1、分子生物学技术整理分子生物学要点整理第23章 DNA操作的基本技术第1节 核酸分子杂交A、原理核酸分子杂交：指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。B、基本技术探针：已知序列的标记的核酸片段C、具体应用印迹杂交技术 利用Southern印迹法可进行基因的定性及定量分析、基因突变分析，限制性片断长度多态性分析（RFLP），DNA甲基化检测等。 1.遗传病诊断 2.DNA图谱分析 3.DNA克隆鉴定 Northern印迹法可用以检测某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表达量，比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况 1.肿瘤跟踪 2.mRNA剪切 斑点印迹杂交
2、 （dot blot) 简单、快速，同一张膜可检测多个样品 特异性不高、不能鉴别核酸分子量 用于表达量分析原位杂交（in situ hybridization，ISH）即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术；可用于基因及其表达产物的定位分析。 特点：能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究；不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高；能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH） 将标记探针与细胞或组织中的核酸进行特异性杂交，并应用组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位的检测技
3、术。可进行多色杂交，可检测DNA及RNA特定序列。 基因组原位杂交（genome in situ hybridization，GISH） 用一个物种的基因组DNA作为探针，对另一物种的染色体进行原位杂交，通过对杂交信号在染色体上分布及信号强弱分析，判断基因组间DNA相似性，基因同源性，亲缘关系，及进化关系。 基因表达定位及定量： RNA原位杂交 RNA或寡核苷酸作为探针 主要做内源基因定性，定量分析 灵敏度较高 整体原位杂交（Whole mount in situ hybridization, WISH） 适用于早期胚胎发育或体积微小的组织器官RNA表达研究 可做时空表达图谱研究 信噪比较高第
4、2节 聚合酶链式反应 分析基因及其产物 反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。 进行实时、定量分析（实时定量PCR，real-time quantitative PCR, RT-qPCR） 测定DNA拷贝数最敏感、最准确的方法 实时精确定量，灵敏度强，特异性高，实现多重反应，无污染 在肿瘤、乙肝和性病的诊断和治疗中广泛应用 结合免疫共沉淀扩增蛋白质结合的DNA序列第3节 DNA序列测定 DNA序列分
5、析可以揭示基因和基因组一级结构变化 通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组的变异 通过DNA序列测定分析人工重组的基因 通过DNA序列测定对定点突变进行确认 基因工程，用以建立基因数据库，及遗传病分析第4节 DNA芯片（DNA chip）技术在同一基片上有序固化寡核苷酸或DNA探针，与待测荧光标记样品进行杂交；通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达)；亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。（绿、黄、红） 染色质免疫共沉淀芯片（chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip） 特异性地富集目的蛋白结合的
6、DNA片段，解交联后对目的片段进行纯化、扩增和荧光标记，再用于芯片分析，检测蛋白质-DNA相互作用 芯片技术的发展蛋白质芯片和组织芯片 蛋白质芯片技术是研究蛋白质组学的有力工具 蛋白质检测芯片 蛋白质功能芯片 组织芯片是以形态学为基础进行高通量检测基因表达信息的芯片技术 多组织片 组织阵列 组织微阵列 应用 DNA芯片可同时进行高通量基因转录活性的分析 染色质免疫共沉淀与芯片技术结合检测蛋白质-DNA相互作用，寻找特异性蛋白在基因组中的结合位点，获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP-on-chip适于DNA-核蛋白相互作用及表观遗传学研究，用来确定转录因子及其作用位点或确定基因表观遗传修
7、饰，应用于表观遗传学研究 蛋白质芯片可用于蛋白表达谱分析及蛋白功能分析，可用于肿瘤标记物筛选，肿瘤诊断及治疗效果检测 组织芯片可用于高通量检测基因表达信息，可用于肿瘤标记物筛选，肿瘤诊断及治疗效果检测第5节 酵母及哺乳动物细胞杂交系统 酵母双杂交系统 酵母双杂交系统利用报告基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用 酵母双杂交可通过蛋白质相互作用鉴定或分离新的相互作用蛋白及其编码基因 哺乳动物双杂交系统是在酵母双杂交系统基础上发展的 酵母单杂交技术 从酵母双杂交技术发展而来 是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法 通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白
8、基因 需要构建“报告”细胞。 酵母三杂交 可进行与特定蛋白结合的未知RNA的筛选 确定RNA-蛋白质相互作用的结构域；鉴定、分离能够识别具有重要生理功能RNA的RNA结合蛋白 用于蛋白质-RNA相互作用分析的酵母三杂交系统需要杂合RNA 第24章 重组DNA技术第1节 DNA克隆技术背景重组DNA技术（recombinant DNA technology）又称DNA克隆（DNA cloning）或基因克隆（gene cloning) 技术，是指在体外利用酶学方法将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷
9、贝。克隆目的基因后，针对该基因进行特定蛋白质或多肽制备以及定向改造基因结构所用的方法及相关的工作统称为基因工程（genetic engineering）。因此，重组DNA技术又称为基因工程技术。 第2节 DNA克隆的基本过程A、亚克隆通过以上分、择、接、转、筛五个步骤，便完成了一次DNA克隆过程。有时为了达到某种新的目的，需要对已克隆的DNA进行再次克隆，该过程称为亚克隆。其方式为换载体，或修改目的DNA。亚克隆的目的有多种，常见的有：实现目的DNA的高效扩增表达目的DNA编码的蛋白质对目的DNA序列进行分析对目的DNA进行修饰（如突变、缺失、引入新的限制酶切位点等） 获得单链DNA或RNA鉴
10、定目的DNA是否具有某些特殊功能B、目的DNA的获取 化学合成法 （直接合成目的DNA） 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 应用：一般用于小分子肽类基因的合成 基因组DNA文库：是指包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列的随机克隆群体，以DNA片段的形式贮存了所有的基因组DNA信息 cDNA文库：包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经反转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存了全部的基因表达信息 PCR （从文库中或质粒中获取目的DNA片段） 酵母单、双杂交系统C、重组技术中的DNA载体选取 根据DNA克隆的目的选择与准备适宜载体 载体
11、是为携带感兴趣的外源DNA，实现外源DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子 进行DNA克隆的目的主要有二： 获得目的DNA片段； 获得目的DNA片段所编码的蛋白质针对第一种目的，通常选用克隆载体；针对第二种目的，需选用表达载体 选择表达载体时需要考虑特异标签 选择载体时，还要考虑目的DNA的大小、受体细胞的种类和来源等因素 选择载体时还需注意载体内应有适宜的多克隆位点 （酶切位点选择） 载体是为携带感兴趣的外源DNA，实现外源DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子 克隆载体：用于外源DNA的克隆和无性繁殖 特点： 至少有一个复制起
12、点 至少有一个选择性标志 有适宜的限制性内切酶的单一切点 多克隆位点（MCS） 应有较高的拷贝数 常用克隆载体： 质粒 (plasmid) 噬菌体(phage) 穿梭载体（shuttle vector），质粒，可在至少两种系统内复制 表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体，依据其宿主细胞的不同可分为：原核表达载体、 真核表达载体 原核表达载体：用于在原核细胞中表达外源基因 除了具备克隆载体的一般特点外，还需有调控外源基因有效转录和翻译的序列，如启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等。目前应用最广泛的原核表达载体是大肠杆菌表达载体。 真核表达载体：用于在真原核细胞中表达外源基因 真核表达
13、载体包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。 真核表达载体中还具有： 真核表达调控元件：包括启动子、增强子、转录终止序列、poly A 加尾信号等 真核细胞复制起始序列 真核细胞药物抗性基因 载体上的标志（marker）：通常用于重组子或阳性克隆的筛选、鉴定 常见的标志有： 抗生素抗性基因 酶的编码基因 营养缺陷选择标志 标签（tag）：其编码序列通常构建于表达载体，与目的基因位于同一阅读框内，这样就可使所表达的蛋白上带上标签肽。 标签肽大小不等，小的只有几个氨基酸残基，大的有几十kD 标签肽常用于表达产物的分离、纯化与鉴定 不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞载体插入
14、DNA片段宿主细胞质粒510 kb细菌，酵母噬菌体载体20 kb细菌黏粒50 kb细菌BAC400 kb细菌YAC3Mb酵母 原核表达体系主要以细菌作为宿主细胞，包括大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、沙门氏菌、苏云金杆菌等，其中又以大肠杆菌表达体系应用最为广泛和最成熟。原核表达体系既可用于原核基因表达，也可用于真核基因表达 原核表达体系有以下优势 宿主菌遗传背景和生理特性清楚，有多种工程菌株可供选择 原核细胞繁殖能力强，操作简便、省时 大规模发酵成本低，生产潜力大 表达水平一般较真核系统高，且下游工艺简单、易于控制 原核表达系统的主要缺点 原核细胞缺乏真核细胞所特有的翻译后加工修饰系统（如糖基化、磷
15、酸化等），因此，针对这些需经修饰的蛋白，无法用原核表达体系获得有活性的产物 目的基因不能是含有内含子的DNA 细菌本身产生的内毒素等热原不易去除干净，为产品纯化增加了难度 蛋白的高水平表达常形成包涵体，提取和纯化步骤繁琐，而且蛋白复性较困难，容易出现肽链的错误折叠等问题 真核细胞表达体系：利用多种真核细胞表达外源蛋白 与原核表达体系相比，真核表达体系（特别是以哺乳类细胞作为宿主细胞的表达体系）具有如下优点 目的基因既可是基因组DNA，也可是cDNA，转录后能进行加工 目的基因的表达可受到更严格地调控，能对所表达的蛋白质进行加工修饰，确保二硫键的精确形成，能正确进行糖基化、磷酸化、寡聚体的形成等
16、加工 可使蛋白进行分泌表达，从而有利于蛋白的分离纯化 所表达的目的蛋白不易被降解，且对宿主细胞的影响较小 与原核表达体系相比，真核表达体系也存在诸多不足： 宿主细胞繁殖速度慢，培养条件要求高 蛋白表达水平低 整个操作过程复杂、费时、成本高 常用的真核表达体系 酵母表达体系 昆虫细胞表达体系 哺乳类细胞表达体系 各种表达体系各有其优缺点，应根据具体需要进行选择D、目的DNA与载体连接 限制性核酸内切酶识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶常用的为II型限制性内切酶 型限制性内切酶具有一些共性和特性 具有特定的识别和切割位点 识别的核苷酸序列通常为回文结构 切割双链
17、DNA分子后产生黏端或平端 不同的酶可以产生同样的末端 产生配伍末端 不同的酶可以识别同一个序列 切割会受其他因素的影响 （甲基化，缓冲液，浓度） DNA连接酶：催化两个相邻的3-OH和5-磷酸基团形成3，5-磷酸二酯键，从而使DNA片段或单链断裂形成的缺口连接起来。 DNA与载体内切酶位点寻找或制造 通过序列内原有酶切位点进行连接 通过其他措施产生黏端进行连接 PCR法 黏端连接为最适连接 单一相同黏端连接会产生载体自连，目的DNA双向插入载体（即正向和反向插入），多拷贝现象 定向克隆，将DNA分子和载体分子采用同一对限制性核酸内切酶切割后连接起来，实现外源DNA片段的定向插入 平端连接效率
18、低，且存在单一黏端连接同样问题 粘-平末端的连接效率介于黏端和平端连接之间 （为定向克隆） 快速连接法无需纯化DNA片段 （时间短，效率低，用量大） 非定向克隆存在问题 载体自连 DNA方向错误 DNA多段相连 平端连接效率低 其他常用工具酶（非定向克隆解决方法） 碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基团 反转录酶以RNA为模板合成cDNA 末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端加尾以构成黏性末端 DNA聚合酶I主要用于合成DNA DNA聚合酶I大片段保留了有用的酶活性 Taq DNA聚合酶常用于PCR 多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5羟基末端磷酸化E、重组DNA转入受体细胞 转化（transform
19、ation） 质粒或黏粒细菌 （感受态细胞，competent cell） 质粒酵母菌（真核细胞） 转染（transfection） 外源DNA真核细胞（酵母除外） 噬菌体DNA感受态细菌 感染（infection） 噬菌体颗粒细菌 病毒颗粒哺乳细胞 常用方法 化学法：氯化钙化学转化 物理法：电击法、显微注射法F、筛选与鉴定重组DNA 一般一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子。最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体。将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆 主要筛选和鉴定方法有遗传标志筛选法、序列特异性筛选法、亲和筛选法等
20、借助载体上的遗传标志可快捷方便地进行筛选 利用抗生素抗性标志可筛选出带有载体的重组子：将含有某种抗生素抗性基因的载体转入宿主细胞后，将细胞在含有相应抗生素的培养基中培养，无载体转入的细胞将被杀死，生长的细胞即是含有载体的细胞。至于细胞中的载体是否为含有目的DNA的重组载体，尚需进一步鉴定。 利用标志补救筛选带有载体的重组子：标志补救是指当载体上的标志基因在宿主细胞中表达时，通过互补宿主细胞的相应缺陷而使细胞在相应选择培养基中存活。利用该策略可初步筛选带有载体的重组子。 利用不同遗传标志可筛选出带有重组载体的克隆 利用抗性基因的插入失活可筛选带有重组载体的克隆 利用抗性基因的插入表达也可筛选带有
21、重组载体的克隆 -互补筛选利用了-半乳糖苷酶功能互补的基因片段（插入失活筛选） 根据序列特异性可筛选出特定的重组DNA 限制性内切酶法 PCR法 核酸杂交法 DNA测序法 （最准确） 亲和筛选法借助相关表达产物而筛选阳性克隆 亲和筛选法的前提是重组DNA进入受体细胞后能够表达出其编码产物-蛋白质。 常用的亲和筛选法的原理是基于抗原-抗体反应或配体-受体反应。一般做法同上述菌落或噬斑原位杂交相似，只是被检测的靶分子换成了蛋白质，检测探针换成了抗体/抗原或配体/受体。 第3节 重组DNA技术的应用 利用重组DNA技术生产有应用价值的药物是当今医药发展的一个重要方向。 该技术一方面可用于改造传统的制
22、药工业，例如，使用该技术可改造制药所需要的工程菌种或创建新的工程菌种，从而提高抗生素、维生素、氨基酸等药物的产量。另一方面就是利用该技术生产有药用价值的蛋白质/多肽与疫苗等产品。 重组DNA技术广泛应用于发展蛋白质/多肽类药物与疫苗 重组DNA技术应用于真核细胞转基因和基因打靶 利用重组DNA技术可获得转基因动物 (第二十六章） 转基因动物技术是指将外源基因导入到动物的组织细胞内，并使导入的基因通过遗传传给子代 转基因动物的制备步骤主要包括基因表达载体的构建、转基因动物的建立和鉴定、转基因动物品系的繁育 目前，转基因技术已成功用于建立多种人类疾病的动物模型（如肿瘤、糖尿病、高血压、关节炎等模型
23、）、制备生产药用蛋白的转基因动物，即生物反应器（如可生产凝血因子的转基因绵羊等）、改良动物品种、基因治疗和器官移植研究等 在转基因动物中，以转基因小鼠（transgenic mouse）最为常见 重组DNA技术可用于基因打靶 (第二十六章） 基因打靶（gene targeting）是利用同源重组原理，使靶基因失活或置换，从而观察目的基因的功能 通过同源重组失活或剔除某一基因，称基因敲除（gene knock-out） 通过同源重组使突变基因被置换，称基因敲入（gene knock-in） 重组DNA技术还应用于其他诸多方面 重组DNA技术是提前完成人类基因组计划的主要手段 人类基因组计划（hu
24、man genome project，HGP）的主要目标是揭示人类遗传信息的组成和表达，具体主要通过完成四张图谱（即遗传图、物理图、DNA序列图和转录图）来实现 重组DNA技术的快速发展和完善加速了HGP的完成，其中包括大片段DNA克隆、DNA的大尺度分析、全自动DNA序列测定等 该技术广泛应用于基因诊断，并在基因治疗方面具有广阔前景(第二十八章) 遗传疾病的预防(第二十八章)第25章 基因结构分析的基本策略第1节 基因序列结构的生物信息学检索和比对分析 比对方法 通过数据库进行基因序列的同源性检索及比对 利用基因数据库查找基因序列 将基因序列定位到染色体（定位分析） 序列比对目的：判断两个或
25、多个序列间是否具有足够的相似性，从而判断二者之间是否具有同源性第2节 基因转录起始点的鉴定 基因转录起始点的序列特征 II 型启动子（负责结构基因的转录）的TSS： 没有明确的保守序列 有一种趋势，即mRNA 的第一个碱基是A，其侧翼碱基倾向于是嘧啶 与mRNA第一个碱基对应的位置标记为-1区 -3 +5区域被称作起始子 (initiator) 基因转录起始点的序列分析 转录起始点 (TSS)位于基因编码序列的5端；基因编码区是指能体现在多肽链中的核苷酸序列；多肽链是以mRNA为模板经翻译合成的。因此，分析鉴定TSS的方法都是以cDNA为切入点。 cDNA克隆测序 要求：cDNA的5端完整无缺
26、 cDNA末端快速扩增技术(RACE) 传统的RACE (rapid-amplification of cDNA ends) 连续分析基因转录起始点：在RACE的基础上，通过在转录本5 端引入一个特殊的II型限制性核酸内切酶识别位点，实现了基因5 端短片段串联连接产物一次测序分析多个基因转录起始点的目的 5SAGE是在PCR过程中将MmeI酶切位点引入cDNA的5端，通过酶切和连接获得不同短片段重复序列，并对重复序列进行测序获得大量片段序列信息 不同序列的短片段代表不同基因的转录起始点 (TSS) CAGE与5SAGE非常相似，所不同的是： CAGE不需要在RNA上加接头，而是用oligo(d
27、T)引物先进行第一链cDNA的合成 然后通过捕获帽结构，将含有MmeI和另一内切酶位点如XmaJI的linker加到单链全长cDNA的3末端 第3节 启动子的结构及功能分析A、启动子的结构分析 启动子（promoter）是一段能被蛋白质识别的、参与特定基因转录调控的DNA序列 II型启动子通常位于结构基因的上游 共通序列(consensus sequence)是其特征性序列 原核基因的共通序列：-10区：Pribnow box（T77A76T60A61A56T82序列）；-35区：T69T79G61A56C54A54 序列 真核基因的共通序列：真核基因启动子在-50区域附近（大约5%30%基因
28、启动子在-25-30区域）有TATA box（TATAAA序列）B、启动子的结构分析主要方法 利用PCR技术克隆启动子 根据已知基因序列直接进行PCR扩增 利用核酸-蛋白质相互作用方法研究启动子 启动子是一段能被蛋白质识别和结合的DNA序列，因此，能够检测核酸-蛋白质相互作用的研究方法都可以用于启动子的研究中 主要方法： 足迹法（酶足迹法，化学足迹法）：利用DNA电泳条带连续性中断的图谱特点判断与蛋白质结合的DNA区域 电泳迁移率变动实验（EMSA）：是利用结合蛋白质的DNA片段在凝胶中迁移滞后的特点，通过电泳分离研究核酸-蛋白质互作的方法；又称为凝胶阻滞实验 染色体免疫沉淀（ChIP）：是在
29、保持蛋白质与染色体DNA结合的同时，将染色体切割成小片段并沉淀下来 生物信息学预测启动子 真核基因组的测序正在以不断增长的速度进行着，目前已经可以获得大约50个完整真核生物基因组的序列信息， 预计在未来几年内将会完成更多的基因组测序工作 对基因组注释工作中最难的就是精确鉴定和描绘启动子，因此，启动子的预测就显得非常重要 预测启动子的切入点 启动子的结构特征 典型启动子 核心启动子：一般在TSS上游-35区域以内 近端启动子：一般涉及TSS上游几百个碱基 远端启动子：一般涉及TSS上游几千个碱基，含有增强子或沉默子 一些特征性的结构：TSS附近的CG岛经常出现在启动子中共通序列 启动子的预测分析：基因转录起始点数据库 (DBTSS)。这些数据库主要通过计算机识别、判断及分析，在数据库中寻找启动子的特异性特征结构。C、启动子的功能分析 启动子通常是基因上游参与基因转录调控的DNA序列。由于启动子中的顺式作用元件在基因的特异性表达中发挥重要作用，因此，可以通过连接报告基因研究启动子的功能。 报告基因： 是研究者们为了制造一种可在细胞培养条件下或动植物体内作为筛选标志的易检测信号，通过分子生物学操作将发光蛋白或酶的编码基因附加到一个感兴趣基因上或插入基因调控序列下游，从而监测感兴趣基因的表达或分析基因调控序列的活性 。 应用： 监测基因的转染效率：
