1、主管检验技师临床化学讲义第五章诊断酶学诊断酶学考纲要求1.血清酶熟练掌握（1）分类、生理变异与病理生理机制（2）酶活性与酶质量测定方法及其评价（3）同工酶及其亚型测定的临床意义2.常用血清酶及同工酶测定的参考值及临床意义掌握（1）肌酸激酶及同工酶和其亚型（2）乳酸脱氢酶及同工酶（3）氨基转移酶及同工酶（4）碱性磷酸酶及同工酶（5）-谷氨酰基转移酶及同工酶（6）淀粉酶及同工酶（7）酸性磷酸酶及同工酶3.酶促反应动力学熟练掌握（1）酶促反应（2）酶活性浓度测定方法一、血清酶（一）血清酶的分类（二）血清酶生理变异及其病理生理机制（三）酶活性和质量测定方法及其评价（四）酶活力测定的影响因素（五）工具酶
2、（六）标本采集要点及酶活性表示法（七）同工酶和亚型测定的临床意义（一）血清酶的分类：根据酶的来源及其在血清中发挥催化功能的情况，可将血清酶分为两大类。1.血浆特异酶在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、纤溶酶、胆碱酯酶（CHE）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。它们大多在肝内合成，在血浆中的浓度甚至超过器官细胞内浓度。有的以酶原状态分泌入血，在一定的条件下被激活，引起相应的生理或病理变化,有的可以作为肝功能试验的一部分。血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能外，还反映来源器官的功能。2.非血浆特异酶：在血浆中浓度很低，且无功能，又可分为两种。（1）分泌酶：指来源于外分泌腺的酶。如-淀粉酶（AMY）
3、、前列腺酸性磷酸酶（ACP）、脂肪酶（LPS）、胃蛋白酶原、胰蛋白酶原、ALP等。在血液中的浓度和其分泌腺体的功能活动和疾病有关，来源增加或排泄受阻时，血浆中此类酶活性增高。例如，急性胰腺炎时，血淀粉酶就会升高。（2）代谢酶：（细胞酶）在细胞内发挥催化功能的酶。正常时这些酶存在于组织细胞中，随细胞的不断更新和破坏经常释出极少量进入血液，血浆中酶活性很低。细胞内、外浓度差异悬殊。当酶来源的组织细胞发生病变，细胞内酶大量进入血浆，导致血浆酶活性显著增高。下降的临床意义很少,这一类酶临床应用较多，如转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶等，它们在肝病、心脏疾病时都可能出现变化。（二）血清酶生理变异及其病理生理
4、机制1.生理变异：（1）性别：CK和GGT都是男性高于女性，因此不能以一个参考值作为判断标准。（2）年龄：如新生儿的CK和LD活性常为成人的23倍，ALP和GGT到老年时可能有轻度升高。（3）进食：酗酒可引起GGT明显升高。（4）运动：剧烈运动可引起血清中多种酶升高，如CK、LD、AST等。（5）妊娠与分娩时ALP（因有胎盘ALP同工酶）升高，分娩时可能有CK、CK-BB、LD升高。2.血清酶病理改变机制：疾病时，影响血清酶的因素很多，主要机制如下：（1）酶合成异常：血浆特异酶大多数是在肝合成，当肝功能障碍时酶浓度常下降。肝功能障碍胆碱酯酶活性下降。肝-豆状核综合征铜氧化酶活性可明显下降。骨细
5、胞增生时，血中ALP可上升。（2）细胞酶的释放：是疾病时大多数血清酶增高的主要机制，影响细胞酶释放的主要原因有：1）细胞内、外酶浓度的差异：非血浆特异的酶在细胞内、外浓度可差千倍以上，少量细胞受损伤，就可使血液中酶明显升高。2）酶在细胞内的定位和存在的形式：胞质中游离的酶如ALT、LD最容易释放入血，线粒体酶较难释放如AST。3）酶蛋白分子量的大小：酶释放的速度和分子量成反比，此因素对酶在血液出现时间的影响大于对酶浓度高低的影响。酶的组织分布对细胞酶的释放也有影响。（3）酶在细胞外间隙的分布和运送：细胞中酶有三种途径进入血液。1）血管内皮细胞和血细胞的酶直接进入血液；2）酶可同时进入血液和组织
6、间隙，后者再入血；3）酶大部分进入组织间隙后再入血。这些因素都会影响酶进入血液的时间和升高的程度。（4）血液中酶的清除：不同疾病和不同的酶从血液中清除的时间和机制不同，同一疾病不同酶恢复正常的时间也不一样，这和酶的半寿期以及一些其他因素有关。（三）酶活性和质量测定方法及其评价酶测定包括酶量测定和酶活性测定。酶在体液中含量极微，因此临床上大都采用酶活性测定，以酶活性间接表示酶量。酶活性的概念：酶活性指酶催化反应的能力即酶促反应速度。反应速度是指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。1.酶活性测定方法（2）按监测方法分类法分光光度法旋光法荧光法电化学方法化学反应法核素测定法量热法2.酶
7、质量测定法：利用酶的抗原性，通过抗原、抗体反应来直接测定酶的质量，直接用质量单位ng/ml、g/L来表示酶含量的高低。免疫学方法与测定活性方法相比，其优点是灵敏度和特异性高，不受体液中其他物质的影响，特别是抑制剂和激活剂的影响。（四）酶活力测定的影响因素（酶反应动力学）影响酶活性的因素包括底物的浓度、酶浓度、酶反应的最适pH、最适温度、酶的激活剂、抑制作用，另外还包括试剂中表面活性剂的作用等因素。1.反应速度：大多数酶促反应是可逆反应，其速度既受底物浓度的影响，也受产物生成量的影响。酶反应动力学中所指速度是反应的初速度。当底物浓度较高时，在反应的初期，其浓度变化甚微，产物生成量也很少，此时反应
8、速度可看作是恒定的。2.底物浓度：米氏方程是反映酶促反应速度与底物浓度关系的方程式：S：底物浓度。V：不同S时的反应速度。Vmax：最大反应速度。Km：米氏常数。Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数之一，只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。不同的酶，Km值不同。同一个酶有几种底物时，则对每一种底物各有一特定的Km值，其中Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。3.测定酶活力时需注意：（1）酶促反应过程中，要用初速度表示酶促反应速度。（2）要规定时间、温度、pH等反应条件，并在酶测定过程中保持这些反应条件的恒定。（3）配制的底物浓度应准确且足够大，底物
9、液中应加入不抑制该酶活力的防腐剂并保存于冰箱中，以防止物被分解。（4）标本要新鲜，应保存于冰箱中。用血浆时，应考虑到抗凝剂对酶反应的影响。在采血、分离血清时，应注意防止溶血和白细胞的破裂。（5）在测定过程中，所用仪器应绝对清洁，不应含有酶的抑制物，如酸、碱及蛋白沉淀剂等。（五）工具酶作为试剂用于测定化合物浓度或酶活力的酶称为工具酶。对于底物或产物不能直接测定或难于准确测定的酶促反应，采用酶耦联法测定。A：底物B：待测酶产物（不能直接测定）C：指示酶产物（可以直接测定）Ex：待测酶Ei：代表指示酶（工具酶）最简单的酶耦联反应1.NAD（P）或NAD（P）H偶联的脱氢酶及其指示反应。谷氨酸脱氢酶（
10、GLD）以NAD或NADP或其还原型为辅酶。6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）NADP或其还原型为辅酶。基本反应340nm监测吸光度变化。2.偶联H2O2的工具酶及其指示反应：有些酶作用于底物时，可使其氧化产生H2O2，后者在POD的作用下使色素原氧化显色进行测定。（1）使单一的色素原显色：色素原是一种无色的色素前身，在过氧化物酶（POD）存在下被H2O2氧化后可生成有色的色素。如邻联茴香胺（ODA）。（2）使成对的色素原显色：必须有两个色素原共同存在，再在过氧化物酶（POD）的催化下生成色素。如酚和4氨基安替比林作用，生成红色色素。（3）发光反应：H2O2也可用化学发光反应来监测。（六）标
11、本采集要点及酶活性表示法1.部分分析前因素对酶活性测定的干扰1）溶血：部分酶在红细胞膜或红细胞内的浓度远高于细胞外，少量红细胞的破坏就可能引起血清中酶明显升高。2）抗凝剂：有些抗凝剂是金属螯合剂，可以抑制需要金属离子的酶。如草酸盐、柠檬酸盐和EDTA等可抑制需Ca2+的AMY，也可抑制需Mg2+的CK，草酸盐可以抑制催化氧化还原的酶，EDTA还能抑制ALP，这些抗凝剂分离的血浆一般不宜做酶活性测定。肝素可使7-GT升高，使AMY下降，需加注意。3）标本储存温度：血清白蛋白对酶蛋白有稳定作用，如无细菌污染，某些酶（如AST、7-GT和ALP等）存在于白蛋白中可在室温保存13天，而对活性影响不大。
12、有些酶极不稳定，如血清前列腺ACP，在37放置1小时，活性可下降50%。大部分酶在低温中可稳定较长时间，标本如在离体后不能及时测定，应及时分离血清或血浆并置于冰箱冷藏。2.标本采集要点：酶测定之前，标本要经过采集、分离血清和贮存等过程，酶在血中是处于动态变化过程，血液离体内后，会有一定变化。其中任何一个阶段处理不当，都有可能引起测定值变化。1.不能溶血：因大多数酶在血细胞中的含量比在血浆中高得多。如LDH高150倍，ALT高7倍。2.及时分离血细胞：防止血细胞内酶大量进入血浆；采血后12小时实验室必须及时离心，分离血清。3.及时测定：防止酶蛋白变性，分离血清如不能及时测定，应放冰箱保存。4.尽
13、量用血清标本：防止某些抗凝剂对酶的抑制作用（除非测定与凝血或纤溶有关的酶）。5.有些标本不能冷冻：有的酶在低温下不稳定。有些酶如LD在融冻时被破坏，LD在低温反而不如室温稳定，即所谓的“冷变性”。3.酶活性表示法：酶活性的大小通常以酶单位数表示。酶的国际单位在实验规定的条件下（温度、最适pH、最适底物浓度时），在1分钟内催化1mol底物发生反应所需的酶量为1个酶活力国际单位（U）。能够真正代表酶活性大小的酶促反应初速度。（七）同工酶和亚型测定的临床意义1.概述同工酶是指其分子组成及理化性质不同但具有相同催化功能的一组酶。同工酶是一个酶族，可以根据同工酶的差异用各种物理、化学方法将其分离测定。同
14、工酶的结构差异可引起酶蛋白抗原性的变化，现在利用免疫原理来测定同工酶的方法有了很大发展。2.分布特点：（1）明显的组织器官特异性；（2）细胞内定位不同；（3）有些同工酶在不同发育阶段类型不同。3.临床应用：同工酶的检测比单测总酶活性有更高的灵敏度和特异性。（1）可根据同工酶的变化来推测受损的组织或器官。心肌有损伤时虽然可有总LD活性上升，但诊断意义不大，如果LD1活性上升，且LD1LD2则说明有心肌疾病。（2）可判断某些疾病的程度和预后用的较多的是线粒体AST，此酶较难进入血清，但当肝病变严重、细胞坏死时，线粒体同工酶可进入血中使其升高，对判断疾病的程度和预后都有帮助。同工酶亚型：有些同工酶在
15、从组织进入体液后，可进一步分化为几个不同的类型，即同工酶亚型。CK-MB的亚型有MB1、MB2，CK-MM的亚型有MM1、MM2、MM3。这些亚型对心肌梗死的诊断和溶栓效果的判断都优于CK-总酶和同工酶。【习题】下列哪种酶是血浆特异酶A.胆碱酯酶B.脂肪酶C.转氨酶D.乳酸脱氢酶E.淀粉酶正确答案A答案解析胆碱酯酶是血浆特异酶。【习题】细胞酶的释放量不受下列哪个因素的影响A.各种酶的测定波长及反应速率B.细胞内外酶浓度的差异C.酶的相对分子量D.酶的组织分布E.酶在细胞内的定位和存在形式正确答案A答案解析细胞酶的释放量与测定波长无关。【习题】酶的一个国际单位的含义是A.每秒钟能催化1mol底物
16、的酶量B.每分钟能催化1mol底物的酶量C.每秒钟能催化1mmol的底物的酶量D.每分钟能催化1mol的底物的酶量E.每秒钟能催化1mol底物的酶量正确答案B答案解析酶的一个国际单位的含义是每分钟能催化1mol底物的酶量。【习题】以NAD还原成NADH反应为基础的生化分析，采用的波长及吸光度变化为A.340nm从小到大B.340nm从大到小C.405nm从小到大D.405nm从大到小E.280nm从小到大正确答案A答案解析NAD还原成NADH反应采用的波长及吸光度变化340nm从小到大。 二、常用血清酶和同工酶测定的临床意义1.连续监测法测定血清肌酸激酶（CK）2.连续监测法测定乳酸脱氢酶（L
17、D）总活性3.连续监测法测定血清（天）门冬氨酸氨基转移酶（AST）4.连续监测法测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）5.连续监测法测定血清碱性磷酸酶（ALP）6.连续监测法测定血清中谷氨酰基转移酶（GGT）7.淀粉酶（AMY）测定8.比色法测定酸性磷酸酶（ACP）（一）连续监测法测定血清肌酸激酶（CK）CK是由两种不同的亚基M和B组成的二聚体。正常人体中有三种同工酶，即CK-BB（CK1）、CK-MB（CK2）和CK-MM（CK3）。CK作用后生成的磷酸肌酸含高能磷酸键，是肌肉收缩时能量的直接来源。CK需要镁离子激活。1.原理酶耦联反应测定CK活性浓度。在340nm监测NAD（P）H的生成量，可
18、计算出CK的活性浓度。2.生理变异年龄、性别和种族对CK含量都有一定影响。CK含量和肌肉运动密切相关。3.参考值：男性38174U/L（37）；女性26140U/L（37）。3.临床意义升高：（1）心肌梗死心肌梗死发生后24h此酶即开始升高，1248h达最高峰值，可高达正常上限的1012倍，在24天降至正常水平。（2）病毒性心肌炎。（3）肌营养不良症、皮肌炎、骨骼肌损伤。（4）脑血管意外、脑膜炎、甲状腺功能低下等疾病及一些非疾病因素如剧烈运动、各种插管及手术、肌肉注射冬眠灵和抗生素。降低：甲亢，长久卧床者总CK（主要为CK-MM）可下降。4.CK同工酶检测原理及临床意义CK是由两种不同的亚基M
19、和B组成的二聚体，正常人体中有三种同工酶：CK-BB（CK1）（脑型）：主要存于脑组织、前列腺、肠、肺、膀胱、子宫、胎盘及甲状腺中；CK-MB（CK2）：主要存于心肌；CK-MM（CK3）（肌型）：主要存于肌肉组织。在细胞线粒体内还有另一种CK同工酶，称为CK-Mt。（1）检测方法：琼脂糖凝胶电泳法CK同工酶免疫特性和电泳迁移率各不相同，在电泳时，CK-BB迁移最快，走在阳极白蛋白区，CK-MB居中，位于2和球蛋白区，CK-MM最慢，位于阴极-球蛋白区，CK-Mt迁移率最低，位于CK-MM之后。电泳后进行酶促反应显色，观察结果。（2）临床意义：正常血清中绝大部分为CK-MM的活性，含有少量的C
20、K-MB，CK-BB含量极少，用一般方法测不出。CK同工酶活性的变化见于以下情况。1）CK-MB是目前公认的诊断急性心肌梗死最有价值的生化指标。2）肌营养不良：肌肉创伤、皮肌炎患者CK-MM明显增高。3）心肌梗死以外的心脏疾患有时也可有血清CK-MB的轻度升高。常见疾病的血清总CK和CK同工酶变化疾病总CKCK同工酶急性心肌梗死常用酶中升高最早（48h），24h达峰值，23d恢复正常，中度升高确诊心梗试验之一，大于总酶的6%有意义，23d恢复正常心肌炎肌肉损伤（挫伤、手术、肌注、剧烈运动等）急性期轻度升高，可达5倍正常上限。升高程度和损伤程度相关，严重者可达10000U/L以上，肌注仅轻度升高
21、，一日内恢复正常CKMB可增高，CKMM升高为主，CK-MB/CK活性比6%多发性肌炎和肌炎明显升高主要为CK-MM神经性肌肉疾患正常无变化脑血管意外（脑出血，脑血栓）部分患者血液和CSF中CK升高CK-BB甲状腺功能低下可高达正常上限50倍主要为CK-MM运动试验可轻度升高CKMB正常恶性肿瘤（通常见于前列腺癌、小细胞肺癌、消化道癌）不定CKBB轻度升高（二）连续监测法测定乳酸脱氢酶（LD）总活性乳酸脱氢酶是一种含锌的氧化还原酶类，人体以心、肾、骨骼肌含量最丰富，其次为肝、脾、胰及肺组织含量亦较多。1.原理：340nm处吸光度的增加速率与样品中LD活性成正比。2.生理变异：血清LD高低和性别
22、关系不大，婴儿酶活性可达成年人两倍，儿童和少年活性比成年人高10%l5%。3.参考值血清LD：109245U/L（成人）。4.临床意义血清LD活性增高主要见于心肌梗死、肝病、肺梗死、恶性肿瘤、白血病、恶性淋巴瘤等的辅助诊断。某些肿瘤转移后所致的胸、腹水中LD活性往往也升高。5.LD同工酶检测原理及临床意义LD是由H亚基和M亚基构成的四聚体，不同的组合方式构成五种同工酶。1）方法琼脂糖电泳法血清LD同工酶目前常用琼脂糖凝胶电泳法测定。2）临床意义LD同工酶在组织中的分布可将其分为三类。以心肌为代表，主要含LD1，活性占该组织的一半以上，肾、胰、膈肌与红细胞次之；以肝脏为代表，含LD5为主，其占该
23、组织总活性的50%以上，皮肤、骨髓、关节滑液、白细胞、血小板次之；以肺、脾为代表，含LD3为主，脑、肠、淋巴结与内分泌腺等次之。在成年人存在着如下规律：LD2LD1LD3LD4LD5急性心肌梗死发作后早期，LD1升高更早更明显，可致LD1/LD2比值增高。活动性心肌炎、急性病毒性心肌炎及某些溶血性疾病，肾坏死、假性肥大性肌营养不良等，LD1及LD2的活性也升高。当急性肺部病变、白血病、胶原病、心包炎、病毒感染等LD2及LD3增高。而恶性病时，LD3也常增高。肝炎、急性肝细胞损害及骨骼肌损伤时LD5常常增高。而当心肌梗死并发充血性心力衰竭时，LD5也可升高。常见疾病LD总酶和LD同工酶的变化疾病
24、LD总酶LD同工酶心肌梗死升高最慢（810d）升高时间长（510d）可高于正常上限10倍LD1LD2，可持续两周充血性心衰，心肌炎可高于正常上限5倍LD1LD2病毒性肝炎部分患者可高于正常上限5倍LD5LD4肝硬化轻度升高LD明显升高，LD5LD4原发性肝癌部分病例升高同上梗阻性黄疸不定常LD4LD5肌肉损伤视损伤程度而异以LD5升高为主恶性肿瘤可增高以LD3为主，LD3LD1（三）连续监测法测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）ALT和AST是体内最重要的两种转氨酶，辅酶是磷酸吡哆醛。AST有两种同工酶，分别存在于细胞质（c-AST）和线粒体（m-AST），ALT绝大多数在细胞质内，可能有极少量
25、在线粒体中。ALT和AST在于体内多种器官和组织中，以含量从多到少为序：AST为心脏、肝、骨骼肌和肾等；ALT为肝、肾、心、骨骼肌等。1.原理：采用酶偶联反应在340nm处连续监测吸光度下降速率，从而计算出ALT活性浓度。2.生理变异：此酶生理变异较小，无统计学意义。3.参考值：成人40U/L。4.临床意义：ALT常作为判断肝细胞损伤的灵敏指标，轻度损伤即升高，肝病早期诊断。但其他疾病或因素亦会引起ALT不同程度的增高。（1）急性病毒性肝炎ALT阳性率为80%100%，最高可达500U以上，多为ALTAST。监测ALT可以观察病情的发展，并作预后判断。（2）慢性活动性肝炎或脂肪肝ALT轻度增高
26、（100200U），或属正常范围，且ASTALT。（3）肝硬化、肝癌ALT有轻度或中度增高，提示可能并发肝细胞坏死，预后严重。（4）其他原因引起的肝脏损害，如心功能不全时，肝淤血可使ALT、AST明显升高：某些化学药物如异烟肼、氯丙嗪、苯巴比妥等可不同程度的损害肝细胞，引起ALT的升高。（5）骨骼肌损伤、多发性肌炎等亦可引起转氨酶升高。应注意两种情况：重症肝炎由于大量肝细胞坏死，此时血中ALT可仅轻度增高，临终时常明显下降，但胆红素却进行性升高，即所谓的“酶胆分离”，常是肝坏死征兆。另一种情况是少数入血清中ALT长期持续升高，肝穿无明显病理改变，预后良好。应注意两种情况：（四）连续监测法测定血
27、清（天）门冬氨酸氨基转移酶（AST）1.原理：基质是门冬氨酸与酮戊二酸。在340nm处监测吸光度的下降速率，从而计算AST活性。2.生理变异：此酶生理变异较小。3.参考值：成人45U/L。4.临床意义主要用于诊断AMI；AST也是肝炎患者的观察指标，且AST/ALT比值对判断肝炎的转归特别有价值；-AST在判断肝实质细胞损害程度、急慢性肝炎的鉴别有一定价值。常见疾病ALT和AST及其同工酶的变化疾病ALTASTAST/ALT急性病毒性肝炎明显升高，随病情而异可达正常上限10100倍同ALT，较ALT轻且恢复早1.0与肝硬化鉴别重症肝炎升高正常上限20倍内，有酶胆分离现象升高超过ALT1.0肝硬
28、化常轻度增高升高超过ALT1.0梗阻性黄疸轻度升高同ALT常1.0溶血性黄疸无变化无变化心肌梗死轻度升高明显升高，与CK和LD比较，无优点1.0肌肉损伤正常或轻度升高急性期可轻度升高1.0（五）连续监测法测定血清碱性磷酸酶（ALP）ALP指一组底物特异性较低，在碱性环境中（最适pH10左右）能水解很多磷酸单酯化合物的酶。ALP广泛存在各器官组织中，含量以肝为最多，其次为肾、胎盘、小肠、骨等，妊娠时胎盘产生胎盘ALP。一般认为骨中的ALP和骨的钙化作用关系密切。血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼。1.原理：磷酸苯二钠比色法：测定ALP水解底物产生的酚。磷酸苯二钠做底物经ALP作用后产生黄色的对硝基酚，根据405nm处吸光度增高
