生物技术为生物学研究提供了新的实验体系，从而促进了生物科学的飞速发展。3是相辅相承，互相促进的。二、生物技术研究的主要技术范畴（掌握）1 细胞工程（cell engineering）细胞工程是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。1975年，科勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）首创杂交瘤技术，开创了细胞工程的新纪元。2 发酵工程（fermentation engineering） 发酵工程又称为微生物工程，是在人工控制的条件下，通过微生物的生命
4、活动而获得人们所需物质的技术过程。1944年，青霉素液体深层发酵的成功，标志着现代发酵工程时代的到来。随后各种抗生素、氨基酸、核苷酸、维生素等的发酵生产蓬勃发展，使发酵工程进入了全盛时期。3 酶工程和蛋白质工程（enzyme engineering and protein engineering）酶是具有特异催化功能的蛋白质，酶工程是酶的生产与应用的技术过程，即通过人工操作，获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其催化功能的技术过程。1969年，固定化氨基酰化酶首次在工业上成功地用于氨基酸的拆分，有力地推动了酶工程的发展。 4 基因工程（genetic engineering） 基因工程又称
5、为重组DNA技术，是指通过人工操作，在分子水平上进行基因重组、改造和转移，以获得具有新的遗传特性的细胞，合成人们所需物质的技术过程。1973年，科亨（Cohen）和波伊尔（Boyer）发明了克隆技术，成功地将外源基因转入大肠杆菌细胞并得以表达，宣告了基因工程的诞生。其后，各种基因工程药物层出不穷，转基因动物和转基因植物不断涌现，取得了激荡人心的丰硕成果。5 分子标记技术（molecular marker）分子标记又称为DNA分子标记，是指电泳后能以一定的方法检测到的可以反映基因组某种变异特征的DNA片段，是建立在DNA的多态性基础之上的可识别的等位基因。这种DNA片断可以通过限制性内切酶切割、
6、PCR扩增或两者结合来获得。实际上，现代生物技术在应用过程中，已难于分清不同生物技术的界限了。例如：我们在对某种生物活性物质进行生物转化的研究过程中，发现了生物转化的关键催化酶，通过蛋白质测序，了解了氨基酸序列，进而发现其cDNA序列，并将其在大肠杆菌中表达，获得工程菌，实现对该关键催化酶的高效表达。再通过发酵、基因、蛋白质、细胞、酶等多项生物技术来实现产品的工业化生产。因此，现代生物技术的研究与应用经常是多种生物技术手段综合的结果。三、生物技术的产生和发展 发展过程按其技术特征分为三个发展阶段：传统生物技术阶段（旧有的制造酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶等。它以酿造技术作为技术特征。）近代生物技
7、术阶段 1928年,青霉素的发现 20世纪40年代，出现以获取细菌的次生代谢产物抗生素为主要特征的抗生素工业。 50年代，氨基酸发酵工业。 60年代，酶制剂工业。现代生物技术阶段 以生物化学或分子生物学等方法来改变细胞或其分子的遗传形态，以达到生产对人类有用物质或生物的目的。 现代生物技术出现的标志： 20世纪70年代，DNA重组技术的建立。现代生物技术以基因工程为核心，包括基因工程、细胞工程、微生物工程、酶工程、蛋白质工程和生化工程等。（此分类方式为相对的，它们之间常常相互渗透，互为补充。）第二节 药用植物生物技术概述一、药用植物生物技术的概念药用植物生物技术（biotechnology i
8、n medicinal plant）是指将药用植物生物学原理和科学技术相结合生产有经济价值的产品或达到某种目的的一系列技术。通常是指应用发酵工程（fermentation engineering）、细胞工程(cell engineering)、酶和蛋白质工程（enzyme and protein engineering）、基因工程(genetic engineering) 等生物研究成果对药用植物进行品种改良、保护、遗传研究、中药鉴定等方面研究的技术，它是生物工程的一个重要组成部分。 研究对象：药用植物 研究方法：细胞工程、发酵工程、酶和蛋白质工程、基因工程等生物研究成果 基本手段：植物的组织
9、和细胞培养中药资源普查植物药有11 146种，涉及383科，2 309属，11 146种（含亚种、变种等种下等级）动物药有1 581种，涉及415科，861属矿物药有80种传统中药包括矿物药、动物药、植物药三部分。 矿物药的生物技术：人工养殖珍珠。（研究较少） 动物药的生物技术：人工养殖蝎子、蜈蚣、地鳖虫等药用动物。（20世纪80年代） 植物药的生物技术 ：主流或核心。生物技术进行传统药用植物生产的优点：1、药材（或有效成分）的生产可以在人为控制条件下进行，通过操作培养条件和培养方式极大地提高生产率。2、培养是在无菌条件下进行的，因此可以排除病菌和虫害的侵扰，严格控制药材质量。3、通过特定的生
10、物转化反应，大规模生产需要的有效成分。4、通过对有效成分合成路线进行遗传操纵，提高所需物质的产量。5、通过加入或删除基因而改变药材的遗传特性，有效地保持其生物优势。生物技术在中药领域中的应用（相关介绍）1、 单倍体、多倍体育种2、 体细胞突变育种3、 转基因抗病育种4、 药用植物及活性成分的工业化生产5、 转基因药材6、 中药鉴定7、 药用植物种质资源保存 等等中国药用植物生物技术研究成果： 罗汉果快速繁殖 （广西药物研究所） 怀地黄去病毒 （山东大学） 紫草毛状根大规模培养 （中国科学院植物研究所） 红豆杉毛状根大规模培养 （华中理工大学） 黄芪毛状根大规模培养 （上海中医药大学）生物技术在
11、药用植物中的应用前景（一）应用生物技术开展药用植物资源及品种选育工作。1.保护珍稀濒危物种，积极寻找代用品、类同品2.利用生物技术进行种质保存3.利用生物技术再生药用植物资源4.利用生物技术进行人工种子技术的研究 5.利用转基因技术培育药用植物新品种及品种的遗传改良（二）利用植物细胞培养生产次生代谢产物1利用发根农杆菌遗传转化获得毛状根生产次生代谢产物2次生代谢途径的基因工程3分子标记技术在药用植物研究上的应用前景第三节 生物技术与中药现代化中药现代化就是将传统的中医药的理论、优势及特色与现代科学技术相结合，并借鉴国际通行的医药标准和规范，研究开发安全、有效、可控、符合国际市场准入要求的中药产
12、品，以适应当代社会发展的需求。生物技术在中药现代化中的作用1生物技术在中药现代化研究中的作用（1）细胞工程在中药研究中的作用 （2）基因工程在中药研究中的作用 2利用生物技术保护和开发中药材资源 () 利用生物技术保护中药资源 () 利用生物技术研究中药资源生物多样性及可持续利用第二章 植物组织培养的基础技术药用植物组织培养的重要性 中国植物红皮书第一卷：共收载了388种国产珍稀濒危野生植物，其中有药用价值的100余种，在中国历史上就已赫赫有名的人参、天麻、黄连、黄芪、杜仲、厚朴、巴戟天、贝母 、肉苁蓉等，均位列其中。药用植物组织培养的优势 不受地区、季节与气候的限制。 便于工厂化生产。 组织
13、培养中细胞生长速度比植物正常生长速度快，接近于分生组织的生长速度。第一节 植物组织培养的基础理论一、植物细胞全能性(Cellular totipotency) 植物组织培养的理论基础 植物细胞全能性：指细胞携带着某种生物的一套完整的基因组，并具有产生该种生物完整个体的能力。细胞全能性的定义主要有3个含义：植物细胞无论是体细胞还是生殖细胞均具有该物种的全套遗传信息；只有在适宜条件下，植物细胞才具有发育成完整植株的能力；植物每个细胞均具有发育成完整植株的能力。植物细胞全能性的发展简史：植物细胞全能性的初步提出(19世纪30年代) ：德国2位学者Schleiden、Schwann创立了细胞学说，认为
14、细胞是生物体结构和功能的基本单位。 根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。1902年，德国植物生理学家Gottlieb Haberlandt 正式提出植物细胞全能性：就我所知，在营养液上培养高等植物细胞至今还没有进行过，但这样的工作有助于对细胞特性的认识，也有可能从植物细胞培养中得到完整的植物体，希望引起人们的重视。1898年，Haberlandt从叶片的栅栏组织和髓薄壁组织、表皮与表皮毛等组织中分离出生物活性细胞，并在含蔗糖的knop盐溶液中进行培养，观察到栅栏细胞有明显的生长，遗憾的是他没有看到细胞的进一步分化。他虽然未能获得再生植株，却是植物组织培
15、养的开创者。1902年他发表了著名论文植物细胞离体培养实验，论文中提出的植物细胞全能性的理论是植物组织培养的理论基础。因此被益为植物组织培养之父。实验验证： 20世纪30年代 white首次由番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系。 20世纪50年代 诱导培养银胶菊愈伤组织得到天然橡胶从曼陀萝花药培养出单倍体植物从胡萝卜体细胞培养出完整植株从哈伯兰特提出植物细胞全能性的理论，到1958年斯图尔德（F.C.Steward）等人第一次用胡萝卜根的韧皮部细胞证实了植物细胞的全能性，用了整整56年。56年中许多科学家做的事情归纳起来都是在探索哈伯兰特提出的“植物细胞在适宜条件下，有发育成完整植株的潜力
16、”中的适宜条件。20世纪60年代以后，植物组织培养进入了迅速发展阶段，并逐步走向生产应用，如快繁脱毒、单倍体育种、种质资源保存、生产次生代谢产物等，也为人工种子、细胞融合、转基因植物等奠定了基础。 从以往科学家的实验可以看出：植物组织培养四大典型实验植物：胡萝卜、矮牵牛、烟草、芸苔利用植物细胞全能性，可以开展：植物组织、器官培养；细胞培养；原生质体融合与培养；亚细胞水平的操作技术等工作和研究。利用动物细胞的全能性，可以开展：细胞培养（包括组织培养、器官培养）； 细胞融合；胚胎工程（核移植、胚胎分割）；克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆、个体克隆）等工作和研究。问题一：生物体内的细胞为什么没有表现
17、出全能性，而是分化成不同的组织器官？ 在生物体内，由于基因的选择性表达，细胞不能表现出全能性，而是分化成为不同的组织器官。 由此说明条件十分重要，或者说是关键的，只要条件合适，细胞潜在的遗传能力就会表现出来。植物细胞按照分裂能力分为三类：1、始终保持分裂能力（茎尖、根尖及形成层细胞）2、永久失去分裂能力的终端分化细胞（筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞）3、在通常情况下不分裂，但在受外界刺激后可重新启动分裂的细胞，如表皮细胞及各种薄壁细胞。从理论上讲，只要是一个生活的细胞，都有再生出一个完整植株的潜力，但实际情况并非如此简单，细胞的再生潜力与其分化程度呈负相关，即：细胞分化程度越高，其再生能力
18、越低。细胞全能性具有绝对性与相对性： 不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应；即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体；动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。问题二：植物细胞表现出全能性的必要条件是什么？全能性只是一种可能性，要把这种可能性变为现实性必须满足两个条件： 一是要把这些细胞从植物体其余部分的抑制型影响下解脱出来，也就是说必须使这部分细胞处于离体的条件下； 二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。 二、细胞分化、脱分化与再分化 细胞分化(cell differentiation) 导致
19、细胞或组织形成不同结构并引起功能或潜在发育方式改变的一种过程。 （许智宏，1998） 在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异。 细胞分化是相同基因型的细胞所具有的各个不同的表现型。 时间上的分化 一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态结构和功能； 空间上的分化 对于多细胞生物来讲，同一细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态结构和功能。脱分化 脱分化(dedifferentiation) 在组织培养中，不分裂的静止细胞，放在一定的培养基上后，细胞重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决
20、于它在自然部位上所处的位置和生理状态。根据细胞类型不同从强到弱： 营养生长中心 形成层 薄壁细胞 厚壁细胞(木质化细胞) 特化细胞(筛管、导管细胞)根据细胞所处的组织不同从强到弱： 顶端分生组织 居间分生组织 侧生分生组织 薄壁组织(基本组织) 厚角组织 输导组织 厚壁组织细胞脱分化过程中生理活动与细胞结构的变化脱分化过程中细胞结构会发生急剧变化。这些变化总体上包括： 细胞质显著变浓，大液泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加。液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要特征。根据脱分化过程的时空顺序，细胞的脱分化过程可分为三个阶段： 第一阶段为启动阶段，表现为细胞质
21、增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现； 第二阶段为演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体； 第三阶段为脱分化终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。问题三：离体的器官、组织或细胞如果不进行脱分化处理，能否培养成完整植物体？ 一个已分化的细胞要表达出其全能性，就必须经过脱分化的过程，这也是植物组织培养的目的所在。外植体脱分化的难易与植物种类、组织和细胞的生理状况有关。一般说来：单子叶植物和裸子植物比双子叶植物脱分化难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难；单倍体细胞比二倍体细胞难。细胞脱分化与愈伤组织的
22、形成细胞脱分化是细胞状态的改变，但成功的脱分化必然会导致细胞分裂。对于单细胞而言，分化细胞启动分裂发生在细胞完全脱分化之后。 愈伤组织的形成是脱分化的细胞重新进入活跃分裂的结果，但不是脱分化的过程。 有些外植体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞进而形成体细胞胚。 在组织器官培养时，愈伤组织内细胞的脱分化程度是不一致的。再分化 再分化(redifferentiation) 一个成熟的植物细胞经历了脱分化后，能再分化而形成完整植株的过程。 如由愈伤组织形成根、芽或胚状体等过程就是再分化的过程。具体过程为：一个已分化的细胞要表达出其全能性，就要经过脱分化和再分化的过程，这就是植物组织与细胞培养所要达到
23、的目的。细胞全能性的表达是通过细胞脱分化与再分化来实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前题，再分化是细胞全能性表达的最终体现。三、再分化途径器官发生途径是指在外植体或愈伤组织的不同部位分别独立形成茎、芽和根，即愈伤组织的部分细胞先分化产生芽/根，再在另一种培养基上产生根/芽，形成一个完整的植株。 胚状体发生途径是指在愈伤组织中产生出一些与种子胚相似的结构，即同时形成一个有苗端和根端的两极性结构，然后在另一种培养基上同时发展成带根苗，形成一个完整的植株。表2-1 器官发生与胚状体发生途径的主要区别器官途径形成的植株胚状体途径形成的植株单向极性，单个分生中心细胞内出现方向相反的两极分化
24、，具有根端和芽端两个分生中心不定芽和不定根与愈伤组织的维管相连无胚胎形态，分生中心直接分化为器官不定胚维管组织与外植体维管组织不相连不定芽的苗无子叶具有典型的胚胎形态发生过程形成的幼苗具有子叶一般先长芽后长根，或先长根后长芽胚状体发育的苗、根和芽齐全第二节 植物组织培养的分类与培养技术掌握一些基本概念：1、外植体 explant 由活植物体上取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。植物器官根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等 组织形成层、花药组织、胚乳、皮层等 细胞体细胞、生殖细胞等 胚胎成熟和未成熟的胚 原生质体脱壁后仍具有生活力的原生质体等 以上这些都可以作为外植体。2、愈伤
25、组织 callus由受伤组织形成或外植体诱导而成的一团不断分裂增殖的、无一定方向的、由薄壁细胞组成的细胞块。 3、继代培养 subculture指由最初的外植体上切下新增殖的组织，继续转入新的培养基上的培养。 植物组织培养的分类体细胞组织培养根据培养材料分类 性细胞组织培养 原生质体培养 植物细胞培养 固体培养 根据培养方式分类 静置培养 液体培养 振荡培养根据所采用的外植体来源和培养对象的不同可以分为以下4类：简单介绍各种方法，具体将在以后的章节中有详细的讲述。（一） 体细胞组织培养 植物的体细胞组成的器官都是二倍体组织，如根、茎、芽、叶，花的花瓣、花托、花丝、果皮、果肉、种皮。在实际应用中
26、，以芽培养、叶培养、茎尖培养和茎培养比较广泛和有较大的经济效益。1愈伤组织培养（callus culture）愈伤组织培养是对植物各种器官或组织增殖而成的细胞团的培养。利用愈伤组织培养，在理论上可以阐明植物细胞的全能性和形态发育的可塑性，还可以诱导产生不定芽或胚状体而形成完整的再生植株。根据目前的研究情况，几乎已成功地从各种植物诱导出了愈伤组织，也可以说所有的多细胞植物均有诱导产生愈伤组织的潜在可能性。理论上讲，诱导愈伤组织成败的关键不在于植物材料的来源，而在于诱发愈伤组织的培养条件。2器官培养(organ culture)器官培养是指对植物根、茎尖、叶、花器各部分及幼果等的无菌培养。在组织培
27、养研究范畴中，器官培养是研究最多，在应用上最卓有成效的培养。如茎尖培养通常用110mm大小的茎尖作外植体来进行植物的无性系繁殖，具有加速繁殖和去除病毒等优点。器官培养，一般指的是根、茎尖和叶的培养，将其归类于体细胞组织培养；而将花药、幼小果实等归类于性细胞组织培养。（二）性细胞组织培养植物性细胞组织培养主要是花药培养和胚珠等的胚胎培养1花药培养 花药培养是指利用花粉具有单套染色体的特点，诱导产生单倍体（Haploid）植株进行育种，为缩短育种周期获得纯系的培养。花药培养的重要意义在于能使花药内花粉（小孢子）发育形成单倍体植株。2胚胎培养(emlyo culture) 胚胎培养是指成熟的或未成熟
28、的胚的培养，包括胚培养、胚珠和子房培养、胚乳培养等。（三）原生质体培养 原生质体培养为细胞融合打下基础。 细胞壁的三个基本成分：纤维素、半纤维素和果胶物质。只有去掉细胞壁的原生质体才能进行体细胞融合，即杂交。原生质体培养(protoplast culture)是指将完整细胞的壁脱除后，对所获得的裸露植物原生质体的培养 。异种间体细胞杂交意义大，但较困难。体细胞融合后会互相产生排异性。（四）植物细胞培养(cell culture) 细胞培养是指为了某种目的而在细胞水平上对离体植物细胞进行的一系列生物工艺学操作。 包括：植物细胞悬浮培养（全自动控制的大容积发酵罐大规模工业化生产） 单细胞培养（看护
29、培养、微室培养和平板培养等） 植物细胞固定化培养（发酵罐中培养） 植物组织培养根据培养方法的不同分为两类： 1、 固体培养（solid culture）：培养基中加入一定量的凝固剂的培养。 优点：操作简单、设备简单、便于观察。 缺点：单面接触，养分接触不均衡。 2、 液体培养（liquid culture): 凡不加凝固剂的培养即为液体培养，用于大量细胞培养。 优点：适合于大量培养。液体培养 1、静置培养(stationary culture） 纸桥培养（材料特别少且特别珍贵） 2、振荡培养(shacking culture) 优点：培养材料均匀接触培养基，可保持良好的通气效果。第三节 培养所
30、需的基本设备与条件一、实验室组成组织培养实验室包括基本实验室和辅助实验室植物组织培养实验室两个关键技术环节 ：无菌操作和无菌培养 。组织培养实验室的布局：灭菌室温室基本实验室准备室 包括洗涤室、称量室、药品室、灭菌室用于器具的洗涤、干燥、保存；培养基的配置、分装和消毒；大型材料的切割、洗涤等。 要求宽敞明亮、通风效果好。基本实验室无菌操作室 在植物组织培养中，无菌操作室（clean chamber）是进行植物材料的分离及培养体转移的一个重要场所。由于植物组织培养需长时间的无菌操作，所以无菌条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。防止细菌和霉菌的混入是提高工作效率和影响生产成本的关键。 无菌室要求干净无菌、密闭、光线好，应防止空气对流。基本实验室培养室 培养材料生长、发育的场所。 具备： 1、控制温度和光照及湿度的设备。 2、固体培养用的多层培养架，液体培养用的摇床或转床等。 要求：能控制光照、温度和湿度温度 20-27 相对湿度 70-80% 光强3000lux左右 辅助实验室细胞学实验室 观察记录培养材料的生长情况及结果辅助实验室理化分析实验室二、仪器设备基本设备：包括天平、冰箱、PH试纸、电炉、纯水仪等无菌操作设备：超净工作台，要求防止空气对流，定期消毒。超净工作台是植
