1、PRUELAMP检测结核分枝杆菌在 中国区县实验室诊断性能评估PRUE-LAMP检测结核分枝杆菌在中国区县实验室诊断性能评估Xichao Ou1., Qiang Li1., Hui Xia1., Yu Pang1, Shengfen Wang1, Bing Zhao1, Yuanyuan Song1,Yang Zhou1, Yang Zheng1, Zhijian Zhang5, Zhiying Zhang2, Junchen Li2, Haiyan Dong2, Jack Zhang2, KaiMan Kam3, Junying Chi4, Shitong Huan4, Daniel P.
2、Chin4*, Yanlin Zhao1*摘要：背景：能够在早期有效的检测结核分枝杆菌，尤其是涂布阴性的结核病，对全球肺结核防控至关重要。环介导等温扩增法与快速DNA提取法（PURE-LAMP）相结合，可以高灵敏性、高特异性、快速检测痰液样本中结核分枝杆菌。尽管如此，PURE-LAMP尚缺乏足够的评估，尤其是在资源有限的基层实验室。本研究中，通过对来自中国两个县级实验室肺结核疑似患者进行检测，评估了PURE-LAMP法在基层实验室检测结核分枝杆菌的性能。方法与结果：自2011年4月-2012年2月，收集来自中国两个县级结核病实验室的肺结核疑似患者三种痰液标本（即时痰，晚间痰和晨痰）用于检测。用
3、标准L-J培养法做对照，结果显示， PURE-LAMP法检测即时痰标本结核分枝杆菌的灵敏度达到70.67%。同时，PURE-LAMP法在基于涂片呈阳性培养阳性，涂片阴性培养阳性的标本中灵敏度分别为92.12%和53.81%。PURE-LAMP法检测即时痰结核分枝杆菌中的特异性为98.32%。基于三种样本检测结核分枝杆菌，PURE-LAMP法的灵敏度和特异性分别为88.80%和96.86%。与固体培养法相比，PURE-ALMP法可显著降低污染率。结论和意义：结果表明，在中国的基层结核病防治实验室检测结核分枝杆菌，PURE-LAMP法具有较高的灵敏度和特异性。其具有高效、快速和安全的优点，值得在基
4、层及偏远地区广泛推广使用。结核病仍然是威胁全世界健康的重大疾病，2012年，据统计新发结核病约860万，死亡人数约130万1。快速准确的诊断对结核病有效治疗和防控至关重要2-3。目前，全世界范围内结核病常用的诊断方法是涂片镜检，众所周知该方法灵敏度低，特别是对感染HIV的低免疫力病人4-5。培养法是结核病诊断的金标准，灵敏度较涂片法高，但培养耗时长（2周-8周）。为了满足结核病防治快速灵敏的要求，一系列核酸扩增方法不断涌现6-8；然而，由于分子检测需要复杂的操作流程和昂贵的仪器，设施简陋、技能缺乏的广大基层实验室尚不能满足这些条件来开展。LAMP法是一种崭新的恒温核酸扩增方法12，不需要昂贵的
5、仪器设备。TB-LAMP是日本荣研公司基于LAMP技术开发的结核菌检测试剂盒。它具有的一系列特征为资源缺乏的基层实验室提供了分子检测平台：快速（40mins），恒温（只需加热快），稳定（对抑制剂和反应条件具有一定的容忍性），检测结果可以直接用肉眼观察判定13-15。2007-2010年，荣研公司与FIND基金会合作，成功研发出新一代TB-LAMP检测试剂盒，即PRUE-LAMP，该试剂盒包括一个简单的DNA提取过程16。PRUE-LAMP具有更高的灵敏度和特异性，并重新设计优化了反应引物。DNA的提取和扩增过程都可以在一个封闭的反应管中进行，这样可以有效减少污染风险。PRUE-LAMP包括3个
6、步骤：样本准备（10-20min），扩增（40min），直接通过肉眼观察荧光检测结果（0.5-1min）17。为了评估PURE-LAMP的临床性能，我们选择了中国河南省2个区县级实验室进行实验。材料和方法实验设计本实验在中国河南省两个显微镜检实验室（获嘉县和新乡市）进行。收集2011年4月-2012年2月来自门诊就诊的连续纳入的肺结核疑似患者（连续咳嗽咳痰2周，咳血，伴有血样痰）痰液标本用于研究，每位患者采集3种痰液（即时痰、晚间痰、晨痰），每份痰样量至少2mL（0.1mL用于涂片，1mL用于培养，0.06mL用于PURE-LAMP实验）。每份痰液样本同时进行直接涂片抗酸染色、固体培养和PUR
7、E-LAMP实验，中国国家结核病参比实验室（NTRL）的实验员收集所有培养呈阳性菌并进行16S-23S rDNA ITS测序分析来鉴别菌种。以固体培养为参照来评估PURE-LAMP性能。本实验之前，两个镜检实验室均未做过固体培养和PCR实验，为了确保LAMP检测和培养实验质量，所有实验员都在NTRL经过1周的培训。为了确保固体培养质量，新乡和获嘉的工作人员预先进行了9个月的TB培养实验培训。LAMP实验也在当地试验点进行了培训。方法葁-尼染色镜检和罗氏培养：实验员按照痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册18的要求做好实验室涂片镜检的室内和室间质量控制。固体培养时，痰液处理和接种方法参照WHO标准
8、19，37培养8周。PURE-LAMP：PURE-LAMP实验步骤参照17，各个实验室的操作人员均经过厂商培训并通过每人3个流程的熟练测试，操作流程如下：采用荣研公司生产的痰液专用大孔吸液器吸取60uL痰液于含有提取液的加热管中，混匀后90加热5min。然后将加热管和吸附试剂管组装并充分混匀直至白色试剂完全溶解。然后组装上滴注盖，挤压30uL样本于反应管中。盖好反应管盖子与反应试剂充分溶解后与67反应40min。反应结束后将反应管置于荧光检测装置中判定并记录结果。菌种鉴定：所有培养呈阳性菌经过16S-23S rDNA ITS测序分析进行种属鉴定。统计学分析采用TB-LAMP实验特异性，灵敏性，
9、阳性预测值（PPV），阴性预测值（NPV）来评估LAMP实验性能。以培养法为标准，所有数据经SPSS 19.0数据分析软件分析，P0.05为差异有统计学意义。结果样本来源自2011年4月-2012年2月共收集了初诊可疑肺结核患者1378例，排除不合格的样本，最终有1329例用于数据分析（图1）。其中，888例是男性，441例是女性，53例年龄不到20岁，165 (12.42%)例涂片和培养呈阳性，210 (15.80%)例涂片呈阴性培养呈阳性，954(71.78%)培养呈阴性（表1）。 PURE-LAMP检测即时痰性能在1329例疑似患者中，PURE-LAMP检测结核菌的灵敏度和特异性（表2，
10、图1）。以固体培养法为参考标准，1203份（90.52%）与固体培养法一致，灵敏度为70.67%，对与涂片呈阳培养呈阳的样本，PURE-LAMP的灵敏度是92.12%，对于涂片呈阴培养呈阳的样本，PURE-LAMP的灵敏度是53.81%，PURE-LAMP的特异性是98.32%。PURE-LAMP检测不同时期痰标本以及不同时期混合标本性能分析了不同时期取得的痰液样本（即时痰，夜间痰，晨痰）以及不同时期痰标本混合（即时痰+夜间痰，即时痰+晨痰，夜间痰+晨痰，即时痰+夜间痰+晨痰）的灵敏度和特异性（表3），结果表明三个时期混合标本的特异性和灵敏度要高于单个时期取的痰液样本。PURE-LAMP和培养
11、法污染率用PURE-LAMP 检测475例新结核病疑似病人，只有一份样本污染，总污染率是0.21%。4129份样本取自2个治疗室的1378例患者，每份样本分别接种2管培养，共培养8268份，其中276份污染，总污染率是3.3%。不同方法差异分析在培养呈阴性样本中有30份样本PURE-LAMP检测呈阳，2份涂片呈阳。在PURE-LAMP检测呈阴性样本中，有42份培养呈阳性，其中，6份测序结果为非结核分枝杆菌，36份测序显示为结核分枝杆菌，涂片呈阴性。26 (72.22%)份培养菌落数20。讨论结核病的早期诊断对结核病的防治至关重要，随着分子生物学的发展，一系列快速检测和诊断TB的方法不断涌现。L
12、AMP技术是Notomi博士在2000年开发出的一种全新的核酸扩增技术12。PURE-LAMP是一种新颖，简便，防污染的TB检测试剂盒。本研究中，PURE-LAMP对涂片呈阴培养呈阳的样本灵敏度是53.81%，整体灵敏度为70.67%，特异性为98.32%，与其他研究结果一致11。与涂片镜检相比，灵敏度要高，结果表明PURE-LAMP可以用于检测结核分枝杆菌。中国相关规定推荐采集结核病疑似患者3个时期样本用于TB检测21，本实验中，我们评估了每种样本对于结核病诊断的影响，PURE-LAMP实验结果表明采集3个时期的痰液样本用于检测要比只采集即时痰意义更大。考虑到成本因素，避免给患者造成经济负担
13、，今后有必要评估PURE-LAMP法检测不同时期样本组合成本。本实验中PURE-LAMP的污染率是0.21%，2个试验点操作都进行了严格分区，包括试剂存储区，前处理区，扩增检测区。每个区都标明清楚防止来回取试剂或者设备时混淆。实验台等都经过5%的次氯酸钠溶液消毒，实验后经过UV照射处理。通过严格控制和封闭实验，极大的降低了污染率。PURE-LAMP结果报告时间比固体培养快。2h以内即可根据肉眼观察荧光判定结果。判断时未发现模糊案例。20%的样本经过复检后重复率100%。总的来说，PURE-LAMP是一种全新的诊断技术，可以快速、准确地检测结核病患者，该实验只需60ul痰液样本，非常适合检测肺结
14、核病人，尤其是痰液较少患者，本研究表明PURE-LAMP可以用于实验室筛查结核病。参考文献1. World Health Organization (2013) Global tuberculosis control: WHO report 2011, Geneva, Switzerland: World Health Organization.2. Small P M, Pai M (2010) Tuberculosis diagnosistime for a game change. N Engl J Med 363: 10701071.3. Pai M, Kalantri S, Dhed
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