1、第十三章 生物制品分析概论,基本要求概述质量检验的基本程序与方法常用定量分析方法及其应用 练习与思考,返回主目录,基本要求,1掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型。2掌握HPLC法和酶活力测定法在本类药物测定中的应用。3熟悉本类药物的范围、种类、质量控制的要点。4了解本类药物含量测定的其他方法。,返 回,一、防病、治病的三大药源 化学药物、生物药物、中药,第一节 概 述,Biopharmaceutics or Biopharmaceuticals,二、生物药物的定义利用生物体、生物组织或组成生物体的各种成分，综合利用生物学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制得的药物。广义的生物
2、药物：天然活性生物物质、人工合成或半合成的天然物质类似物。,三、生物药物的发展第一代：利用生物材料加工制成的含有某些天然活性成分物质与混合成分的粗提物制剂；垂体后叶粉及其注射液甲状腺粉及其片剂胰酶及其肠溶片、肠溶胶囊,三、生物药物的发展第二代：根据生物化学和免疫学原理，应用近代生化分离纯化技术从生物体制取的具有针对性治疗作用的特异生化成分；尿激酶、肝素钠、胰岛素人血白蛋白、人免疫球蛋白,三、生物药物的发展第三代：应用生物工程技术生产的天然生理活性物质，以及通过蛋白质工程原理设计制造的具有比天然物质更高活性的类似物，或与天然物质结构不同的全新的药理活性成分。重组人生长激素、重组人IL-2,四、生
3、物药物的分类生化药物生物合成药物生物制品,1生化药物：例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。,甘氨酸、丙氨酸,五肽胃泌素,硫酸鱼精蛋白,门冬酰胺酶、辅酶Q10,2.生物合成药物,由微生物代谢所生成的药物利用微生物及其酶转化反应共同完成的半合成药物山梨醇木糖醇甘露醇枸橼酸抗生素,3.生物制品,以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成。疫苗抗病毒及抗血清血液制品重组DNA制品诊断制品等,疫苗类药物,用病毒或立克次体接种于动物、鸡胚，或经组织培养后加以处理制造而成。细菌类疫苗病毒类疫苗联合疫苗双价疫苗及多价疫苗,抗病毒及抗血清类药物,抗病毒：用细菌类毒素或毒素免疫马或其
4、他大动物所取得的免疫血清抗菌（抗病毒）血清：用细菌或毒素本身免疫马或其他大动物所取得的免疫血清抗体被动免疫制剂,血液制品,由健康人的血液或经特异免疫的人血浆，经分离、提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分，以及血液细胞有形成分。主要用于临床治疗和被动免疫预防人血白蛋白、人免疫球蛋白等,重组DNA制品,重组DNA制品,细胞因子类生长因子类激素类酶类疫苗单克隆抗体,诊断制品,用于检测相应的抗原、抗体或机体免疫状态的制品。毒素、诊断血清、分群血清、分型血清、因子血清、诊断菌液、抗原或抗体致敏血球、免疫扩散板等体外诊断制品和体内诊断制品,五、中国生物制品的发展历史我国第一所生物制品生产、研究机构：中
5、央防疫所（1919年）（北京生物制品研究所前身）50年代，先后成立了北京、武汉、长春、成都、兰州、上海6大卫生部直属的生物制品研究所以及中国医学科学院昆明医学生物研究所、成都输血研究所。一些常用的预防性制品和血液制品,五、中国生物制品的发展历史60年代初成立中国药品生物制品检定所80年代后，进入高速发展期：出现大量生物制品企业；种类、剂型快速增加；由预防性制品发展至诊断性制品，治疗、保健性制品,五、中国生物制品的发展历史1956年成立卫生部生物制品委员会1988年成立卫生部生物制品标准化委员会。在审批方面，为与化学药、中药区别，国家药品监督管理局专门制定了新生物制品审批办法,六、生物药物的特点
6、1、生物体的基本生化成分2、分子量大、不确定：分子量测定3、结构难确证4、需检查生物活性5、要求安全性检查6、需做效价测定7、全过程的质量控制,生物制品的全程控制,危险因素：异源物质、不稳定、易受微生物污染全程质量控制：原材料、生产过程、最终产品生物制品的生产特点：（1）来源于生物体（2）制造过程涉及生物材料和生物学特征（3）工艺存在易变性和安全性问题,生物制品的全程控制,全程质量控制尚无成熟的经验与方法鉴定方法的独特性生物制品安全性、有效性的保证：（1）严格遵守GMP标准（2）完善的制造检定规程（3）各生产工序相适应的检定方法、标准操作细则（SOP）药品国家标准：法定技术依据、标准,生物制品
7、的国家标准,生物制品及鉴定规程草案（1952）生物制品制造检定规程（1959）中国生物制品规程（第6版 2000）中华人民共和国药典（三部）（2005），收载101种生物制品,各部药典收载情况,一部药典：药材及饮片、植物油脂和提取物、成方制剂和单味制剂等；二部药典：化学药品、抗生素、生化药品、放射性药品以及药用辅料等；三部药典：生物制品，包括疫苗、抗毒素及抗血清、重组DNA制品、体内诊断制品等；,项目：1.品名（中文通用名称、英文名称、汉语拼音）2.定义、组成及用途 3.基本要求 4.制造 5.检定（原液、半成品、成品）6.保存运输及有效期 7.使用说明（仅预防类含此项）,生物制品质量控制的重
8、点,有效成分的统一性、结构确证有效成分的均一性、纯度检验有害物质及残余杂质的控制高效、灵敏的生物活性及比活性实验方法,生化药物和基因工程药物质量检验的基本程序与方法,鉴别试验,杂质检查,安全性检查,含量、效价测定,鉴别试验,理化鉴别试验 化学反应法 光谱鉴别法UV 色谱鉴别法HPLC生物化学鉴别法 酶法 电泳法-等电聚焦电泳、PAGE生物鉴别法,对比吸收光谱和特征吸收的一致性,对比色谱保留行为的一致性,第二节 鉴别试验,（一）理化鉴别法 1.化学鉴别法：例：胰蛋白酶+对甲苯基磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐 紫色,2.紫外分光光度法蛋白质的UV：芳香族氨基酸侧链（主要是酪氨酸、色氨酸，其次是苯丙氨酸
9、）重组人干扰素1b、2a、2b最大吸收峰278nm3nm；重组人促红素：最大吸收279nm2nm；最小吸收250nm2nm；在320nm360nm处无吸收峰,3.高效液相色谱法主峰保留时间和肽图的一致性结合N-末端氨基酸序列分析，是蛋白质类生物制品精确的鉴别方法,高效液相色谱法：1、反相高效液相色谱法2、分子排阻色谱法毛细管电泳1、毛细管区带电泳CZE,重组人粒细胞集落刺激因子的肽图分析,1、RP-HPLC条件：Vydac C18(150 4.6,5m)MP:0.1%CF3COOH-CH3CN in gradient elutionFR:0.5 ml/minDW:214 nm,2、CZE条件：
10、毛细管柱37cm75m，有效长度30 cmBuffer:0.05 mol/L的磷酸盐水溶液，pH5.8运行电压：12 KVDW：214 nm,二、生化鉴别法 1.酶法：例：尿激酶的鉴别-气泡上升法 原理：,激活,方法：取小试管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纤维蛋白原溶液，再依次加入牛纤维蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速摇匀，立即置370.5恒温水浴保温，记时。反应系统在3040秒内凝结，凝结块内有气泡生成，15分钟内凝结块溶解，当凝结块溶解时，气泡逐渐上升。以0.9%氯化钠作空白，同法操作，凝结块在2小时内不溶。,2.电泳法：以肝素鉴别为例。,与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。,三.生物法：
11、利用生物体进行试验来鉴别药物。例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注50%葡萄糖注射液，惊厥停止。,第三节 杂质检查,一、特殊杂质检查,特殊杂质,生物污染物产品相关杂质工艺添加剂,生物污染物1、微生物2、细胞成分3、培养基成分4、有关大分子物质,宿主细胞、外源性DNA,牛血清白蛋白,重组制品中的鼠IgG,产品相关杂质1、二聚体和多聚体2、脱氨或氧化产物3、突变物4、错误裂解产物5、二硫化物异构体,工艺添加剂1、残余抗生素2、蛋白分离剂（聚乙二醇、乙醇）3、佐剂氢氧化铝4、产品稳定剂（辛酸钠、肝素）5、防腐剂（苯酚、间甲酚等）6、细菌与病毒灭
12、活剂（甲醛等）,特殊杂质检查,1、宿主细胞蛋白残留量的检查目的：控制异源蛋白的含量以防超量后引起机体免疫反应测定法：酶联免疫吸附剂测定法ELISA2、外源性DNA残留量的检查目的：防止外源性DNA对人类的危害测定法：分子杂交技术、基于DNA结合蛋白分析系统、实时定量PCR技术,3、产品相关杂质的检查同系物、异构体、降解产物等测定法：HPLC和CE4、残余抗生素的检查目的：控制生物制品制备时抗生素的用量测定法：抑菌试验,安全性检查,常规热原和细菌内毒素的检查异常毒性试验过敏试验降压物质试验无菌试验一些特殊污染物的检查致突变试验生殖毒性试验,二、安全性检查,异常毒性试验：是用一定剂量的药物按照指定
13、的操作方法和途径给予规定体重的某试验动物，观察其极性毒性反应。小鼠、LD50,过敏试验：是对生化药物和基因工程药物中的异性蛋白进行进检查。豚鼠、皮肤过敏和腹腔注射,降压物质检查：检查药物中能够导致血压降低的物质，如组胺类。猫或狗,无菌检查：对于不能进行高温灭菌的生物药品，必须进行无菌检查。,一些特殊污染物的检查：主要考虑外源性DNA、一些杂蛋白等。,致突变试验：回复突变试验、染色体畸变试验等,生殖毒性试验,含量测定,HPLCSDS-PAGE,UV or Fluorescence,效价测定,第四节 含量（效价）测定,常用的定量分析方法及应用,理化分析法生化分析法生物检定法,理化分析法,化学分析方
14、法电化学分析法光谱分析法色谱分析法,重量法容量分析法,重量法：根据样品中分离出来的单体或化合物的重量测定所含成分的含量的方法。,提取法：用适宜的溶剂提取样品中的某成分后挥去溶剂进行测定的方法。挥发法：利用被测组分的挥发性，或经过衍生化后将其转化成挥发性物质来进行测定的方法。沉淀法：将被测组分转化成沉淀，称定沉淀的重量来计算含量的方法。,容量法：,胰酶中胰淀粉酶的测定：氧化还原滴定。淀粉溶液（底物）+胰淀粉酶还原糖，碘量法测定还原糖。胰酶中胰脂肪酶的测定：酸碱滴定法。橄榄油乳液（底物）+胰脂肪酶脂肪酸，氢氧化钠滴定。,药物膜电极 生物组织膜电极 药物电极 微生物电极 离子选择性电极法 免疫电极
15、免疫场效应管 酶电极,电化学分析法,比色法,利用样品与显色剂发生现色反应，根据反应产物的颜色强度来测定含量。Elson-Morgan,硫酸软骨素的比色法测定：在酸性条件下使样品水解成氨基己糖，再在碱性条件下与乙酰丙酮和二甲氨基苯甲醛反应生成红色的产物，该产物在525 nm处有最大吸收。,光谱分析方法,具体试验操作：1、制备对照品溶液氨基葡萄糖2、制备供试品溶液硫酸软骨素3、反应和测定缩合反应和比色测定,A平为供试品溶液的吸收度As平为对照品溶液的吸收度Ws为对照品溶液的浓度（mg/ml）W为称样量（mg）0.8309为校正因子500为稀释倍数,以氨基葡萄糖计24.0,色谱法 1）RP-HPLC
16、：反相高效液相色谱法 色谱柱柱：C8，18烷基硅烷键合相；流动相：甲醇（或乙腈）水（或缓冲液）梯度洗脱 检测器：紫外、荧光检测器；电化学检测器 应用：肽类、氨基酸、蛋白质、多糖的定量分析,2）HPIEC：高效离子交换色谱（high performance ion exchange chromatography）应用：蛋白质，多肽的分离测定 色谱柱：离子交换键合相 流动相：0.3mol/L1.0mol/L的盐的缓冲液。梯度洗脱：盐的浓度逐渐增大。尽量避免使用卤素类盐 特点：可回收活性蛋白。,3）HPGFC：高效凝胶过滤色谱法（high performance gel filtration chr
17、omatography）原理：分子筛效应（根据分子大小分离）应用：蛋白质、多肽的分离及分子量测定。色谱柱：凝胶色谱柱 流动相：水或缓冲液（常加入有机改性剂）特点：活性蛋白可回收,4）灌注色谱法（perfusion chromatography）定义：使用具有“贯通孔”的填料使流动相快速地贯穿填料颗粒流动，从而加快填料内传质过程的液相色谱方法。固定相：聚苯乙烯二乙烯高度交联结构上构 成的贯穿孔颗粒(POROS)；颗粒分离介质-POROSR。双模式孔结构：80150nm大扩散孔 600800nm贯穿孔,允许液体传送流经过分离介质内表面，使样品由流动相直接灌注入介质颗粒中，扩散作用不再是主要的。介质
18、颗粒内部可利用反应的表面积增加，容量和分辨率也随之增加，可使生物活性大分子快速分离纯化。,应用：基因工程药物和其他大分子药物的分离纯化和分析。,酶法,1、酶活力法：以酶作为分析对象；2、酶分析法：以酶为分析工具或分析试剂；,酶活力测定法 1）基本原理：酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越高。,活力单位（国际单位，IU）在25，以最适当的底物浓度、最适当的缓冲液离子强度以及最适当的pH等条件下，每分钟能转化1mol底物的酶量。比活性（IU/mg蛋白质）每1mg蛋白质所含的酶单位数。,酶反应速度可以用单位时间反应底物
19、的减少或产物的增加来表示。通常酶活力测定时，先制备酶反应进程曲线和酶浓度曲线。通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量。,酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。,酶活力测定的要求：测得的反应速度必须和酶浓度有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、正确的标准。,2）酶促反应的条件及影响因素 底物的浓度：一般选用底物的浓度S=100Km pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。温度：酶反应
20、的温度通常选用25、30或 37，实验中温度变动应控制在0.1以内 辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要 相应的辅酶。,空白和对照试验：空白试验：是指杂质反应和自发反应引起的变化量，它提供的是未知因素的影响。空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者都加（酶预先经过失效处理）。对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要作为比较或标定的标准。,3）测定方法：取样测定法：,连续测定法：在反应过程中对反应系统进行直接连续检测。检测方法：紫外-可见分光光度法 旋光法荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等,示例：胰蛋白酶效价测定胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸）水解速率：酯键酰氨键肽键供试品溶液：5060单位/ml底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 浓度：A：0.575.0585N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 N-苯甲酰-L-精氨酸,253nm处的A随酶促反应递增，根据酶活力单位定义计算酶活力。,酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位。测定：空白：底物溶液+0.001mol/L HCl,每30s A的改变：0.0150.018，呈线性关系的时间不得少于3min。,A每分钟改变0.003，相当于1个胰蛋白酶单位。供试液的A每分钟改变,相当于的单位数为每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为,
