1、5RNA的合成第十三章 RNA的生物合成以DNA为模板合成RNA的过程叫作转录(transcription)。转录是遗传信息表达或基因表达的第一阶段。转录和DNA复制之间存在明显的区别。例如，DNA复制以DNA的两条链同时作为模板，可以将整个染色体复制成两个子染色体。而转录是有选择性的，染色体上只有特殊的某些基因或几组基因在某一时刻转录，而且往往利用1条DNA链作为模板。除了某些RNA病毒以外，所有的RNA都是转录产生的。转录除了产生三种主要的RNA:携带蛋白质合成信息的信使RNA(mRNA)、特异的氨基酸运输工具转运RNA(tRNA)和形成蛋白质合成场所的核糖体RNA (rRNA)。还包括一
2、些其他的 RNA分子，它们往往具有结构功能或催化功能。所有这些RNA都是由RNA聚合酶以DNA序列为模板拷贝合成。真核生物中主要有三种类型RNA聚合酶，分别负责合成不同的 RNA，这三种RNA聚合酶是在进化中由存在于细菌中的单一的RNA聚合酶衍生而来的。在DNA双链中，起转录模板作用的链叫作模板链(template strand)或负链。而另l条非转录模板链通常称为编码链(coding strand)或正链，其序列和转录产物相同(仅T替代U)。RNA聚合酶结合于DNA特异的转录起始区启动子(promoter)。启动子通常靠近转录起点(start point)，即DNA中转录合成RNA的第一个碱
3、基对，这个位点的核苷酸残基编号为+1。某些启动子的转录起点不是固定的，而是选择性出现于相邻的两个或三个碱基对中。RNA聚合酶合成RNA的方向为53，从转录起点沿RNA聚合酶运动的方向称为下游(downstream)，核苷酸残基编号依次为+2，+3，而反方向为上游(up stream)，核苷酸残基编号为-1，-2。为方便起见，通常将DNA序列从左(上游)向右(下游)书写，并且仅用编码链序列代表基因，因为它和RNA序列相同。RNA聚合酶沿模板链运动合成RNA，遇终止信号停止。从启动子到终止序列(terminatorsequence)之间的DNA序列叫作转录单位(transcription unit
4、)。1个转录单位可以表达产生1个RNA分子，它可能仅仅含有1个基因(主要是真核生物基因)，也可能含有多个基因(主要是原核基因)。 初级转录产物(primary transcript)是整个转录单位的RNA拷贝，它通常不稳定。 在原核细胞中，初级转录产物可能很快降解(如mRNA)，或切割加工产生成熟的RNA分子(如 rRNA和tRNA)。 在真核细胞中，mRNA初级转录产物末端被修饰，并经过切割加工才能产生成熟RNA分子。rRNA和tRNA分子也要经过前体加工。第一节 原核基因的转录起始 60年代初，Jacob和Monod发现了细菌基因表达的主要形式操纵子(operon)，即1个启动子控制连在一
5、起的多个结构基因的转录，并提出了E.coli的乳糖操纵子模型。不久， Ippen(1968年)和Pastan等(1970年)对这个模型作了若干重要补充。 一、RNA聚合酶和启动子 如同研究 DNA复制始于E.coli的DNA聚合酶，人们探索转录机制先从E.coli的RNA聚合酶入手。 细菌细胞中只有1种RNA聚合酶，它兼有合成mRNA、tRNA和rRNA的功能。RNA聚合酶是E.coli细胞中较大的蛋白之一，每个细胞中大约有3 000个RNA聚合酶分子，其中一半在迅速生长的细胞中处于转录活性状态，而另一半和DNA松散结合并沿DNA随机运动，直到发现启动子。E.coli细胞中的RNA聚合酶有几种
6、形式，其主要形式由5个亚基组成，两个较大的亚基是(156Kd)和(151Kd)，两个较小的亚基(37Kd)，以及1个亚基(70Kd，只70).亚基是细菌基因的转录起始因子，它识别并结合于启动子，一旦转录开始就离开RNA聚合酶，代之以延伸因子结合于RNA聚合酶的核心酶(coreenzyme)。E.coli的RNA聚合酶全酶中最常见的因子是70，它识别绝大多数基因的启动子的共有序列，并且使RNA聚合酶对启动子的亲和力比非启动子序列的亲和力高104倍。其他因子(28、32、38、54)分别识别特殊基因的启动子(见第15章)。亚基二聚体的结合位点处于启动子靠近上游的调节序列，它和转录频率(即启动子的强
7、弱)直接相关。亚基主要结合于DNA的转录模板链，而亚基则结合合成RNA所需的底物NTP，并催化形成磷酸二酯键。RNA聚合酶是1种多功能酶，它的功能包括：1 寻找转录起点，即E.coli墓因组中的大约2 000个启动子。2 解开一小段DNA双螺旋，以便产生单链DNA转录模板。3 选择正确的底物NTP，并催化合成磷酸二酯键，RNA链的合成方向为53，所以 RNA聚合酶可以沿DNA模板链单向运动，直到转录完成。4 识别转录终止信号。 和转录激活蛋白或阻遏蛋白相互作用，以调节转录速度，这是基因表达调控的主要步骤。和DNA聚合酶的活性相比，RNA聚合酶没有核酸外切酶活性，也就不具备校正和修复功能。所以，
8、RNA能够从头合成，不需要引物，转录的忠实性自然比复制低得多，其误差率为10-4一10-5，比DNA复制的误差要高105倍。启动子是一段DNA序列，它是RNA聚合酶结合并起始转录的位点。1979年，Rosenberg等比较了46个E.coli操纵子的启动子序列，证明以-35和-10为中心存在共有序列(见第 15章)。70因子结合于绝大多数E.coli启动子的-35区和-10区： (一)用紫外线照射RNA聚合酶启动子复合物，发现这两个区的碱基和70的氨基酸残基原子之间形成共价交联。 (二)在-35区和-10区发生的碱基突变可以造成基因转录明显减少。有的E.coli突变株可以校正上述突变，因为它的
9、70基因发生了第二位点突变(second-site mutation)，所改变的氨基酸残基和-35区(或-l0区)突变的碱基直接接触，从而消除了启动子突变产生的不利影响。 (三)人们意外地发现，纯化的70亚基并不结合于启动子。为了解释这一矛盾现象，利用重组DNA技术获得了缺失N端一半的70变异体，发现它能特异结合于启动子。所以，可能只有野生型70亚基的N端部分结合于RNA聚合酶的其他亚基，才不会阻止70和启动子之间的相互作用。 在70亚基多肽链中，从N端到C端有4个保守区(图132)，这些区在其他亚基中也存在。其中，2区与4区的氨基酸残基分别和启动子-10区和-35区的核苷酸残基相接触，2区的
10、另一部分氨基酸残基为DNA解链所必需；而N端的1区则阻止2区和4区在没有RNA聚合酶的核心酶存在时结合于DNA；位于1区和2区之间的氨基酸残基和核心酶相互作用。70因子识别的启动子有强弱之分，即不同的启动子转录合成RNA的频率有高有低。E.coli的乳糖操纵子比较弱，而编码rRNA的6个rrn操纵子就属于强者(图133a)。启动子的强弱很大程度上取决于启动子的序列和RNA聚合酶之间的亲和力。绝大多数强启动子序列和-35及-10区共有序列非常一致，而弱启动子有几个位点和共有序列不同。例如，乳糖操纵子启动子的-10区为TATGTT，和共有序列(TATAAT)相比有两个碱基不同，如果这两个碱基突变，
11、使之和共有序列相同，那么乳糖操纵子的表达将增加。乳糖操纵子启动子-35区也有两个碱基和共有序列不同。启动子共有序列发生突变经常使操纵子的转录频率明显下降。在70启动子中，-35区中的ACA和 10区AA的出现频率都在75以上，-35区的TTG和-10区的TA及最后1个T的出现频率为50一75，而-35区最后1个T和-10区第3个T的出现频率为4050。E.coli基因组有6个拷贝rRNA操纵子，其启动子的转录能力在大约2 000个E.coli启动子中是最强的。在这些具有极高转录速度的启动子中，位于-40至-60的富含AT的序列必不可少。最近的研究结果显示，RNA聚合酶中的亚基可以从核心酶中分离
12、出来，以二聚体的形式结合于这一区域。如果亚基发生突变，使它不能结合于-40至-60区，那么这些强启动子的转录速度就要下降，但这种RNA聚合酶对其他启动子的转录正常。上述结果清楚地表明，亚基可以和启动子-40-60区相互作用，并使启动子具有很高的转录活性。换言之，强启动子除了必须具备-10和-35区共有序列以外，RNA聚合酶的亚基和-40-60区的启动子调节序列相互作用也十分重要。 在E.coli中发现的5种因子，除70以外的其他4种因子用于少数特殊基因的转录。在这4种因子中，28、32和38的氨基酸顺序都和70相似，它们也识别-10和-35区启动子，但其共有序列和70识别的启动子差别较大。而5
13、4的氨基酸顺序和其他70亚基的相似程度很低，而且它识别的启动子位于-12和-24区。 RNA聚合酶催化的RNA合成主要分为3个阶段：起始、延伸和终止。 二、转录的起始 从E.coli乳糖操纵子的转录起始过程中，可以归纳出细菌基因转录起始阶段的一般规律 (图134)： (一)转录始于DNA模板的一定区域。首先，RNA聚合酶和DNA形成封闭式复合物 (closecomplex)，70因子紧紧结合于启动子序列，DNA双链仍保持碱基配对。 (二)RNA聚合酶一旦结合于启动子，就催化双链DNA解旋，并打开约17bp的区域 (约合B型DNA l.6圈)，形成开放式复合物(open complex)。这样，
14、在DNA转录区产生了局部单链的转录“泡”(bubble)，暴露出复制模板链，使NTP (底物)能够与其相应的碱基(模板)配对。 (三)接着，RNA聚合酶沿转录模板链运动(DNA 35)，转录泡随之移动，同时以 NTP为底物按53方向合成RNA链，使之互补于模板DNA链。新合成的RNA链的5端核苷酸是高度特异的，为pppG或pppA。转录不需要引物，RNA可以从头合成。 (四)当大约10个核苷酸已经聚合以后，RNA聚合酶释放因子，代之以延伸因子结合于核心酶并继续转录。 (五)操纵子的转录调节主要通过阻遏蛋白和激活蛋白。阻遏蛋白结合于操纵基因 (operator)，这一序列一般位于+30-50，它
15、和启动子部分重叠，从而抑制了RNA聚合酶的转录起始。而激活蛋白通常结合于启动子的上游序列(-30-65)，或转录起点的下游，它和RNA聚合酶接触并促进转录起始。 (六)细菌经常利用不同的可互换的亚基，以识别特殊的启动子，并调节基因的开关。尽管以上这些规律适用于绝大多数E.coli的启动子，但是对100多个不同的启动子的研究结果显示，每个启动子的转录调节都各有其特点。第二节 真核基因的转录起始在迄今所研究的所有真核细胞核中都含有三种RNA聚合酶。RNA聚合酶I主要合成rRNA，RNA聚合酶主要合成mRNA，而RNA聚合酶的转录产物主要是tRNA和5SrRNA. 一、真核基因转录起始的一般规律在原
16、核基因转录起始过程中，RNA聚合酶承担了识别启动子的作用，某些启动子可能还需要辅助因子参与识别。在真核基因转录起始阶段，辅助因子的重要性大大提高了。识别真核基因的启动子序列，起主要作用的通常是蛋白因子-转录因子，而不是RNA聚合酶本身。 转录因子的定义是，转录起始所需要的非RNA聚合酶本身组分的任何蛋白。真核启动子由一组特征性的保守短序列组成，供特异的蛋白因子或RNA聚合酶识别。某些序列元件存在于不同的启动子中，并且有共同的蛋白因子识别它们；而有的元件则通过不同组合出现于一个个启动子之中，用于特殊的基因表达。绝大多数RNA聚合酶I和的启动子位于转录起点的上游，而某些RNA聚合酶的启动子位于转录
17、起点下游。RNA聚合酶使用的启动子在序列上变化很大，它们由若干标准大小的元件 (elements)组成。这些顺式作用短序列元件位于转录起点上游，通常分布在大于lOObp的区域内，元件之间的序列并不重要(可能有分隔作用)。真核和原核mRNA转录起始的一个明显区别是，真核启动子转录涉及大量结合于不同顺式作用元件的因子，所以启动子的定义区域包括这些因子的全部结合位点。相比之下，原核启动子仅限于转录起点附近上游的RNA聚合酶结合位点，在启动子附近常有其他调节序列(多为抑制性)，这些序列和启动子有明显区别。真核基因转录还有其他特点，例如转录单位一般含有1个基因(即单顺反子monocistron)，而典型
18、的原核转录单位为多顺反子(polycistron)。 真核基因转录调节的共同模式是以正调节为主，通常由某些组织特异的转录因子激活1个或1组含有共同靶序列的启动子，所以转录因子是调节蛋白的主要类型。对启动子进行特异的抑制性调节(负调节)的例子不多。 二、真核RNA聚合酶 3种真核RNA聚合酶在核中的位置不同，其各自的功能不同，但它们的核心亚基都和E.coli的RNA聚合酶的核心酶有同源关系。 RNA聚合酶I存在于核仁中，它的活性最为突出(相对活性5070)，它的转录产物rRNA占细胞总RNA的绝大部分。它对鹅膏蕈碱(-amanitin，1种二环八肽)不敏感。RNA聚合酶位于核质，其相对活性为20
19、40，主要转录产物为mRNA的前体-核内不均一RNA(hnRNA)。此外，它还转录4种小分子RNA(snRNA)，它们参与mRNA前体的剪接加工。不同生物来源的RNA聚合酶可以被低浓度的-amanitin迅速抑制。 RNA聚合酶也存在于核质，其相对活性仅为10左右。它合成tRNA，5SrRNA和一些稳定的小分子RNA，其中包括一种参与mRNA前体剪接的snRNA(U6)，还有参与将蛋白质运送到内质网的信号识别颗粒(SRP)中的7S RNA。动物细胞的RNA聚合酶被高浓度的-amanitin所抑制，但在酵母和昆虫细胞中不被抑制，所以它对-amanitin的敏感性有种属特异性。 这3种真核RNA聚
20、合酶不仅分子巨大(500Kd以上)，而且比E.coli的RNA聚合酶复杂得多，它们都含有两个大亚基和1215个小亚基。 啤酒酵母编码RNA聚合酶的基因绝大多数己克隆和测序，从不同真核生物核中获得的3种RNA聚合酶都非常类似于酵母的RNA聚合酶，其基因同源程度很高。所有三种真核RNA聚合酶的核心亚基的氨基酸顺序和E.coli的RNA聚合酶的核心酶 (2)同源，而且它们的最大的两个亚基分别和Ecoli的及亚基相似。显然，细菌和真核的RNA聚合酶有共同的起源。真核RNA聚合酶最大的亚基C端都含有若干七肽重复顺序(TyrSerProThrSerProSer)，这一序列叫作C端结构域(CTD)。C端结构
21、域(CTD)在酵母和果蝇中分别重复26次和40次，在哺乳动物中重复52次。在真核mRNA前体合成开始时，CTD中的Ser或Thr被磷酸化，并参与转录起始反应。CTD的存在对于细胞的存活必不可少，酵母至少需要10个拷贝的CTD才能成活。三种真核RNA聚合酶第二大的亚基氨基酸顺序也有相似性，它们都和E.coli的RNA聚合酶的亚基相似。此外，酵母RNA聚合酶I和都含有亚基AC40和ACl9，这两个较小的亚基和E.coliRNA聚合酶的亚基同源。而酵母RNA聚合酶含有两个相同的亚基 B44，它和E.coli的亚基的氨基酸顺序的相似性要差一些。不同来源的原核和真核RNA聚合酶核心亚基氨基酸顺序的广泛的
22、同源性，说明这个酶起源于进化早期，并且具有极大的保守性。 除了和E.coli的、和亚基同源的核心亚基以外，所有3种真核RNA聚合酶还含有 5种共同的小亚基，其中最大者为两个拷贝，其余均为1个拷贝。另外，每种真核RNA聚合酶还有47个特异的亚基。RNA聚合酶中这么多的亚基究竟有什么功能，目前尚不清楚。但基因剔除(gene knockout)实验结果提示，酵母RNA聚合酶中的绝大多数亚基是细胞存活所必需的所以，对于真核RNA聚合酶的正常功能来说，它的每个亚基都必不可少。 线粒体和叶绿体中的RNA聚合酶活性较低，它们和细菌RNA聚合酶相似，而和真核的三种RNA聚合酶都不同。 第三节 调节真核基因转录
23、的顺式作用元件 Alberts等用“基因调控区”(gene control region)这一术语，描述基因转录起始必需的DNA序列，以及那些调节转录起始速度的序列。基因调控区主要由两种序列组成：一是启动子，即转录因子和RNA聚合酶结合区，它们组装成转录复合物；二是调节序列(regulatory sequences)，即基因调节蛋白结合区，它们调节转录复合物的组装及转录速度。 转录因子类型不多但数量较大；而基因调节蛋白的种类数以千计，常常因基因不同而异，但每种调节蛋白的含量往往很低。 绝大多数基因调节蛋白结合于增强子并促进转录，但某些阻遏蛋白起负调节作用。负调控序列元件沉寂子(silencer
24、)对于基因的特异选择性表达十分重要。一、RNA聚合酶的启动子典型的RNA聚合酶的启动子由以下两个区域组成：1 核心启动子(core promoter)包括TATA盒和起始子(initiator，Inr)，在这一区域RNA聚合酶结合基本转录因子，并围绕转录起点形成起始复合物。2 启动子近侧序列元件(PSE) 位于核心启动子上游大约 100bp(有时远一些)，如GC盒、CAAT盒和OCT(8聚体)等短序列元件，它们结合上游因子和可诱导因子，决定启动子的转录效率和特异性。这一类序列元件对转录的时间或空间特异性可能十分重要。 二、核心启动子(core promoter):TATA盒和起始子在迅速转录的
25、基因启动子中，都存在1个高度保守的序列TATA盒，位于转录起始位点上游大约2535bp。有人研究了含有TATA盒的60个脊椎动物编码蛋白质的基因启动子，发现TATA盒由6个非常保守的碱基TATA(AT)A组成，并因此而得名(图 1310A)。TATA盒发生点突变将使转录水平急剧下降。如果TATA盒和转录起点之间的距离改变，对转录速度一般不会造成明显影响；如果这些间隔序列缺失，那么转录将在TATA盒下游约25bp的新位点重新开始。TATA盒是很多真核蛋白质基因启动子的关键组分，其作用类似于原核基因启动子，它不仅使RNA聚合酶能够起始转录，而且对于保证转录在固定位点开始转录起关键作用。TATA盒序
26、列几乎和细菌启动子的-10区相同，但位置不同。有的真核蛋白质编码基因启动子没有TATA盒，它们使用另1种启动子元件起始子 (1nr)。Inr位于转录起点附近。绝大多数Inr在一1和十1两个位点的核苷酸序列为CA。直接围绕着转录起点的核苷酸序列决定 Inr启动子的强弱。起始子共有序列的特点是具有简并性(degenaracy)。Inr对于转录始于固定位点也起关键作用。在腺病毒主要晚期启动子中，典型的TATA盒和Inr同时存在并同时起作用。很多基因的启动子没有TATA盒或Inr，它们的转录起始于多个可能的位点中的任何1个，其范围经常延伸于20200bp长的范围以内，造成转录产生的mRNA具有多个选择
27、性5端。这些基因通常低水平转录，例如参与细胞物质中间代谢(三大代谢)的各种酶的基因。 三、启动子近侧元件 核心启动子上游100200bp范围内有1个转录调控区，叫作启动子近侧元件 (promoter proximal sequence elements，PSE)，这些元件常常表现出细胞类型特异性。人珠蛋白基因转录起点上游 100bp的启动子区域中，三个短序列元件中的突变导致转录水平明显下降，其中心分别位于-30、-75、-90，后两个上游元件对转录水平的影响更大。这三个元件分别是TATA盒(-30)，CAAT盒(-75)和GC盒(-90)。TATA盒突变并没有阻止转录起始，但转录起点的位置改变
28、了，证明 TATA盒对转录起点定位起关键作用。CAAT盒的名称也来自其共有序列，它是真核基因中最常见PSE元件之一，一般位于-80附近。CAAT盒的1个特点是它的功能和方向无关，这一点类似于增强子。这个元件对于启动子的转录效率十分重要，但与启动子的特异性没有直接关系，它的存在加强了启动子的转录能力。GC盒也是比较常见的PSE元件，经常以多拷贝出现，其共有序列为GGGCGG，它的功能也和序列方向无关。GC盒一般在转录起始区上游100200bp处，长2050bp，富含GC的序列元件。 在脊椎动物DNA中，富CG区呈特征性非随机分布，人们常称之为“CpG岛” (CpG islands),如果在克隆的
29、DNA片段中发现CpG岛，就提示这个片段中可能含有转录起始区。 除了GC盒和CAAT盒以外，常见的PSE元件还有核苷酸八聚体(Octamer，OCT)(图 1312)。这个8bp长的序列元件以不同的拷贝数、不同的位置和不同的方向出现于许多真核基因启动子中。以上介绍的两种核心启动子元件(TATA盒和Inr)以及三种常见的PSE元件(GC盒、 CAAT盒、OCT)，都是长短小于10bp的短序列，其中没有1种元件是所有的基因启动子所共有的。这些启动子顺式作用元件的功能不同:TATA盒和Inr主要决定转录起点的位置，它们只能引起相当低水平的转录。而PSE元件则影响转录起始的频率，它们很可能通过上游转录
30、因子直接作用于基本转录因子，以增强后者组装起始复合物的能力。真核基因几个PSE元件之间的间隔序列并不重要，改变1030bp距离通常不会影响其功能，但不能超过一定限度。这些PSE元件的序列十分简单，然而识别并结合这些元件的上游因子之间的相互作用相当复杂。令人迷惑不解的是，究竟这些启动子元件是如何传达转录方向信息的?转录向下游方向进行，但GC盒等PSE元件的功能却与序列方向无关，尽管它们的序列本身是非对称的。增强子调节RNA聚合酶的转录作用比较常见，它和RNA聚合酶I的启动子连接起来也能起作用。增强子(enhancer)序列可以远距离(50Kb)增强转录起始，其位点在转录起点上游或下游均可，且与本
31、身序列的方向无关。增强子序列类似于启动子，也由长短不同的标准元件组成，但这些元件通常相邻。值得注意的是，增强子通常和组织特异表达或时间调节表达的基因转录有关。增强子中的元件序列的作用和启动子中的元件相似。增强子和启动子之间的DNA序列通过折叠或回折，可以使结合于增强子的蛋白因子和结合于启动子的因子之间相互作用，所以增强子可以远距离影响启动子的转录起始。 小结多细胞真核生物(包括脊椎动物、无脊椎动物和植物等)的mRNA的转录起点在第1个外显子的第1个核苷酸加帽位点(Cap site)。哺乳动物基因(特别是表达水平较高者)的核心启动子经常含有TATA盒，它通常位于Cap位点上游2530bp，主要作用是指导RNA聚合酶在一定的起点开始转录。有的哺乳动物基因的核心启动子为起始子Inr。在核心启动子上游通常还有一个或多个启动子近侧元件(PSE)，例如GC盒、CAAT盒和OCT等，它们一般位于Cap位点下游大约200bp范围之内，其功能主要是提高转录效率和特异性。哺乳动物基因调控区除了以上两种启动子序列元件以外，还有调节序列。基因调控区经常有增强子序列，其长度一般为100200bp，距离Cap位点常有几个Kb(最远可达50Kb)，它们可能出现于Cap位
