1、整理Menke体外产气法（4）根据评价的目的、要求和评价对象的特点、工艺、功能或活动分布，选择科学、合理、适用的定性、定量评价方法对危险、有害因素导致事故发生的可能性及其严重程度进行评价。环境的两个特点：（三）安全评价的内容和分类（3）公众对规划实施所产生的环境影响的意见；（3）对环境影响很小、不需要进行环境影响评价的建设项目，填报环境影响登记表。（1）前期准备工作。包括明确评价对象和评价范围，组建评价组，收集国内外相关法律、法规、规章、标准、规范，收集并分析评价对象的基础资料、相关事故案例，对类比工程进行实地调查等内容。（2）疾病成本法与人力资本法3.划分评价单元（2）环境的非使用价值。环境
2、的非使用价值（NUV）又称内在价值，相当于生态学家所认为的某种物品的内在属性，它与人们是否使用它没有关系。2. 环境敏感区的界定Menke体外产气法（Syringe系统）管子（一）基础知识体外产气法主要理念通过体外产气装置模拟瘤胃发酵体外产气系统组成体外产气装置：产气管（相当于独立的瘤胃）、恒温水浴摇床（模拟瘤胃温度和蠕动速度）；微生物培养液：由瘤胃液与人工唾液按1:2的体积比混合，搅拌均匀而成影响实验成败的主要因素实验过程中产气装置的温度，整个操作过程的厌氧状态、微生物活力是影响实验成败的关键（二）试验前准备试配产气管 更换注入口处老化的塑胶管；试配外管和内塞，要求推拉自如又不过松（现已将可
3、匹配的外管和内塞统一编号，依号装配即可）。称量样品 产气管编号；用自制的带长柄的称量纸，准确称取待测样品约200mg（DM），置于体外产气管底部，注意不要让样品进入产气管注入口和沾染30ml以上管壁；样品称取完毕后，管塞上均匀涂抹凡士林，将管塞塞回对映的外管，扣好夹子。配制原液 正式实验前一天，配制好人工唾液中的微量元素溶液（A液）、缓冲液（B液）、常量元素溶液（C液）和刃天青溶液（D液）（可过量配制，常温下存放，配制方法见附表1）。其它 调试恒温水浴摇床的温度至390.5，摇动速度510转/min，如果使用两个恒温水浴摇床要求两者温度和摇动速度尽量一致，另外还需要将一多联水浴锅温度调至390
4、.5（以实际量取温度为准）；准备二层、四层、六层纱布各2-4块（纱布可重复使用）；贮备两瓶热水，准备收集瓶（收集和过滤瘤胃液用）、水桶、温度计，以备次日取瘤胃液用。（三）正式试验配制人工唾液 将恒温水浴摇床、多联水浴锅打开后；计算人工唾液需要量：体外培养时每根产气管内微生物培养液的体积是30ml（10ml瘤胃液和20ml人工唾液），依据试验设计的产气管数计算人工唾液和瘤胃液的需要量（预留20%，以备操作手法不当造成浪费）；配制还原剂（E液，见附表1）；按附表2的顺序和比例将配制好的各原液混合后，置入水浴摇床或水浴锅内，通入CO2气体（气流不易过大），使人工唾液由蓝色转变为粉红色，最终为无色。采
5、集与处理瘤胃液 为方便读取12h产气量，瘤胃液最好在7:30前取回。所取瘤胃液为早饲前2h瘤胃液。到牧场后，将热水倒入水桶，调节水温度至390.5，用于瘤胃液保温（应经常用热水调节）；用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶（注意盖上瓶盖，以防氧气对微生物的影响）；回到实验室后，将收集瓶置于水浴锅内，四层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液用CO2气体饱和；用量筒量取所需量的无色人工唾液和瘤胃液混合，不间断地通入CO2气体。吸取微生物培养液 用空的产气管吸取微生物培养液30ml，通过三通管推入已经装有样品的产气管。记录初始微生物培养液量 排气过程：将注入口处夹子打开的同时
6、，用手下拉管塞，以防样品冲入塑胶管；摇晃产气管使样品与瘤胃液混合后，旋转管塞，排出管内空气；读数：将产气管竖直，注入口向下，读取刻度。排气后的产气管应随机置于恒温水浴摇床内培养（摇床在操作过程中处于摇动状态，以免温度上升）。空白对照和标准对照实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照（样多时，对照一定要多，尤其是空白对照）。空白对照不加样品直接加入30ml微生物培养液，标准干草对照以200mg（DM）干草（优质的过80目筛的羊草）为底物，加入30ml微生物培养液。为了消除操作顺序和恒温水浴摇床条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期，放置于水浴摇床的不同位置。整个
7、过程要尽量快，特别是吸培养液和排气，最好不要超过15min记录产气量 培养2、4、6、9、12、24、36、48、72、96h时（试验样品为粗料，一般培养到72h或96h；精料一般培养到24h或48h即可终止培养，若要计算产气常数，一般要72h），记录产气管的刻度读数（读数时轻摇产气管，旋动管塞后读数，读数时，以管塞刻度的中部为准）。如果产气量过多，下一时间点产气量可能超出刻度范围，则需放气，其操作与排气相同。产气量计算 （管子）式中，GPt为样品在t时刻的产气量（ml）；Vt为样品发酵t小时后，产气管刻度读数（ml）；V0为样品在开始培养时产气管刻度读数（ml）；W为样品干物质重（mg）；G
8、P空白为空白对照在t时刻的产气量，其计算方式与GPt一致。重复试验 要求体外产气试验至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%（若标准干草产气量与实验室积累的平均值29.5相差太大，应考虑重作，检查动物状况）。(四)样品采集测定项目取样时间取样部位取样量重复数处理保存温度VFA实际需要上清液1ml-加入0.2ml 8.2%偏磷酸，20000g离心10min4NH3-N24或48h混合液5ml-20MCP24或48h混合液24ml-20附表1：人工唾液原液配制表A、微量元素溶液：CaCl2.2H2O 13.2g;MnCl2.4H2O 10.0g;CoCl2.6H2O 1.0g;FeCl3
9、.6H2O 8.0g;加蒸馏水至100mlB、缓冲液：NH4HCO3 4.0g;NaHCO3 35.0g;加蒸馏水至1000mlC、常量元素溶液：Na2HPO4.12H2O 9.45gKH2PO4 6.2gMgSO4.7H2O 0.6g加蒸馏水至1000mlD、0.1%刃天青溶液：100mg刃天青溶解于100ml蒸馏水E、还原剂溶液（现用现配）：1M NaOH 4.0ml Na2S 9.H2O 625mg 加蒸馏水95ml附表2：人工唾液配制表（1000ml）顺 序原 液体积（ml）1蒸馏水520.22微量元素溶液（A液）0.13缓冲液（B液）208.14常量元素溶液（C液）208.150.1
10、%刃天青溶液（D液）1.06还原剂溶液（E液）62.4嘌呤法测定体外微生物蛋白产量（一）操作流程图（二）试剂配制及具体操作1、试验试剂A0.2M磷酸二氢铵23g磷酸二氢铵溶解于700ml蒸馏水，定容至1000mlBpH=2的蒸馏水在蒸馏水中加少许硫酸至pH=2C0.4M硝酸银准确称取1.6987g硝酸银，溶解于15ml蒸馏水中，待完全溶解后定容至25ml。溶液需用棕色瓶存放，避光保存，并外覆不透光的黑纸D0.5M盐酸用蒸馏水稀释10ml盐酸（37%）至240mlE28.5mM磷酸二氢铵用蒸馏水稀释100ml 0.2M磷酸二氢铵至700mlF85%磷酸G0.6M高氯酸用蒸馏水稀释10ml高氯酸（
11、70%，12M）至200ml2、测定步骤A酵母RNA标准曲线的制作: 分别称取5、15、25、35、45、55mg酵母RNA于10ml离心管中，并加入2ml 0.6M HClO4，于90 - 95水浴1小时，冷却； 再分别加入6ml 28.5mM NH4H2PO4，于90 - 95水浴15min，冷却后在3000g，4条件下离心10min； 取1.6ml上清液，向上清夜中加入6ml 0.2M NH4H2PO4溶液，并用85%磷酸调整溶液pH为23（一般需85%磷酸25l）； 取调整pH值后的溶液3.8ml，并向其中加入0.2ml 0.4M AgNO3，混合，于5条件下避光、过夜； 过夜后于30
12、00g，4条件下离心10min，弃上清液；用4.5ml pH = 2 的蒸馏水冲洗沉淀；再于3000g，4条件下离心10min，弃上清液； 向沉淀中加入5ml 0.5M HCl 溶液，混匀，在90 - 95条件下水浴30min后，以3000g离心10min； 上清液用0.5M HCl稀释40倍后，以0.5M HCl 溶液作参比，在260nm 下比色，根据光密度值作出标准曲线。B培养液中微生物蛋白质的测定: 取8ml均匀发酵液于3个10ml离心管，在20000g，4条件下离心20min；弃上清液后加入2.104ml 0.6M HClO4，于90 95水浴1小时，冷却； 按照制作标准曲线的步骤-操
13、作； 以0.5M HCl 溶液作参比，在260nm 下比色，根据光密度值和标准曲线求出RNA测定值； 根据下面公式计算微生物蛋白氮产量：其中，RNA含氮量为17.83%，细菌氮中RNA 含氮量为10%。浙江大学奶业科学研究所比色法测定培养液氨态氮浓度（一）操作流程图（二）试剂配制及具体操作1 试验试剂A0.2M盐酸溶液将18ml浓盐酸用蒸馏水稀释到1000mlB14%水杨酸钠溶液称取14g水杨酸钠，用蒸馏水溶解，定容至100mlC0.3M氢氧化钠溶液1.2g氢氧化钠用蒸馏水溶解并定容至100mlDD液称取0.08g亚硝基铁氰化钠溶解于100ml 14%水杨酸钠溶液中EE液量取2ml次氯酸钠溶液
14、（商品名安替福明，含活性氯5.2%），混于100ml 0.3M氢氧化钠溶液中摇匀2 测定步骤A、氨氮标准系列溶液制备 准确称量0.382g氯化铵，用0.2M盐酸溶解，并定容到100ml，作为保存液，在冰箱中可存放数月。 取保存液10ml，用蒸馏水稀释定容至100ml，为工作液。含氮量为10mg/100ml。 取工作液0、1、2、4、6ml置于5个编号的50ml容量瓶内，接着分别加入蒸馏水10、9、8、6、/4ml，使之都成为10ml，再用0.2M盐酸定容。这就是每100ml中含氮量为0、0.2、0.4、0.8、1.2mg的标准系列溶液。B、比色与计算 准确量取标准系列溶液0.4ml分置于5个1
15、0ml试管内，各管中再依次加入D液和E液2ml，摇匀，静置10分钟后比色。波长700nm，0.5cm的比色皿，用不含氮的0号管液作空白对照。记录各消光值。 用消光值作自变量，溶液含氮量作从变量导出回归方程式。 样品处理：取5ml瘤胃培养液在3500-4000转/分下，离心10分钟，量取2ml上清液（若含氮量较高，可取1ml上清液再加1ml蒸馏水），置于15ml试管内，再加入8ml 0.2M盐酸至10ml摇匀（稀释倍数为5或10）。比色操作同：准确量取各溶液0.4 ml 置于10ml试管内，各管内再依次加入D液和E液2ml，摇匀，静置10分钟后比色。波长700nm，0.5cm的比色皿，用不含氮的
16、0号管液作空白对照。记录各消光值。把测得的消光值代入回归公式，计算的结果乘以样品稀释的倍数就是原样中氨氮的含量。浙江大学奶业科学研究所体外发酵产物中挥发性脂肪酸浓度的测定（一）操作流程图（二）试剂配制及具体操作1 混标制备按表1或表2中梯度，配制6个梯度的混合标样，用于制作标准曲线。表1 乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制 （umol / ml）123456乙酸10204080160320丙酸12481632丁酸12481632表2 乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制 （ul / ml）123456乙酸0.571 1.143 2.285 4.570 9.140 18.280 丙酸0.075 0.149
17、 0.299 0.598 1.196 2.390 丁酸0.092 0.184 0.367 0.735 1.470 2.939 2 上机测定色谱柱HP-INNOWAX（19091N-133）毛细管柱，30m0.25mm0.25m气化室温度200检测室温度220柱温采用程序升温，80持续1min后，以15/min升温至170后维持1.5min载气及流速载气为高纯氮，压力为100kpa，总流量63.8ml/min，柱流量1.19ml/min，分流比50，吹扫流量3ml/min，循环流量30ml/min检测室气体流速H2流量40ml/min，空气流量400ml/min进样量2l浙江大学奶业科学研究所发
18、酵气体中甲烷含量的测定（一）标准曲线建立用10l的微量注射器分别抽取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0l的甲烷标准气，上机，根据甲烷的浓度和其峰面积的关系，确定甲烷的标准曲线。由于在测定发酵气体时取样量是20l，故设定1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0l的甲烷标准气的浓度分别为5、10、15、20、25、30%。（二）上机条件HP-INNOWAX（19091N-133）毛细管柱，30m0.25mm0.25m10012080载气及流速载气为高纯氮，压力为179.5kpa，总流量46.2ml/min，柱流量2.7ml/min，分流比15，吹扫流量3ml/min，循环流量30
19、ml/min检测室气体流速H2流量40ml/min，空气流量400ml/min进样量20l浙江大学奶业科学研究所压力读取式体外产气法（RPT系统）产气瓶（一）基础知识体外产气法主要理念通过体外产气装置模拟瘤胃发酵体外产气系统组成体外产气装置：产气瓶（相当于独立的瘤胃）、恒温培养箱（模拟瘤胃温度）；微生物培养液：1:9的瘤胃液与人工唾液；压力传感器；PC影响实验成败的主要因素实验过程中产气装置的温度，整个操作过程的厌氧状态、微生物活力是影响实验成败的关键（二）操作流程图（三）试剂配制及具体操作1、试验前准备称量样品 产气瓶编号（因为产气量的计算涉及瓶子体积，所以尽量保留原产气瓶编号，使用新瓶时要
20、量取瓶子体积）；加入磁力棒；准确称取待测样品一般约750mg（DM，适用0.5-1.5mgDM），置于体外产气瓶底部。配制人工唾液 计算人工唾液需要量：体外培养时每个产气瓶内人工唾液的量为90ml，瘤胃液10ml，依据试验设计的产气瓶数计算人工唾液和瘤胃液的需要量（预留20%，以备操作手法不当造成浪费）；配制人工唾液中的微量元素溶液（A液）、缓冲液（B液）、常量元素溶液（C液）、刃天青溶液（D液）（可过量配制，常温下存放）和还原剂（E液，现用现配，见附表1）。按附表2的顺序和比例将配制好的各原液混合后，置入水浴摇床或水浴锅内，通入CO2气体（气流不易过大），使人工唾液由蓝色转变为粉红色，最终为
21、无色。分装人工唾液 不间断地将CO2通入人工唾液瓶，用100ml注射器或产气管吸取人工唾液90ml，注入称有样品的产气瓶，并用CO2饱和（可通过三通管完成两路CO2的同时输入）。盖紧橡胶塞后，390.5恒温培养箱内过夜（对于青贮类等含酸较多的样品，一定要过夜，而且在正式培养前将里面所产气体排空，不计入产气量）。其它 准备二层、四层、六层纱布各2-4块（纱布可重复使用）；贮备两瓶热水，准备收集瓶（收集和过滤瘤胃液用）、水桶、温度计，以备次日取瘤胃液用。2、正式试验采集与处理瘤胃液 为方便读取12h产气量，瘤胃液最好在7:30前取回。所取瘤胃液为早饲前2h瘤胃液。到牧场后，将热水倒入水桶，调节水温
22、度至390.5，用于瘤胃液保温（应时经常热水调节）；用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶，盖好盖子；回到实验室后，将收集瓶置于水浴锅内，依次用二层、四层和六层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液不间断地通入CO2气体；将密封的产气瓶从恒温箱中取出，用6.5号针头将产气瓶中多余气体放尽；用20ml注射器吸取瘤胃液10ml，通过另一16号针头注入产气瓶，将两根针头取下，产气瓶置于390.5恒温箱中培养。空白对照和标准对照实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照。空白对照不加样品只有90ml人工唾液和10ml瘤胃液，标准对照以750mg（DM）干草（优质的过80目筛
23、的羊草）为底物，加入90ml人工唾液和10ml瘤胃液。为了消除操作顺序和恒温培养箱条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期，放置于培养箱的不同位置。记录产气量 培养2、4、6、9、12、24、36、48h时，如果条件允许可延长培养时间，培养粗料时，至少96h或更长（有人培养一周），用压力传感器读取产气瓶内压力（轻拿、轻放），并放气。要求：使用压力传感器前，熟练软件的操作（有模拟程序可供练习）产气量计算 （瓶子）式中，GPt为样品在t时间段的产气量（ml）；Pt为t时间段读取的压力（mPa）；V0为瓶子体积；101.3为标准大气压（mPa）；W为样品干物质重。产气过程的总
24、积累产气量为各时间段产气量之和。瘤胃发酵样品制备 培养中途取样时，要求取样同时，向产气瓶内通入CO2，并于39水浴中操作;取混合液（发酵液及固体残渣）时要求在控温磁力搅拌机上操作。重复试验 要求体外产气试验至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%。附表1：人工唾液原液配制表A、微量元素溶液：CaCl2.2H2O 13.2g;MnCl2.4H2O 10.0g;CoCl2.6H2O 1.0g;FeCl3.6H2O 8.0g;加蒸馏水至100mlB、缓冲液：NH4HCO3 4.0g;NaHCO3 35.0g;加蒸馏水至1000mlC、常量元素溶液：Na2HPO4.12H2O 9.45gKH
25、2PO4 6.2gMgSO4.7H2O 0.6g加蒸馏水至1000mlD、0.1%刃天青溶液：100mg刃天青溶解于100ml蒸馏水E、还原剂溶液（现用现配）：Cysteine HCl 625mg 蒸馏水95ml 1M NaOH 4.0ml Na2S 9.H2O 625mg 附表2：人工唾液配制表（1000ml）顺 序原 液体积（ml）1蒸馏水520.22缓冲液（B液）208.13常量元素溶液（C液）208.14微量元素溶液（A液）0.150.1%刃天青溶液（D液）1.06还原剂溶液（E液）62.4瘤胃液脂肪酸测定（一）操作流程图（二）试剂配制及具体操作1、样品处理. 取1ml样品于带盖的水解
26、管，加入0.67ml 5M NaOH和一滴饱和甲基橙指示剂后，充满N2；. 85水浴30min，冷却至室温后，加入0.67ml 5.1M HCl, 使溶液pH低于2（溶液由橙色变为红色），如果不确定，可以用pH计检测；. 加入1ml 2mg/ml 的内标C17：0；. 加入2.5ml氯仿/甲醇（2: 1,v/v）后，涡旋2min；. 将样品在2000g下离心10min；. 移去上层甲醇/水层，轻轻拨开中间杂质层，将下层溶液无损失转移；. 通过含硫酸钠的干燥柱将下层氯仿滤入另一玻璃容量管；. 用氮气将样品吹干；. 用1.0ml正己烷悬浮后，简单涡旋；. 2000 rpm下离心10min，样品-2
27、0冷冻保存。2、上机条件HP-INNOWAX（19091N-133）毛细管柱，30m0.25mm0.25m260检测室温度270柱温采用程序升温，140持续5min后，以4/min升温至240后维持20min载气及流速载气为高纯氮，压力为100kpa，总流量87.9ml/min，柱流量0.84ml/min，线速度：25.6cm/sec，分流比100，吹扫流量3ml/min，循环流量30ml/min检测室气体流速H2流量40ml/min，空气流量400ml/min进样量产气管，2l；产气瓶4l浙江大学奶业科学研究所Real-time PCR测定瘤胃微生物数量一、样品采集In vitro实验终止时
28、，若分析混合微生物，可取1ml混合培养液于1.5ml灭菌离心管(也可直接用灭菌过的含0.3 g 0.1mm和0.1g 0.5mm锆珠的2ml 螺口管) -80度保存待用。若要分别分析固、液相微生物时，将混合培养液过40um尼龙袋，滤液于4度500g 离心10，上清用于液体微生物DNA提取。尼龙袋于39度灭菌水中冲洗至澄清用吸水纸吸干水份，-80度保存用于固相微生物DNA的提取。In Sacco 方法与此相似。二、总DNA的提取1 试验材料：1.5 mL EP管、螺口管、锆珠、1 mL、 200uL、20ul枪头（均需灭菌）、涡旋器、高速离心机等。2 所需试剂：NaOH、Tris碱、EDTA二钠
29、、NaCl、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、冷乙醇。3.溶液配制方法：试剂方法A10 M NaOH称取40 g NaOH，加到100 mL水中。无需除菌。B5 M NaCl称取29.22 g NaCl，加水溶解定容至100mL。C1 M，pH 8.0 Tris-HCl称取12.114 g Tris碱，加80 mL水，用浓盐酸调pH至8.0，加水定容至100 mL。D0.5 M，pH 8.0 EDTA将18.61 g EDTA-Na.加入80 mL水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用10 N的NaOH调节溶液的pH值至8.0，加水定容至100 mL。ETE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）吸取1 mL 1M的Tris-HCl和0.2 mL 0.5 M的EDTA，加水定容至100 mL。FTN150(10 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl，pH 8.0)1ml 1M的Tris-HCl和3ml 5M NaCl, 加水定容至100ml。GTris 饱和酚 (pH8.0)购买H24：1的氯仿异戊醇240 mL氯仿+10mL异戊醇I无水乙醇-
